李秀娟,范煥芳,閆嬌嬌,李德輝,胡家玉,范向榮

(1. 河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院,河北 石家莊 050000；2. 河北省中醫(yī)院，河北 石家莊 050011)

胃癌是來源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤，我國每年新發(fā)病例約40萬，占全球發(fā)病例數(shù)的42%[1]。2018年《全球癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)》報告[2]，胃癌發(fā)病率為5.7%，病死率為8.2%。胃癌發(fā)病率高，嚴重威脅著人類的健康。已知幽門螺桿菌感染是胃癌發(fā)生發(fā)展的原因之一[3]，及時發(fā)現(xiàn)并治療幽門螺桿菌感染是防治胃癌的途徑之一。但大多數(shù)患者就診時已經(jīng)處于中晚期，失去手術(shù)機會，而化療毒副作用大，尋求新的治療方法迫在眉睫。近年來醫(yī)學(xué)界關(guān)于免疫治療的研究不斷深入，研究發(fā)現(xiàn)胃癌的發(fā)展與機體免疫反應(yīng)關(guān)系密切，免疫療法有望成為治療晚期胃癌的有效方法之一[4]。胃癌的發(fā)生發(fā)展過程及預(yù)后與Th細胞的免疫應(yīng)答相關(guān)，Th細胞即CD4+T細胞，初始CD4+T細胞在接受抗原刺激后分化為1型輔助性T細胞(Thl細胞)和2型輔助性T細胞(Th2細胞)兩型。Thl型細胞主要分泌白細胞介素-2(IL-2)、干擾素-γ(IFN-γ)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)，介導(dǎo)細胞毒和局部炎癥有關(guān)的免疫應(yīng)答[5]。Th2細胞主要分泌白細胞介素-4(IL-4)、白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-10(IL-10)，介導(dǎo)體液免疫是Th2細胞的主要功能[6]。通常機體內(nèi)Th1、Th2處于平衡狀態(tài)，在二者失衡時引起免疫抑制，導(dǎo)致抗腫瘤免疫功能下降，促進腫瘤生長與發(fā)展。本研究采用流式細胞分析法測定胃癌患者及正常人群外周血清Th1相關(guān)細胞及Th2相關(guān)細胞的表達，明確Th1、Th2相關(guān)細胞在胃癌及正常人群中的表達水平，分析Th細胞因子之間相關(guān)性，探討Th細胞與胃癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系及表達過程中可能存在的影響因素，以期為臨床胃癌診療方案提供一定的理論支持。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年7月—2020年1月河北省中醫(yī)院腫瘤二科及河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院收治的Ⅲ～Ⅳ期胃癌患者45例作為觀察組，均經(jīng)手術(shù)病理或胃鏡下取活檢組織，并經(jīng)強化CT或磁共振檢查確診為Ⅲ～Ⅳ期胃癌；無心、腦、肝、腎等其他影響患者免疫系統(tǒng)或免疫反應(yīng)的疾病；就醫(yī)之前無其他感染史及復(fù)雜用藥史。排除有精神疾病病史者，同時患有2種及以上腫瘤者，不能配合醫(yī)護相關(guān)操作者。其中男36例，女9例；年齡56～80(65.8±7.6)歲；病理類型中腺癌38例，印戒細胞癌7例。另選取同期健康體檢人員35例作為正常組，其中男28例，女7例；年齡55～80(63.5±7.7)歲。2組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)，具有可比性。研究對象均簽署知情同意書。本研究經(jīng)河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院科研倫理委員會審核通過(2021-P010)。

1.2主要儀器與試劑 儀器采用B.D公司 FACS Calibur Flow Cytometry System。試劑：流式細胞試劑盒為美國B.D公司產(chǎn)品。

1.3檢測指標(biāo)及方法 取觀察組中胃癌患者及正常組中健康人員的外周血清，采用流式細胞術(shù)進行Th1、Th2相關(guān)細胞因子檢測，依次分別加入IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ、TNF-α抗體，4 ℃避光反應(yīng)20～30 min。每管加入紅細胞裂解液300 μL，充分振蕩后置于40 ℃水浴鍋5 min，加2 mL PBS終止反應(yīng)，1 200 r/min離心5 min，棄上清。加入PBS 500 μL成細胞懸液，流式細胞儀檢測各指標(biāo)表達水平。

2 結(jié) 果

2.12組Th1、Th2相關(guān)細胞因子表達水平比較Th1相關(guān)細胞因子中，觀察組IL-2表達水平明顯低于正常組(P<0.05)，IFN-γ、TNF-α表達水平均明顯高于正常組(P均<0.05)；Th2相關(guān)細胞因子中，觀察組IL-4、IL-6、IL-10表達水平與正常組相比均明顯升高(P均<0.05)。見表1。

