郝志云，王繼卿，羅玉柱，胡 江，劉 秀，李少斌

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/甘肅省草食動物生物技術(shù)重點實驗室/甘肅省牛羊基因改良工程實驗室，蘭州 730070)

Wnts(Wingless-type MMTV integration site family member)是一種分泌蛋白質(zhì)，通過細胞表面受體介導(dǎo)的信號途徑來調(diào)節(jié)生命活動。它主要通過經(jīng)典和非經(jīng)典Wnt途徑發(fā)揮作用，其經(jīng)典途徑主要負責(zé)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子β-連環(huán)蛋白(β-catenin)和亞細胞定位。非經(jīng)典途徑除了激活Wnt/Ca2+信號途徑以外，還通過Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴性(Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ, CamK II)蛋白激酶和蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)影響細胞遷移及細胞黏附，同時依賴細胞極性(planar cell polarity, PCP)途徑，通過激活JNK/ROCK調(diào)控細胞的生命活動。WNT5A(Wnt family member 5A)蛋白是Wnt非經(jīng)典途徑的代表，當(dāng)它與細胞膜受體結(jié)合后，通過WNT、PCP及WNT/Ca2+信號通路將信號傳遞到細胞核內(nèi)，激活下游的信號分子(JNK、CaMK II、PKA等)，進而調(diào)控細胞的生長、形態(tài)變化、骨架重排及極性等過程[1-2]。目前，關(guān)于WNT5A基因的研究主要集中于乳腺形態(tài)發(fā)生、毛囊發(fā)育、乳腺癌、腫瘤等方面。在小鼠乳腺發(fā)育中，WNT5A可以抑制乳腺導(dǎo)管的延伸和側(cè)向分支。Roarty等[3]采用Elvax緩慢遞送法[4]分別在小鼠乳腺脂肪墊中植入WNT5A與WNT5A-/-蛋白顆粒，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，WNT5A-/-的乳腺組織具有較快的發(fā)育能力，主要表現(xiàn)為具有較大的末端芽、伸長的導(dǎo)管和增加的導(dǎo)管分支及其增殖。同時，WNT5A基因也能夠抑制毛囊毛干的生長。李瑤等[5]在鵝胚胎期皮膚中研究發(fā)現(xiàn)，高表達的WNT5A抑制了次級毛囊的發(fā)育。隨著WNT5A表達量的降低，次級毛囊的深度不斷增加。研究還發(fā)現(xiàn)，WNT5A基因調(diào)節(jié)了孕體著床及妊娠期發(fā)育，在孕體滋養(yǎng)外胚層，它以Rho激酶依賴的方式增加了滋養(yǎng)細胞的運動和遷移[6]。然而，在家畜中，WNT5A僅在綿羊孕體著床中有較少研究，其它方面未有相關(guān)報道。

為了深入研究WNT5A基因的結(jié)構(gòu)特征以及在不同組織中的表達情況，本研究以高泌乳量的小尾寒羊和低泌乳量的甘肅高山細毛羊為研究對象，在兩個綿羊品種的泌乳高峰期(產(chǎn)后第21天)，采集心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、卵巢、背最長肌、乳腺和皮膚9個組織，應(yīng)用RT-PCR及生物信息學(xué)方法，克隆了綿羊WNT5A基因的CDS序列，分析核苷酸和氨基酸的序列和結(jié)構(gòu)特征，檢測該基因在乳腺等9個組織中的基因表達規(guī)律，以期為闡明WNT5A基因的生物學(xué)功能提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗樣品采自于甘肅天?？h松山鎮(zhèn)金子河綿羊繁育場。選擇高泌乳量的小尾寒羊和低泌乳量的甘肅高山細毛羊各3只，均為健康無病、體重接近3歲、第4胎。當(dāng)其處于泌乳高峰期(產(chǎn)后第21天)時，屠宰后采集心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、卵巢、背最長肌、乳腺和皮膚各0.5 g左右。組織樣用DEPC水沖洗完后裝入2 mL凍存管，然后立即投入液氮中保存，帶回實驗室后于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

按照Trizol Reagent(Invitrogen, CA, USA)說明書要求，提取組織中的總RNA。提取后的RNA用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，用超微量分光光度計檢測OD260/OD280及其濃度，質(zhì)檢合格的RNA保存于-80 ℃冰柜中備用；根據(jù)Takara公司的PrimeScriptTMRT reagent(with gDNase)說明書要求，對RNA進行反轉(zhuǎn)錄，得到的cDNA稀釋成100 ng/μL溶液，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 WNT5A基因引物設(shè)計及克隆

