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        創(chuàng)傷生肌水凝膠對動物皮膚創(chuàng)傷的愈合作用

        2021-03-26 00:30:40董國剛吳艮艮
        東南國防醫(yī)藥 2021年2期
        關(guān)鍵詞:生肌低劑量凝膠

        梁 衛(wèi),董國剛,劉 梅,顧 萌,季 敏,吳艮艮,梁 濤

        0 引 言

        創(chuàng)面愈合是指由于致傷因子的作用造成組織缺失后,局部組織通過再生、修復、重建,進行修補的一系列病理生理過程。可以概括為3個階段:①炎癥反應(yīng),溶解、清除壞死組織和滲出物;②結(jié)締組織細胞和血管內(nèi)皮細胞游動、增殖,形成肉芽組織;③新生結(jié)締組織基質(zhì)沉積和新生組織改建[1]。在新形勢下創(chuàng)傷貼劑的研究為戰(zhàn)時的后勤準備提供需要和支撐,提高野戰(zhàn)醫(yī)療救護隊處理戰(zhàn)創(chuàng)傷出血的應(yīng)急能力,最大限度地降低傷殘率和死亡率[2-3]。皮膚創(chuàng)傷常用藥物有抗生素、固醇類、促成纖維細胞生長類等外用制劑,容易刺激皮膚和引起過敏等不良反應(yīng),且價格昂貴。創(chuàng)傷生肌水凝膠是新型自擬外用中藥復方凝膠制劑,由灸黃芪、黨參、當歸、白芍、茯苓、白術(shù)、乳香、沒藥、黃連組成,具有益氣養(yǎng)血、祛瘀生肌、清熱化濕作用。中藥多為天然成分,具有不良反應(yīng)小,疤痕形成輕,便于取材、生產(chǎn)成本低等優(yōu)勢。本研究實驗觀察創(chuàng)傷生肌水凝膠外用對機械性皮膚創(chuàng)傷、創(chuàng)傷性潰瘍的治療效果及作用機制,為今后研發(fā)治療皮膚創(chuàng)傷的外用制劑提供可能。

        1 材料與方法

        1.1 材料SPF級昆明小鼠50只,雌雄各半,體質(zhì)量18~22 g;SPF級SD大鼠50只,體質(zhì)量180~220 g,雌雄各半,飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學中心動物房(SPF級),常規(guī)飼料喂養(yǎng),自由飲食飲水,模擬自然光照,光照時間(7:00-19:00),溫度20~25 ℃,相對濕度50%~70%。購自上海杰思捷實驗動物有限公司[實驗動物許可證號:SCXK(滬)2013-0006]。創(chuàng)傷生肌水凝膠水提液配制:處方為炙黃芩30 g,黨參30 g,當歸20,炒白芍30 g,炒白術(shù)30g,茯苓30 g,制乳香15 g,制沒藥15 g,等。將藥浸沒于水中30 min后加入藥物2倍量水煎制1 h,濾過,藥渣再煎制30 min,2次藥液混合加熱濃縮到所需濃度。創(chuàng)傷生肌水凝膠凝膠配制:卡波姆∶水提液質(zhì)量比為1∶13,先卡波姆加入純水中溶解,按比例加入上述熬制好的創(chuàng)傷生肌水凝膠水提液,然后加入適量三乙醇胺調(diào)pH=7使之成凝膠狀,最后加入輔料0.2 mL丙三醇、0.1 g尼泊金乙酯、0.2 mL甘油得到1 g/mL的創(chuàng)傷生肌水凝膠凝膠劑。錦虹創(chuàng)面修復誘導凝膠購自山西康頤健科技有限公司,卡波姆940購自北京索爾比奧科技有限公司,大鼠轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)、白細胞介素-2(IL-2)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)酶聯(lián)免疫分析試劑盒購自上海源葉生物科技有限公司,核因子κB(NF-κB)、Smad2、Smad3一抗購自Abcam公司;低溫高速離心機(德國 Eppendorf),酶標儀(上海科華實驗系統(tǒng)有限公司),電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。