表1 2組Ⅲ～Ⅳ期胃癌患者Th1、Th2相關(guān)細胞因子表達水平比較

2.2Th1、Th2細胞因子相關(guān)性分析 IL-4與IFN-γ(r=0.66，P=0.00)、TNF-α(r=0.51，P=0.00)呈正相關(guān)性和。IFN-γ與TNF-α呈正相關(guān)性(r=0.62，P=0.00)。見表2。

表2 Th1、Th2細胞因子相關(guān)性分析(r值)

3 討 論

依據(jù)Th細胞分泌的細胞因子不同，Th 細胞分為不同亞群，其中Th1細胞主導(dǎo)人體的細胞免疫功能，并分泌 Th1類細胞因子，增強人體的抗瘤免疫反應(yīng)；Th2 細胞主導(dǎo)人體的體液免疫功能，與Th1細胞有拮抗作用，可促進腫瘤細胞的生長[7]。人體的抗腫瘤作用主要是由細胞免疫功能介導(dǎo)的，正常情況下機體內(nèi)Th1、Th2處于相對平衡狀態(tài)，機體對腫瘤的免疫反應(yīng)以Th1型免疫應(yīng)答為主。當(dāng)機體的細胞免疫功能下降時，機體Th1和Th2失去平衡，形成以Th2型免疫應(yīng)答為主，使參與調(diào)控的細胞因子和轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生改變，造成免疫抑制，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。

王海波等[7]應(yīng)用ELISA方法檢測胃癌患者及良性胃疾病患者外周靜脈及脾靜脈血中Th1細胞因子粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF) 、Th2細胞因子IL-4的含量，結(jié)果表明胃癌患者外周靜脈及脾靜脈血中GM-CSF含量降低，IL-4含量升高；Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期胃癌患者外周靜脈及脾靜脈血中GM-CSF含量均低于Ⅰ期胃癌患者，IL-4含量則高于Ⅰ期胃癌患者，提示胃癌患者Th1、Th2細胞因子的失衡可能是導(dǎo)致胃癌患者免疫偏移的原因之一。李巖等[8]采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR) 技術(shù)檢測胃癌患者化療前后外周血單個核細胞Th1和Th2類細胞因子的基因表達，結(jié)果表明，胃癌患者化療前呈Th2類細胞因子的強表達，化療后Th2類細胞因子的表達減弱。提示化療可降低Th2類細胞因子的表達，改變Th1和Th2的平衡狀態(tài)，逆轉(zhuǎn)Th1/Th2偏移方向，增強Th1免疫[9]，提高機體免疫系統(tǒng)功能，殺滅或抑制惡性腫瘤細胞的增殖，是治療腫瘤的方法之一[10]。

IL-2由Th1型細胞分泌，通過與細胞膜上白細胞介素2受體結(jié)合，調(diào)節(jié)T淋巴細胞的增殖，發(fā)揮抗腫瘤作用。當(dāng)發(fā)生胃癌早期病變時，IL-2表達下降[11]。胃癌的進展不僅包括本身癌細胞的增殖，還包括癌細胞的轉(zhuǎn)移。Cao等[12]研究發(fā)現(xiàn)，Th1型細胞分泌的IL-2、IFN-γ水平在發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌患者中，比未發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移的患者要低，相反，Th2型細胞分泌的IL-10水平增高，提示胃癌發(fā)展越嚴重，IL-2水平越低。臨床中有研究報道在胃癌患者做手術(shù)、化療前，輔助給予細胞因子IL-2攝入，能預(yù)防免疫細胞中T淋巴細胞的減少，增強抗腫瘤作用[13]。

IFN-γ主要由活化的Th1細胞和自然殺傷細胞(NK)產(chǎn)生，在潰瘍惡變的過程中存在著IFN-γ表達下調(diào)[14]。IFN-γ作為介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的重要細胞因子，是啟動下游信號級聯(lián)發(fā)展成 Th1 細胞的關(guān)鍵細胞因子[15]。IFN-γ 通過STAT1誘導(dǎo)干擾素調(diào)節(jié)因子(IRF-1)表達，IRF-1與IFN-γ形成自分泌環(huán)路，維持Th1 類應(yīng)答[6]。李昭輝等[16]通過原位雜交技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)胃癌細胞不表達IFN-γ。江泳等[17]檢測胃癌患者血清IL-4和IFN-γ含量水平，結(jié)果未出現(xiàn)Th1/Th2漂移現(xiàn)象，提示胃癌患者未出現(xiàn)IL-4、IFN-γ的異常表達。賈坤等[18]通過對胃癌與胃炎、胃潰瘍等病例樣本比較，發(fā)現(xiàn)IFN-γ在胃癌組呈強陽性表達，在胃炎及潰瘍組呈弱陽性表達；IL-4則在胃炎及潰瘍組呈強陽性表達，在胃癌組呈弱陽性表達。對于IFN-γ如何介導(dǎo)胃癌有待于擴大樣本量進一步深入研究。