以普通牛(Bostaurus)的WNT5A基因序列(NM_001205971)作為模板，在綿羊基因組(Oar_v3.1)中進行同源性搜索，根據(jù)相似性最高的序列，設(shè)計引物P1和P2，其中P1用于WNT5A基因CDS區(qū)的克隆，P2引物用于后續(xù)的RT-qPCR分析，β-actin基因作為內(nèi)參引物，引物具體信息見表1。以乳腺組織的cDNA作為模板，采用20 μL反應(yīng)體系擴增綿羊WNT5A基因的CDS區(qū)序列，包括cDNA 0.8 μL(約100 ng/μL)，5 U/μL Taq預(yù)混酶10 μL，0.25 μmol/L上、下游引物各0.8 μL，ddH2O加至20 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min；4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖電泳檢測后,選擇目的條帶進行切膠、純化回收并連接到質(zhì)粒克隆載體pMD19-T上，經(jīng)轉(zhuǎn)化、PCR鑒定后挑取陽性單克隆穿刺培養(yǎng)，送至陜西楊凌天潤奧科生物科技有限公司進行測序。

表1 綿羊WNT5A基因的引物信息Table 1 Primer information for sheep WNT5A gene

1.4 WNT5A生物學(xué)信息學(xué)分析

利用NCBI查找該基因的開放閱讀框(Open Reading Frame, ORF)，并用Blast進行驗證；利用MEGA 5.0構(gòu)建物種進化樹；用ExPasy站點上的ProtParam軟件分析綿羊WNT5A蛋白的理化性質(zhì)；利用NetPhos 2.0(http://cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)預(yù)測WNT5A蛋白的磷酸化位點，利用NetNGlyc(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)預(yù)測WNT5A蛋白的糖基化位點；采用Swiss Model(http://swissmodel.expasy.org)在線進行三維建模，然后用Pymol輸出蛋白質(zhì)模型；利用String在線分析WNT5A蛋白的網(wǎng)絡(luò)互作關(guān)系。

1.5 WNT5A基因的表達量分析

應(yīng)用相對定量SYBR Green I(Takara, Dalian, China)染料法，在Applied Biosystems QuantStudio6 Flex儀(Temerlife, USA)中檢測WNT5A基因的組織表達量。采用20 μL的RT-qPCR體系，包括：cDNA模板2 μL(<100 ng),0.25 μmol/L的上下游引物各0.4 μL、10 μmol/L SYBR qPCR Master Mix 10 μL和RNase-free ddH2O 7.2 μL。RT-qPCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性15 s，59 ℃退火34 s，72 ℃延伸30 s，40個循環(huán)。溶解反應(yīng)：95 ℃變性15 s,60 ℃采集熒光信號60 s。待反應(yīng)結(jié)束后，分析反應(yīng)的熒光定量溶解曲線，判斷是否存在引物二聚體，以及PCR產(chǎn)物的準(zhǔn)確性，收集數(shù)據(jù)，采用2-ΔΔCt法計算表達量[7],利用SPSS 19.0進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 WNT5A基因的克隆

以小尾寒羊的乳腺cDNA為模板，進行RT-PCR擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，發(fā)現(xiàn)目的片段大小跟預(yù)期結(jié)果一致(圖1)。經(jīng)過克隆測序后，獲得完整的CDS區(qū)序列，大小為1 062 bp，編碼353個氨基酸。

圖1 綿羊WNT5A基因CDS區(qū)序列擴增產(chǎn)物檢測結(jié)果M. 1 kb DNA ladder D-1040(Bioneer);1. PCR productFig.1 The results of sequence amplification products of sheep WNT5A gene CDS region

通過Blast分析發(fā)現(xiàn)，克隆獲得的片段序列與山羊的WNT5A具有較高的序列同源性(98.7%)，與普通牛WNT5A之間的同源性為88.96%?；贕enBank中山羊(Caprahircus)、豬(Susscrofa)、普通牛(Bostaurus)、藏羚羊(Pantholopshodgsonii)、大鼠(Rattusnorvegicus)、小鼠(Musmusculus)和人類(Homosapiens)WNT5A的氨基酸序列，結(jié)合本研究獲得的綿羊序列，構(gòu)建了系統(tǒng)進化樹。結(jié)果表明，本研究克隆所得序列首先與山羊的WNT5A序列聚到一支。由此說明，本研究中獲得的序列為綿羊的WNT5A序列(圖2)。