        1.2 方法

        1.2.1 小鼠化學性創(chuàng)傷性潰瘍模型制備與給藥取小鼠50只,腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉,用電推子背部脫毛,脫毛的面積1 cm×1 cm,小鼠背部皮下注射稀鹽酸(0.05 mol/mL)0.4 mL/只,單點注射, 3 d后小鼠背部皮膚潰瘍形成[4]。將造模小鼠隨機分為5組,隨機分組方法見文獻[5],每組10只。模型組:給予等量的體積(同其他給藥組)等滲鹽水;基質(zhì)組:給予卡波姆凝膠基質(zhì)0.5%;凝膠低劑量組:1 g/mL;凝膠高劑量組:3.5 g/mL;陽性組:錦虹創(chuàng)面修復誘導凝膠,3 g/支。自造模成功次日分別給各組小鼠局部外敷,在潰瘍局部均勻敷2~3 mm厚,約0.5 mL/cm2,每天保持潰瘍局部與相應(yīng)藥物接觸時間6 h,每只小鼠單籠飼養(yǎng),以免相互添蹭,6 h后以溫等滲鹽水清洗用藥局部;每天敷藥1次,連續(xù)敷藥10 d。

        1.2.2 大鼠機械性創(chuàng)傷模型制備與給藥SD大鼠50只,用1%戊巴比妥鈉麻醉大鼠,剔除其背部毛發(fā),以無菌手術(shù)剪在背部脊柱左右對稱地剪開,每只大鼠背部開5個直徑為0.7 cm的圓形全層皮膚缺損創(chuàng)面,深至皮下[6]。每個圓形創(chuàng)面設(shè)置一個劑量組,分為5組,分組同1.2.1。大鼠造模后,以外敷形式將藥物涂布在傷口表面約2~3 mm厚,約0.5 mL/cm2。

        1.2.3 觀察給藥后小鼠化學性損傷皮膚潰瘍創(chuàng)面愈合率給藥第5天處死小鼠,剪下小鼠潰瘍創(chuàng)面皮膚,用透明薄膜描記創(chuàng)面面積,與原創(chuàng)面面積比較,計算各組小鼠創(chuàng)面愈合率。

        創(chuàng)面愈合率(%)=(原創(chuàng)面面積-現(xiàn)創(chuàng)面面積)/原創(chuàng)面面積×100%

        1.2.4 觀察給藥后大鼠各組皮膚創(chuàng)面愈合率在給藥后第1天、第3天、第6天、第9天分別處死大鼠,用透明薄膜描記創(chuàng)面面積,與原創(chuàng)面面積比較,計算各組大鼠創(chuàng)面愈合率。

        1.2.5 大鼠皮膚常規(guī)病理組織學切片染色在給藥后第9天處死各組大鼠,取皮膚創(chuàng)緣及周圍0.5 cm左右寬的組織,深達皮下組織,將組織塊甲醛固定,常規(guī)石蠟包埋后。常規(guī)脫水,包埋,切片后作HE染色,光鏡觀察皮膚及肉芽組織結(jié)構(gòu)改變。

        1.2.6 ELISA法檢測大鼠皮膚組織細胞因子表達給藥第9天,取大鼠傷口部位皮膚組織,用勻漿機制成10%勻漿。ELISA法檢測TGF-β1、IL-2、TNF-α的變化。

        1.2.7 Western blot法檢測NF-κB、Smad2、Smad3蛋白表達給藥第9天,取大鼠皮膚組織,勻漿制備,采用Western印跡的方法,進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠電泳。麗春紅染色顯示凝膠中的蛋白條帶后,轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上進行NF-κB65、Smad2、Smad3蛋白的檢測。一抗(1∶200)和β-actin(1∶1500),二抗(1∶5000)稀釋。采用賽默飛化學發(fā)光底物(ECL)化學發(fā)光試劑盒,顯影定影水洗晾干后,對膠片感光條帶進行灰度掃描。應(yīng)用BIO-RAD圖像分析軟件對Western 印跡雜交條帶進行密度掃描,檢測NF-κB、Smad2、Smad3的蛋白表達。