IL-6可通過誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子的合成，促進血管生成，影響腫瘤細胞的黏附和侵襲。趙濤等[19]研究發(fā)現(xiàn)，胃癌組血清IL-6水平高于胃潰瘍組、正常組；對胃癌組織中IL-6進行檢測，陽性率高達75%，均較其他2組高。此研究進一步從多方面進行分析，發(fā)現(xiàn)臨床分期越晚，分化程度越低，浸潤深度越深，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者IL-6的表達水平越高。Th17細胞分泌產(chǎn)生的IL-17是T細胞誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的早期啟動因子，IL-17可誘導(dǎo)IL-6生成，IL-6又可激活致瘤信號通路STAT3，進而上調(diào)促存活和促血管生成基因的表達，參與腫瘤血管生成。有研究報道，在直腸癌患者中，浸潤癌組織的Th17細胞分泌IL-17A，促進內(nèi)皮細胞和腫瘤相關(guān)的基質(zhì)細胞分泌IL-6，從而發(fā)揮其促炎和促腫瘤效應(yīng)[20]。

1975年E.A. Carswell等人發(fā)現(xiàn)接種卡介苗的小鼠注射細菌脂多糖后，血清中出現(xiàn)一種能使多種腫瘤發(fā)生出血性壞死的物質(zhì)，于是將其命名為腫瘤壞死因子(TNF)，巨噬細胞產(chǎn)生的TNF稱為TNF-α。TNF-α能夠直接殺傷腫瘤細胞，但是對正常細胞無明顯毒性。研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α的高表達能誘發(fā)胃的癌前病變，如腸上皮化生、異型增生等，進而增加胃癌發(fā)生的概率[21]。董志強等[22]研究發(fā)現(xiàn)，胃癌患者的血清TNF-α以及IL-6水平比正常人明顯升高，提示TNF-α及IL-6參與了胃癌的發(fā)生和發(fā)展。王小軍[23]對胃癌組織及其配對正常胃黏膜組織IL-10和TNF-α基因甲基化狀態(tài)、mRNA及蛋白表達進行觀察分析，結(jié)果表明，IL-10和TNF-α基因在胃癌組織中的mRNA相對表達量比正常組織中明顯增高，提示IL-10和TNF-α基因可能參與了胃癌的發(fā)生發(fā)展。但是Tsujimoto等[24]研究發(fā)現(xiàn)，胃癌患者外周血清TNF-α水平比相近年齡的健康人低，分析形成這種差距的原因可能是TNF-α半衰期較短或者檢測的試劑敏感性低所導(dǎo)致的。以上各個研究表明，TNF-α在胃癌患者中絕大多數(shù)是表達升高。

本研究結(jié)果表明，觀察組IL-2表達水平與正常組比較明顯降低，IFN-γ、TNF-α表達水平明顯升高，提示胃癌發(fā)展過程中，IL-2表達降低，IFN-γ、TNF-α表達升高。觀察組IL-4、IL-6、IL-10表達水平與正常組相比明顯升高，提示胃癌患者存在IL-4、IL-6、IL-10高表達，尤其以IL-6升高最為明顯。衛(wèi)茹[25]研究發(fā)現(xiàn)胃竇癌患者IL-2比正常人降低，IL-10與TNF-α比正常人升高，提示胃竇癌患者IL-2、IL-10和TNF-α的變化有可能是胃竇癌診斷及預(yù)后的參考指標(biāo)。殷勤等[26]發(fā)現(xiàn)晚期胃癌患者血清中IL-2水平隨著病程延長而呈下降趨勢，提示IL-2的降低可能與胃癌的進展有關(guān)。以上研究關(guān)于IL-2表達結(jié)果與本次研究結(jié)果具有一致性。

