張艷勝，胡赟

肺癌屬于我國發(fā)病率最高且臨床最常見的一種癌癥，15%的肺癌患者在就診時已經(jīng)存在胸腔積液，50%左右的患者在疾病發(fā)展過程中也會出現(xiàn)胸腔積液[1-2]，這時患者已經(jīng)錯過了最佳的手術(shù)切除時機，嚴(yán)重影響后期的預(yù)后。所以及早發(fā)現(xiàn)疾病，及時采取有效的治療，對控制疾病發(fā)展，改善患者預(yù)后具有至關(guān)重要的作用[3]。胸水、痰液及支氣管灌洗液等細(xì)胞學(xué)標(biāo)本為疾病確診的關(guān)鍵線索[4-5]。但是目前傳統(tǒng)細(xì)胞學(xué)制片技術(shù)尚不完善，存在諸多的缺點，很難保障診斷的準(zhǔn)確性[6]。為了解決這一問題，本研究以確診肺癌患者的胸水標(biāo)本為研究對象，探討細(xì)胞蠟塊聯(lián)合免疫組化技術(shù)在臨床診斷中的應(yīng)用價值，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析2016 年2月至2019 年12 月浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬湖州中醫(yī)院確診的肺癌患者116例，并收集患者的胸水標(biāo)本，男76例，女40 例；年齡29 ～86 歲，平均（54.0±10.6）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）入院后均接受活檢病理診斷確診為肺癌；（2）簽署知情同意書。排除：（1）臨床資料不完整；（2）合并嚴(yán)重呼吸系統(tǒng)疾病；（3）合并嚴(yán)重心腦血管疾病者。

1.2 方法 對116 例胸水標(biāo)本分別采用薄層液基細(xì)胞學(xué)沉降式制片技術(shù)和制備成細(xì)胞蠟塊后結(jié)合免疫組化染色技術(shù)進(jìn)行檢查。

1.2.1 薄層液基細(xì)胞學(xué)沉降式制片 選取100 ml 的新鮮胸水標(biāo)本，將其放置在專用的保存液中，勻速搖晃，確保兩種液體充分混合。之后取50 ml 混合液，采用1 500 r/min 的速度離心，時間5 min，離心后去除上清液，直至約剩余2ml，搖晃均勻。把混勻的標(biāo)本放入制片器中，接著將盛有混勻標(biāo)本的制片器對稱的放入液基細(xì)胞薄層制片機中，采用1000r/min的速度離心，時間3 min，等時間到后取出制片器，拆取玻片，待玻片稍干后將制好的玻片立即放入95%的乙醇中固定10 min。然后依染色程序，蘇木素染色3 min，PBS 返藍(lán)，水洗后放入伊紅染色30s，再經(jīng)由低到高的梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.2.2 細(xì)胞蠟塊聯(lián)合免疫組化染色 將薄層液基細(xì)胞學(xué)沉降式制片后剩余的胸水樣本添加到保存溶液中，靜置在4 ℃冰箱內(nèi)，直到細(xì)胞能夠完全被沉淀，之后將上清液全部除掉，接著加入10 ml 95%的乙醇以2 000 r/min 的速度完成離心，離心時間5 min，靜置30 min，取出沉淀物用棉紙包好放進(jìn)包埋盒，在萊卡脫水機中快速處理3h后進(jìn)行常規(guī)包埋，完成切片。TTF-1、CK7、CK5/6、Ki-67 抗體均購于福州邁新生物技術(shù)有限公司；采用MaxVision法對細(xì)胞蠟塊進(jìn)行免疫組化手工染色。把蠟塊切成均勻3 m 厚度的蠟片，防脫玻片裱片，二甲苯完成脫蠟，行常規(guī)由高到低梯度乙醇水化，蒸餾水水洗后放入已煮開的新鮮配置的1∶50的EDTA液中，不銹鋼鍋蓋不要蓋緊，最小火加熱20 min，時間到后，關(guān)掉電磁爐，令其自然冷卻，接著蒸餾水水洗3 次，3 min/次，放入濃度為3%的H2O2中室溫下孵育時間10min，PBS緩沖液沖洗3 次，3min/次，除去PBS，切片上滴加一抗TTF-1、CK7、CK5/6 及Ki-67，室溫下孵育時間60 min，PBS 緩沖液沖洗3 次，3 min/次，除去PBS，切片上滴加MaxVison-HRP，室溫下孵育時間15min，PBS緩沖液沖洗3 次，3min/次，除去PBS，切片上滴加新鮮配置的DAB顯色試劑顯色時間10min，流水沖洗終止顯色，接著蘇木素染色1 min，PBS 返藍(lán)，由低到高的梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.3 觀察指標(biāo) 以活檢標(biāo)本病理診斷為“金標(biāo)準(zhǔn)”，對比兩種不同制片方法的診斷準(zhǔn)確率及染色效果。