        2 結(jié) 果

        2.1 創(chuàng)傷生肌水凝膠對于小鼠化學性創(chuàng)傷性潰瘍愈合率的影響給藥第5天后,與基質(zhì)組[(1.50±0.25)%]比較,凝膠高劑量組和低劑量組愈合率[(1.22±0.18)%、(1.30±0.12)%]差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);陽性組愈合率[(23.5±0.48)%]顯著提高(P<0.05),表明陽性組用藥可促進化學性潰瘍傷口愈合。而創(chuàng)傷生肌水凝膠對化學性損傷潰瘍無明顯治療作用。

        2.2 創(chuàng)傷生肌水凝膠對于大鼠機械性創(chuàng)面愈合率的影響給藥第1、3、6、9天,與模型組比較,基質(zhì)組的愈合率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);給藥第6天后,與基質(zhì)組比較,凝膠低劑量組、高劑量組、陽性組創(chuàng)面愈合率均明顯提高(P<0.01);給藥第9天后,凝膠低劑量組、高劑量組、陽性組創(chuàng)面愈合率顯著提高(P<0.01);見表1。給藥第6和9天,創(chuàng)傷生肌水凝膠各組和陽性組較基質(zhì)組皮膚創(chuàng)傷修復明顯,表明創(chuàng)傷生肌水凝膠能夠促進皮膚創(chuàng)傷愈合。

        表1 各組大鼠不同時間機械性創(chuàng)面愈合率比較

        2.3 創(chuàng)傷生肌水凝膠對大鼠機械性創(chuàng)面皮膚病理組織學影響給藥第9天,模型組皮膚各層組織表皮層增厚,但未完全愈合并伴有組織輕度壞死;基質(zhì)組表皮結(jié)構(gòu)消失,可見滲出,真皮內(nèi)見增生性反應(yīng),局部有充血;凝膠低劑量組皮膚各層組織結(jié)構(gòu)清晰,結(jié)締組織明顯,可見肉芽組織;高劑量組真皮層結(jié)構(gòu)尚清晰,可見肉芽組織形成;陽性組皮膚各層組織結(jié)構(gòu)完整清晰,傷口基本愈合接近正常皮膚。見圖1。

        圖1 各組大鼠機械性創(chuàng)面皮膚病理結(jié)果(HE ×400)

        2.4 ELISA法檢測大鼠皮膚組織細胞因子TGF-β1、IL-2、TNF-α表達與模型組比較,基質(zhì)組TGF-β1、IL-2、TNF-α含量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與基質(zhì)組比較,凝膠高劑量組、陽性組TGF-β1含量有顯著升高(P<0.05)。見表2。

        表2 創(chuàng)傷生肌水凝膠對各組大鼠TGF-β1、IL-2、TNF-α含量的影響

        2.5 免疫印跡法檢測NF-κB、Smad2、Smad3蛋白表達給藥第9天,與基質(zhì)組比較,凝膠高劑量組、陽性組的NF-κB的表達明顯下降(P<0.05),而Smad2、Smad3的蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖2。

        1:模型組;2:基質(zhì)組;3:凝膠低劑量組:4:凝膠高劑量組:5:陽性組與基質(zhì)組比較,*P<0.05圖2 創(chuàng)傷生肌水凝膠對各組大鼠NF-κB、Smad2、Smad3蛋白表達的影響