2.2 WNT5A蛋白的理化性質(zhì)

綿羊WNT5A蛋白的原子組成為C1689H2658N494O503S27，分子質(zhì)量為38798.31，等電點為9.02。WNT5A蛋白含有20種氨基酸，其中Ala含量最高(9.6%)，His含量最低(1.7%)。WNT5A的消光系數(shù)在280 nm時為58 870，不穩(wěn)定系數(shù)為43.68，說明該蛋白是一個不穩(wěn)定蛋白。WNT5A在哺乳動物網(wǎng)織紅細胞內(nèi)半衰期為30 h，脂肪系數(shù)為71.36，總平均親水性為-0.283，說明該蛋白是一個疏水蛋白。磷酸化位點預(yù)測發(fā)現(xiàn)該蛋白質(zhì)包含31個磷酸化位點，主要以絲氨酸(19)為主，還有蘇氨酸(6)和酪氨酸(6)磷酸化位點。糖基化位點分析發(fā)現(xiàn)，WNT5A蛋白存在3個N-連接的糖基化修飾位點，分別是第114、120和326位天冬酰胺殘基的酰胺氮原子。

綿羊WNT5A蛋白的二級結(jié)構(gòu)由45.04%(159個)的無規(guī)則卷曲(Coil)、40.79%(144個)的α-螺旋(Helix)、9.63%(34個)的延伸鏈(Extenden strand)和1.53%(16個)的β轉(zhuǎn)角(Turn)組成(圖3)?？傮w來看，該蛋白的二級結(jié)構(gòu)主要以無規(guī)則卷曲和α-螺旋為主，延伸鏈和β轉(zhuǎn)角則貫穿于整個蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中，由此判斷該蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)為混合型。利用Swiss Model軟件分析了WNT5A蛋白的三級結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)該蛋白的三級結(jié)構(gòu)是由α-螺旋、無規(guī)則卷曲、β轉(zhuǎn)角及延伸鏈互相折疊形成的簡單空間構(gòu)象。

圖2 WNT5A氨基酸序列的同源性分析Fig.2 Homology analysis of the amino acid sequence of WNT5A

圖3 WNT5A蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)藍色的線表示α-螺旋，綠色的線表示β-轉(zhuǎn)角，紅色的線表示延伸鏈，淺紅色的線代表無規(guī)則卷曲Fig.3 Spatial structure of WNT5A protein The blue line represents α-helix. The green line represents β-turn, the red grey line represents extended strand and the light grey line represents random coil

蛋白互作分析結(jié)果表明，WNT5A與卷曲蛋白受體(Frizzled, FZD)、低密度脂蛋白相關(guān)蛋白(low density lipoprotein receptor-related protein, LRP)及受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase, RYK)有互作關(guān)系(圖4)。

2.3 WNT5A基因的組織表達特征分析

應(yīng)用RT-qPCR法，檢測了小尾寒羊和甘肅高山細毛羊中WNT5A基因的組織表達情況。結(jié)果表明，WNT5A基因在采集的9個組織中均表達，并且其表達具有組織特異性。在小尾寒羊中，WNT5A基因表達量由高到低的順序依次為：皮膚>心臟>卵巢>乳腺>背最長肌>腎臟>肝臟>肺臟>脾臟；在甘肅高山細毛羊中，WNT5A基因的表達量由高到低的順序依次為：皮膚>心臟>背最長肌>乳腺>肺臟>腎臟>肝臟>脾臟>卵巢。其次WNT5A的表達也呈現(xiàn)出品種特異性，WNT5A在甘肅高山細毛羊皮膚、乳腺、背最長肌、腎臟、肺臟、脾臟和肝臟中的表達量高于小尾寒羊(P<0.05)，在甘肅高山細毛羊卵巢中的表達量低于小尾寒羊(P<0.05)，而在心臟中該基因的表達量無差異(P>0.05)(圖5)。

圖4 綿羊WNT5A蛋白網(wǎng)絡(luò)互作圖Fig. 4 The protein interaction network of WNT5A protein sheep