1.4 統(tǒng)計方法 采用SPSS20.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，計數(shù)資料采用2檢驗＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩種不同方法制片的染色效果薄層液基細(xì)胞學(xué)沉降式制片的圖像清晰度高，細(xì)胞均勻，且細(xì)胞形態(tài)良好，但是缺少一定的成團結(jié)構(gòu)和腺樣結(jié)構(gòu)（封四彩圖3）；而細(xì)胞蠟塊結(jié)合免疫組化染色法的圖片染色清晰度高，細(xì)胞數(shù)目多且均勻分布，而且還可以在多數(shù)切片中直觀地觀察到細(xì)胞具體的排列方式和結(jié)構(gòu)（封四彩圖4）。

圖3 薄層液基細(xì)胞學(xué)沉降式制片（HE 染色，×10）

圖4 細(xì)胞蠟塊結(jié)合免疫組化染色制片（免疫組化染色，×10）

2.2 兩種不同方法制片的診斷準(zhǔn)確率比較 細(xì)胞蠟塊結(jié)合免疫組化染色法的準(zhǔn)確率為79.31%（92/116），高于薄層液基細(xì)胞學(xué)沉降式制片的62.07%（72/116）（2=8.32，＜0.05）；在細(xì)胞蠟塊聯(lián)合免疫組化診斷中，腺癌64 例、鱗癌、腺鱗癌、未分化癌及不確定類型分型中，腺癌的準(zhǔn)確率最高（91.43%），8 例肺癌無法分型。見表1。

表1 兩種不同方法制片的診斷準(zhǔn)確率比較 例

3 討論

本研究結(jié)果顯示，采用細(xì)胞蠟塊聯(lián)合免疫組化染色法的診斷準(zhǔn)確率高于薄層液基細(xì)胞學(xué)沉降式制片（＜0.05），這說明細(xì)胞蠟塊與免疫組化染色法聯(lián)合診斷能夠有效檢出細(xì)胞的具體結(jié)構(gòu)，解決傳統(tǒng)檢測技術(shù)存在的缺陷和弊端，提高診斷的準(zhǔn)確率。兩種不同制片方法可以相互補充，提高診斷的準(zhǔn)確率，實現(xiàn)組織學(xué)活檢的目的，為醫(yī)生對腫瘤組織分型、判斷腫瘤的來源及對癥治療提供有力的依據(jù)[7]。對于晚期肺癌患者，體腔積液屬于主要的臨床表現(xiàn)，采用傳統(tǒng)細(xì)胞學(xué)檢查只能為醫(yī)生診斷惡性腫瘤提供有力依據(jù)，無法為醫(yī)生及時發(fā)現(xiàn)原病灶提供數(shù)據(jù)支撐，但是由于細(xì)胞蠟塊組織切片能夠反復(fù)、連續(xù)性的操作，而且采用細(xì)胞蠟塊技術(shù)檢測不會出現(xiàn)細(xì)胞丟失的現(xiàn)象，也能將少數(shù)的惡性細(xì)胞有效檢出，避免出現(xiàn)漏診和誤診[8-9]。

在臨床診斷過程中由于受到腫塊表面壞死，經(jīng)氣管鏡下無法直接觀察到腫塊，難以獲取組織活檢標(biāo)本，并且無法對組織標(biāo)本的病理組織進(jìn)行分型，不利于后期的診斷和治療。采用細(xì)胞蠟塊聯(lián)合免疫組化染色可有效解決該難題，提高診斷的準(zhǔn)確率，為后期治療提供有力依據(jù)。所以在傳統(tǒng)診斷技術(shù)的基礎(chǔ)上聯(lián)合細(xì)胞蠟塊診斷法，可為及時找到原發(fā)病灶提供重要的線索；同時也可以對細(xì)胞組織進(jìn)行分型，加強對分子病理的檢測，為后期個性化治療提供有力的依據(jù)。由此可見，該診斷方法在臨床上具有顯著的應(yīng)用價值。制作細(xì)胞蠟塊過程中也有幾點需特別注意：（1）離心時轉(zhuǎn)速應(yīng)＜2 500 r/min；（2）離心管要首選漏斗狀的，如果有血性的標(biāo)本，要首先去除紅細(xì)胞，取出細(xì)胞團塊時最好采用頂針捅出的方法。

綜上所述，對于肺癌胸腔積液患者，細(xì)胞蠟塊聯(lián)合免疫組化染色診斷有一定的臨床應(yīng)用價值，能夠為患者的診斷和癌癥分型提供有力的支持，從而可以及時采取有效的方法進(jìn)行治療。