        3 討 論

        創(chuàng)傷修復一直是醫(yī)學領(lǐng)域的研究熱點,而皮膚作為人體最大最外部的器官極易遭受創(chuàng)傷,皮膚創(chuàng)面愈合是一系列復雜的連續(xù)的生物化學和細胞活動過程。TGF-β在此過程中是調(diào)節(jié)成纖維細胞功能的主要細胞因子,TGF-β不僅通過促進成纖維細胞趨化,產(chǎn)生膠原纖維和細胞外基質(zhì),還可減少膠原酶的合成,增加金屬蛋白酶抑制劑的產(chǎn)生,從而減少傷口中的酶解作用,促進傷口愈合[7-8]。NF-κB是炎癥相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子,多種炎癥因子如IL-6等的啟動子區(qū)均含有NF-κB的結(jié)合位點,創(chuàng)傷生肌水凝膠可能是通過抑制NF-κB信號傳導通路,抑制傷口愈合后期炎癥生成和組織纖維化,防止瘢痕和疤痕的形成。Smads蛋白可以調(diào)節(jié)創(chuàng)面愈合,對皮膚組織修復中有作用,目前認為是“修復相關(guān)基因”[9-12]。

        創(chuàng)傷生肌水凝膠是由炙黃芩、黨參、當歸、白芍、茯苓、白術(shù)、乳香、沒藥、黃連組成的中藥復方凝膠制劑。方中炙黃芩具有清熱解毒生肌作用。黨參具有補氣固表、益氣生肌作用,當歸、白芍具有補血活血生肌之功效,茯苓、白術(shù)具有健脾益氣化濕作用,乳香、沒藥具有活血祛瘀生肌之功效,黃連具有清熱解毒生肌作用。諸藥合用,全方具有益氣養(yǎng)血、活血祛瘀、清熱化濕生肌作用。有研究報道,黃芩多糖可促進成纖維細胞的增殖,并且其增殖作用隨時間的延長而增強[13]。單用當歸可使瘢痕軟化縮小,明顯減少瘢痕組織中的成纖維細胞數(shù)量和膠原含量,減輕瘢痕纖維化程度。當歸中的多糖通過對角質(zhì)形成細胞TGF-β的表達具有顯著的調(diào)節(jié)作用,從而促進成纖維細胞增殖[14]。乳香和沒藥具有鎮(zhèn)痛作用[15]。

        本研究采用皮下注射稀鹽酸建立小鼠皮膚潰瘍模型,創(chuàng)傷生肌水凝膠各劑量組對化學性潰瘍愈合率未見改善作用,說明創(chuàng)傷生肌水凝膠對化學性潰瘍造成的潰瘍效果不好。采用大鼠皮膚機械性損傷模型,實驗結(jié)果顯示:與基質(zhì)組比較,凝膠低劑量組、高劑量組于給藥第6、9天時皮膚創(chuàng)面愈合率較高,同時病理切片報告顯示:給藥第9天后,凝膠高、低劑量組皮膚各層組織結(jié)構(gòu)清晰,結(jié)締組織明顯,可見肉芽組織。ELISA檢測細胞因子結(jié)果顯示:凝膠高劑量組細胞因子TGF-β1含量有顯著升高;Western蛋白實驗結(jié)果顯示:創(chuàng)傷生肌水凝膠抑制NF-κB蛋白的表達,對Smads蛋白表達無影響,提示該藥對TGF-β1的作用可能不是通過Smads蛋白通路實現(xiàn)的。

        綜上所述,創(chuàng)傷生肌水凝膠對化學性創(chuàng)傷潰瘍無作用,但能夠促進機械性創(chuàng)傷愈合。創(chuàng)傷愈合還與調(diào)節(jié)免疫、神經(jīng)肽P物質(zhì)(SP)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、表皮生長因子(EGF)及血小板生長因子(FGF)等細胞因子有關(guān)[16-17]。本實驗還有待深化,其創(chuàng)傷修復機制有待于進一步研究,以闡明創(chuàng)傷生肌水凝膠與創(chuàng)傷愈合之間的內(nèi)在機制。

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