3 討 論

WNT5A作為非經(jīng)典Wnt信號通路配體之一，在細胞的增殖、凋亡和分化等多個過程中發(fā)揮了重要作用。在WNT5A基因敲除的轉(zhuǎn)基因小鼠中，β-catenin蛋白的表達量明顯增高，表明在機體發(fā)育過程中WNT5A可能通過促進β-catenin的降解，從而>抑制了Wnt/β-catenin信號[8]。本研究采用RT-PCR技術(shù)克隆了WNT5A基因的CDS區(qū)序列，經(jīng)Blast比對后發(fā)現(xiàn)，綿羊的WNT5A序列與山羊的序列具有高度同源性，表明該蛋白具有較高的保守性。綿羊WNT5A包含31個磷酸化位點和3個N-連接的糖基化修飾位點，這與WNT5A在生物體中復(fù)雜的生物學(xué)功能相符。磷酸化是生物體最普遍的修飾方式之一，廣泛存在于生物體內(nèi)的各個方面，WNT5A通過磷酸化作用改變了自身的蛋白結(jié)構(gòu)，進一步引起了自身蛋白質(zhì)活性的變化，從而廣泛參與了細胞增殖、凋亡及分化等過程。N-連接的糖基化修飾是蛋白質(zhì)翻譯后最普遍的修飾方式之一，糖基化修飾對調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性、參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、指導(dǎo)蛋白質(zhì)的正確折疊及運輸?shù)确矫嬗兄匾挠绊慬9]。因此，通過糖基化作用，可以改變WNT5A多肽的構(gòu)象，增加蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，對其發(fā)揮多重的生物學(xué)功能具有重要作用[10]。

圖 5 WNT5A基因在小尾寒羊和甘肅高山細毛羊不同組織中的表達量以小尾寒羊心臟為對照組；不同小寫字母表示同一綿羊群體不同組織間差異顯著(P<0.05)Fig. 5 Expression of WNT5A gene in different tissues of Small-tail Han sheep and Gansu alpine merino sheepSmall-tail Han Sheep heart is the control;different small letters indicate significant difference in different tissues in the same sheep population (P<0.05)

String分析結(jié)果表明，WNT5A蛋白與FZD、LRP及RYK蛋白有互作關(guān)系。在細胞內(nèi)，WNT5A通過與FZD和LRP5/6結(jié)合，激活Wnt非經(jīng)典途徑，致使β-catenin在胞質(zhì)內(nèi)積累，進入核內(nèi)與Tcf/Lef形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，通過激活下游靶基因，調(diào)控了細胞的生命活動[11-12]。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)細胞內(nèi)存在ROR2受體的情況下，WNT5A主要通過糖原合酶激酶3(glycogen synthase kinase 3, GSK3)非依賴性途徑促進β-catenin降解來抑制經(jīng)典Wnt途徑，進而抑制乳導(dǎo)管的發(fā)育及分支[13]。當(dāng)細胞內(nèi)不存在ROR2受體時，它可與RYK受體結(jié)合，能夠增強乳腺上皮生長[14]。

RT-qPCR結(jié)果顯示，WNT5A基因在綿羊的9個組織中廣泛表達，并且具有明顯的組織特異性和品種特異性。WNT5A基因的廣泛表達可能與Wnt的多重生物學(xué)功能有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)Wnt信號通路廣泛參與了機體的發(fā)育及生長過程[15-17,6]。本研究發(fā)現(xiàn)WNT5A基因在皮膚中的表達量最高，這說明Wnt信號通路對毛囊生長和發(fā)育具有至關(guān)重要的作用。Wnt/β-catenin途徑被認(rèn)為是毛囊周期維持不可或缺的通路[18]。在小鼠中，WNT5A基因抑制了次級毛囊生長發(fā)育，拮抗Wnt/β-catenin信號通路[19]。同時，該基因也在綿羊心臟中高度表達。研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠心肌細胞中，WNT5A表達上調(diào)可以促進內(nèi)皮祖細胞向心肌細胞分化[20]，同時WNT5A在心臟中的高表達可能對心肌細胞分化和心臟形成具有重要的作用[15]。另外，WNT5A表達量的高低還與人的心力衰竭有關(guān)[21]。WNT5A在綿羊的肺臟、肝臟、腎臟和脾臟組織中也表達。研究已發(fā)現(xiàn)該基因在小鼠肺臟內(nèi)源性修復(fù)[22]、肝臟創(chuàng)傷修復(fù)[23]、腎臟纖維化[17]和骨髓造血細胞生成等[24]過程中也發(fā)揮了重要作用。