徐法東等[27]檢測42例胃癌患者組織中IL-6 mRNA、IL-4 mRNA表達情況發(fā)現(xiàn)，71.4%(30/42)的胃癌患者癌組織中IL-6呈陽性表達；64.3%(27/42)的胃癌患者癌組織中IL-4呈陽性表達；胃癌組織IL-6、IL-4表達水平比癌旁組織和正常組織表達增高，提示IL-6、IL-4在胃癌組織中存在高表達。本研究結(jié)果中，胃癌患者IL-4、IL-6表達比正常人增高，提示IL-6與IL-4的高表達對胃癌的發(fā)生、發(fā)展有促進作用；Th2相關(guān)細胞中IL-4、IL-6、IL-10以及Th1相關(guān)細胞中IL-2、TNF-α在胃癌中的表達與文獻報道基本一致[23，27]。研究結(jié)果同時表明，在胃癌患者外周血清中存在IFN-γ細胞因子的高表達，與文獻[16]報道不一致。分析原因為：IFN-γ是Th1細胞的標(biāo)志性細胞因子，但NK細胞和CD8+T細胞也產(chǎn)生IFN-γ。NK細胞是自然殺傷細胞，CD8+T細胞主要是細胞毒性T細胞，CD8+T細胞能通過細胞裂解和細胞凋亡直接殺傷腫瘤細胞。朱穎慧等[28]總結(jié)IFN-γ抗腫瘤的作用機制發(fā)現(xiàn)，IFN-γ影響細胞周期變化，抑制細胞增殖，促進腫瘤細胞的凋亡；IFN-γ對Th2細胞的增殖有抑制效應(yīng)，但對Th1細胞則無此效應(yīng)。本研究中胃癌患者外周血清中IFN-γ表達增高可能與胃癌患者應(yīng)激性保護反應(yīng)有關(guān)。關(guān)于IFN-γ在胃癌中的表達以及是否能作為采用干擾素來治療胃癌有待于大樣本進一步深入研究。

本研究對胃癌患者外周血清Th1、Th2細胞因子相關(guān)性進行了分析，結(jié)果顯示，IL-4與IFN-γ、TNF-α均具有相關(guān)性，IFN-γ與TNF-α也具有相關(guān)性，且均呈正的直線關(guān)系。IFN-γ、TNF-α主要是Th1分泌的細胞因子，IL-4為Th2分泌的細胞因子，也進一步印證了Th1和Th2的密切關(guān)系，明確了胃癌患者中 Th1和Th2的相關(guān)性。結(jié)合胃癌患者存在Th1向Th2的偏移現(xiàn)象，提示增強 Th1免疫，逆轉(zhuǎn) Th1/Th2 偏移方向，是胃癌免疫治療的方法之一[6]。研究細胞因子在胃癌中的生物學(xué)活性及作用機制，對于提高治療效果具有指導(dǎo)意義，本研究結(jié)果為挖掘Th1/Th2細胞對胃癌發(fā)生發(fā)展的作用機制提供了依據(jù)。

胃癌患者Th1和Th2應(yīng)答失衡，形成以Th2型細胞增多，Th1型細胞減少的免疫應(yīng)答。免疫應(yīng)答功能的損傷是胃癌發(fā)病及預(yù)后不良的主要原因之一。對于胃癌的免疫治療，以恢復(fù)Th1、Th2之間的平衡，誘導(dǎo)原發(fā)型T淋巴細胞向Th1型分化發(fā)展，激活抗腫瘤免疫應(yīng)答為主要方法。Th相關(guān)細胞因子與胃癌的關(guān)系較為復(fù)雜，同時了解腫瘤的發(fā)展階段及時期，細胞因子的表達可能與不同時期腫瘤本身的病理發(fā)展有關(guān)，需要深入探索其中的內(nèi)在聯(lián)系。本研究通過流式細胞技術(shù)檢測胃癌組與正常組中Th相關(guān)細胞因子的含量水平，發(fā)現(xiàn)胃癌患者Th相關(guān)細胞因子表達異常，IL-4與IFN-γ、TNF-α具有相關(guān)性，胃癌組中IL-2表達水平明顯降低，IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-6、IL-10表達水平明顯升高，外周血清中IFN-γ表達增高可能是胃癌患者應(yīng)激性保護反應(yīng)。臨床檢測Th1、Th2細胞因子在胃癌組織中的表達情況，可能為胃癌的治療及預(yù)后判斷提供依據(jù)。

Th細胞與腫瘤免疫應(yīng)答的關(guān)系是腫瘤防治研究的重要方向，許多疾病的發(fā)生發(fā)展過程及預(yù)后與Th優(yōu)勢應(yīng)答方向有關(guān)，研究細胞因子在胃癌中生物學(xué)活性及作用機制對于拓展胃癌生物治療的范圍、提高治療效果具有重要意義。希望通過對細胞因子及Th細胞亞群的功能研究找到可以激發(fā)提高個體免疫系統(tǒng)功能的細胞因子，從而提高機體自身免疫系統(tǒng)識別殺死腫瘤細胞的能力，為腫瘤治療尋求更多的思路和方向。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。