王兆豐，許曉波，唐文瀟，朱有才，胡繼超，張新根

骨肉瘤是一種侵襲性的原始骨間充質(zhì)腫瘤[1]。近年來盡管預(yù)后有所改善，但轉(zhuǎn)移性或復(fù)發(fā)性骨肉瘤的臨床治療仍然具有挑戰(zhàn)性，在過去的三十年里，治療基本上沒有改變[2]。目前的治療方法主要包括手術(shù)切除和全身化療（如阿霉素和順鉑）。然而，患者很快就會產(chǎn)生耐藥性并復(fù)發(fā)。據(jù)報(bào)道，藥物流入/流出蛋白的過度表達(dá)、DNA修復(fù)的增強(qiáng)和致癌信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活是骨肉瘤化療耐藥的原因[3]。因此，通過研究特異性致癌信號通路和致癌基因改善骨肉瘤的治療與預(yù)后受到了廣泛的關(guān)注。TRIM11 是TRIM家族的重要成員之一，研究表明TRIM家族的多個(gè)成員可通過Wnt/ -catenin、IFN、p53 等信號通路直接參與腫瘤的調(diào)控[4-5]。本研究旨在探討TRIM11 基因?qū)侨饬黾?xì)胞增殖與凋亡的影響，為骨肉瘤的治療與預(yù)后提供新的依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 材料與試劑 人骨肉瘤細(xì)胞株MG63、HOS、U2OS、Saos-2、143B 購自上海細(xì)胞庫；TRIM11-SiRNA 骨肉瘤細(xì)胞株Saos-2 購自源井生物科技公司；胎牛血清（FBS）、DMEM 培養(yǎng)基、青鏈霉素購自Solarbio 公司；TRIM11 一抗、GAPDH 一抗、辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG 購自Proteintech 公司；Q-PCR試劑盒、ECL發(fā)光液、RIPA蛋白裂解液、CCK8 試劑盒購自上海碧云天公司；流式細(xì)胞儀、實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀、化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀購自美國Bio-Rad 公司；超凈工作臺、大小型高速冷凍離心機(jī)購自常州諾基儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 采用含10%FBS、1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)成骨細(xì)胞和骨肉瘤細(xì)胞MG63、HOS、U2OS、Saos-2及143B。置于37℃5%CO2飽和濕度下對細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化、傳代，取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 分析TRIM11 在骨肉瘤細(xì)胞和正常成骨細(xì)胞中的表達(dá) 取骨肉瘤細(xì)胞及正常成骨細(xì)胞，按照RNA提取試劑盒說明書要求操作提取各細(xì)胞RNA定量，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，按照q-PCR 試劑盒說明書操作進(jìn)行檢測TRIM11 基因的表達(dá)。采用RIPA 提取各組細(xì)胞蛋白，采用BCA 法蛋白定量后，取蛋白樣品15 g進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜、封閉、加入TRIM11 抗體孵育。洗滌之后加入辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗，孵育，洗滌后用ECL 化學(xué)發(fā)光試劑反應(yīng)，曝光后掃描。

1.2.3 基因芯片數(shù)據(jù)集信息分析 通過GEO（編號E-MEXP-3628）數(shù)據(jù)庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下載高通量數(shù)據(jù)集GSE16102 和GSE39055 分析TRIM11 基因高表達(dá)與骨肉瘤患者預(yù)后不良的關(guān)系。

1.2.4 細(xì)胞株篩選 取對數(shù)增長期的五種骨肉瘤細(xì)胞，采用Q-PCR 和Western blot檢測（操作步驟同1.2.2）五種細(xì)胞株中TRIM11 基因和蛋白的表達(dá)。

1.2.5 CCK8 實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞分組正常骨肉瘤細(xì)胞Saos-2、SiRNA-NC 骨肉瘤細(xì)胞Saos-2、Trim11-SiRNA 骨肉瘤細(xì)胞Saos-2，按照CCK8 試劑盒說明書要求檢測3 組細(xì)胞0、12、24、48 及72h 的細(xì)胞增殖情況，采用流式細(xì)胞儀檢測三組細(xì)胞的凋亡情況。

1.2.6 基因集富集分析 采用GSEA 2.2.1 版本軟件對E-MEXP-3628 數(shù)據(jù)庫中的骨肉瘤表達(dá)譜芯片GSE16102 和GSE39055數(shù)據(jù)集進(jìn)行分析，參照基因集由GSEA 網(wǎng)站MisgDB 數(shù)據(jù)庫中的生物信號傳導(dǎo)相關(guān)的基因集，利用缺省加權(quán)富集統(tǒng)計(jì)的方法進(jìn)行富集分析，設(shè)置隨機(jī)組合次數(shù)1 000 次。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法 采用Graph Pad Prism6.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用 檢驗(yàn)。＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TRIM11 基因和蛋白在骨肉瘤細(xì)胞和正常骨成骨細(xì)胞中的表達(dá) 相對于正常成骨細(xì)胞，骨肉瘤細(xì)胞中TRIM11 的基因和蛋白明顯上調(diào)（均＜0.05）。見封二彩圖2。