WNT5A的表達也呈現(xiàn)出品種特異性，WNT5A在甘肅高山細毛羊皮膚組織中的表達量高于小尾寒羊(P<0.05)，這可能與兩個品種的毛囊發(fā)育和被毛長度差異有關(guān)。在小鼠毛囊中研究發(fā)現(xiàn)，WNT5A基因的表達量隨著毛囊生長而逐漸增多[25]。由于甘肅高山細毛羊是細毛羊品種，其毛囊的數(shù)量多于粗毛羊的小尾寒羊，造成甘肅高山細毛羊中WNT5A基因的表達量高于小尾寒羊。同時星懿展等[25]采用腺病毒介導(dǎo)方式，對小鼠觸須毛囊進行了體外培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)WNT5A處理組毛囊的毛干伸出長度變短。由于甘肅高山細毛羊成年母羊的被毛長度低于小尾寒羊成年母羊[26]，造成甘肅高山細毛羊中該基因的表達量較高，這也與WNT5A可以抑制毛干生長的結(jié)論相一致[25]。

WNT5A基因在甘肅高山細毛羊乳腺組織中的表達量也高于小尾寒羊(P<0.05)，這與兩個品種間的泌乳量差異有關(guān)。本實驗室前期測定發(fā)現(xiàn)，小尾寒羊具有良好的產(chǎn)奶性能，產(chǎn)后30 d內(nèi)的平均產(chǎn)奶量為1 357 g/d。相比之下，甘肅高山細毛羊同期的產(chǎn)奶量為853 g/d。前人研究已發(fā)現(xiàn)，WNT5A可以抑制乳腺導(dǎo)管的延伸和側(cè)向分支[3]，而乳導(dǎo)管及側(cè)枝的發(fā)育程度與產(chǎn)奶量呈正相關(guān)，因此WNT5A具有抑制泌乳量的作用[27]。WNT5A在小尾寒羊卵巢中的表達量高于甘肅高山細毛羊，這可能與兩個品種間的產(chǎn)羔數(shù)差異有關(guān)。小尾寒羊是著名的多胎多羔品種，其平均產(chǎn)羔率為270%，而甘肅高山細毛羊一般為單胎單羔[28]。研究發(fā)現(xiàn)，WNT5A與孕體著床及妊娠期發(fā)育有關(guān)，子宮內(nèi)膜的WNT5A以旁分泌的方式對孕體滋養(yǎng)外胚層起作用，以通過激活Rho-ROCK途徑激酶的非經(jīng)典Wnt信號通路，增加了滋養(yǎng)細胞的運動和遷移[6]。滋養(yǎng)層細胞主要負責(zé)為胎盤提供血液，以滿足胎兒在生長發(fā)育過程中對氧氣及營養(yǎng)物質(zhì)的需求[29]。因此推測，WNT5A在小尾寒羊卵巢中有較高的表達量是為了保障多羔后代的存活和正常的生長發(fā)育。

WNT5A在甘肅高山細毛羊背最長肌中的表達量高于小尾寒羊，這可能與二者之間的肉質(zhì)嫩度差異相關(guān)。肌纖維主要由快肌纖維和慢肌纖維組成，快肌纖維直徑大于慢肌纖維。研究發(fā)現(xiàn)，有較高慢肌纖維比例和較低快肌纖維比例的肌肉具有較好的嫩度[30-31]。WNT5A/Ca2+與CaMK IIδ偶聯(lián)可以促進肌肉的分化[16]，并在調(diào)控肌纖維類型方面發(fā)揮著重要作用[32]。通過逆轉(zhuǎn)錄病毒W(wǎng)NT5A感染雞胚后，雞翅快肌纖維增加而慢肌纖維減少[33]，說明WNT5A可以導(dǎo)致肌肉嫩度變差。因此推測，高表達的WNT5A導(dǎo)致了甘肅高山細毛羊中快肌纖維增加和肌纖維直徑增大，最終使甘肅高山細毛羊的肌肉嫩度老于小尾寒羊。

4 結(jié) 論

本研究獲得了綿羊WNT5A基因的CDS區(qū)全長序列，它是編碼353個氨基酸的不穩(wěn)定疏水蛋白。該蛋白的二級結(jié)構(gòu)主要以α-螺旋和無規(guī)則卷曲為主，β轉(zhuǎn)角、延伸鏈貫穿于整個蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中。String分析結(jié)果表明，WNT5A與卷曲蛋白受體、低密度脂蛋白相關(guān)蛋白和受體酪氨酸激酶有相互作用。并且WNT5A基因表達具有組織特異性及品種特異性。