圖2 TRIM11 基因和蛋白在骨肉瘤細(xì)胞和正常骨細(xì)胞的表達(dá)

2.2 TRIM11 基因高表達(dá)與骨肉瘤患者預(yù)后不良的關(guān)系 相對于正常組，骨肉瘤組TRIM11 基因表達(dá)明顯上調(diào)（＜0.05）；TRIM11 表達(dá)上調(diào)與骨肉瘤患者預(yù)后不良呈正相關(guān)（＜0.05）。見封二彩圖3～4。

圖3 TRIM11 基因在骨肉瘤和正常組織中的表達(dá)

圖4 TRIM11 高表達(dá)與預(yù)后不良的影響

2.3 TRIM11 在5 種骨肉瘤細(xì)胞株的表達(dá)情況 相對于其他細(xì)胞株，HOS 細(xì)胞株中TRIM11 基因與蛋白表達(dá)量最低，而Saos-2 細(xì)胞株中TRIM11 表達(dá)量較高。因此本研究選擇Saos-2 細(xì)胞株作為目標(biāo)骨肉瘤細(xì)胞株開展細(xì)胞功能試驗(yàn)。見封二彩圖5。

圖5 A：TRIM11 基因在五種骨肉瘤細(xì)胞中的表達(dá)；B：TRIM11 蛋白在五種骨肉瘤細(xì)胞中的表達(dá)

2.4 TRIM11基因干擾后對Saos-2細(xì)胞增殖和凋亡的影響 相對于對照組，NC組細(xì)胞增殖活性無明顯變化（＞0.05）；與NC 組比較，Trim11-SiRNA 細(xì)胞增殖活性明顯降低（＜0.05）。與對照組比較，NC 組細(xì)胞凋亡情況無明顯變化（＞0.05）；與NC 組比較，Trim11-SiRNA細(xì)胞凋亡明顯增多（＜0.05）。見封二彩圖6 ～7。

圖6 TRIM11 基因干擾后對骨肉瘤細(xì)胞Saos-2 增殖的影響

圖7 TRIM11 基因干擾后對Saos-2 細(xì)胞凋亡的影響

2.5 TRIM11 基因表達(dá)對Cell cycle 和MAPK 信號通路的影響 骨肉瘤中TRIM11 基因表達(dá)上調(diào)會激活Cell cycle和MAPK 信號通路，骨肉瘤中TRIM11基因表達(dá)下調(diào)會抑制 Cell cycle 和MAPK 信號通路。見封三彩圖1 ～2。

圖1 骨肉瘤中TRIM11 基因表達(dá)對Cell cycle 信號通路的影響

圖2 骨肉瘤中TRIM11 基因表達(dá)對MAPK 信號通路的影響

3 討論

目前針對骨肉瘤的治療主要以手術(shù)聯(lián)合化療為主，雖然該策略使骨肉瘤患者預(yù)后得到改善，但依然大量患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、化療耐藥等問題。因此對致癌基因和致癌信號通路的研究，對骨肉瘤患者的治療與預(yù)后具有重要意義。

近年來，越來越多的研究表明TRIM基因在人類癌癥發(fā)生與發(fā)展中具有重要作用。本研究以TRIM11 為研究基因，觀察TRIM11 的表達(dá)對骨肉瘤增殖和凋亡的影響。結(jié)果顯示相對于正常成骨細(xì)胞，骨肉瘤細(xì)胞TRIM11 基因和蛋白的表達(dá)明顯上調(diào)，且TRIM11 基因與骨肉瘤預(yù)后不良呈正相關(guān)。通過構(gòu)建TRIM11-SiRNA 骨肉瘤細(xì)胞株Saos-2，觀察TRIM11 基因干擾后對骨肉瘤細(xì)胞Saos-2 增殖和凋亡的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)下調(diào)TRIM11 表達(dá)可顯著抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而TRIM11 過表達(dá)則起到相反的作用。以上結(jié)果說明，TRIM11 可能是骨肉瘤中的癌基因，通過促進(jìn)細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期發(fā)揮作用。研究證明，Cell cycle 和MAPK 信號通路的激活在骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[6-7]，通過基因富集分析，發(fā)現(xiàn)在骨肉瘤中TRIM11 基因表達(dá)上調(diào)會激活Cell cycle和MAPK 信號通路，而TRIM11 表達(dá)下調(diào)則相反，這說明了TRIM11 表達(dá)上調(diào)激活Cell cycle 和MAPK 信號通路可能是骨肉瘤發(fā)生發(fā)展的潛在機(jī)制。

綜上所述，TRIM11可以促進(jìn)骨肉瘤的增殖，延長細(xì)胞周期，其機(jī)制可能與Cell cycle 和MAPK 信號通路的激活有關(guān)，TRIM11有望為骨肉瘤的治療與預(yù)后提供了新的途徑。