董方　張群峰　阮建云

摘要： 基于超高效液相色譜-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-QqQ-MS/MS）聯(lián)用技術(shù)對茶葉中黃酮醇糖苷（FGs）種類及含量進(jìn)行測定并對提取方式和檢測條件進(jìn)行優(yōu)化。用75%（體積分?jǐn)?shù)）甲醇水溶液提取目標(biāo)化合物，再用Waters Acquity HSS T3色譜柱（粒徑為1.8 μm，長度×內(nèi)徑為100.0 mm×2.1 mm）分離目標(biāo)化合物，以含有0.1%（體積分?jǐn)?shù)）甲酸的乙腈溶液為流動相進(jìn)行梯度洗脫，采用電噴霧正離子源（ESI+）與質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）方法對成品茶中15種FGs進(jìn)行定量測定。結(jié)果表明，在0.1～20.0 μg/ml的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)FGs的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系良好，其檢測限（LOD）為0.08～0.23 μg/L，定量限（LOQ）為0.25～0.76 μg/L，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.30%～2.80%，出峰時間為3.60～7.40 min。與現(xiàn)有最優(yōu)檢測技術(shù)相比，超高效液相色譜-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜法具有分析速度快、靈敏度高、穩(wěn)定性好等特點(diǎn)，可為提高茶葉品質(zhì)成分的檢測效率提供參考。

關(guān)鍵詞： 茶葉;黃酮醇糖苷;超高效液相色譜-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜法;質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測;優(yōu)化

中圖分類號： O658;TS272 文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A 文章編號： 1000-4440（2021）01-0204-09

Determination of flavonol glycosides in teas by ultra-high performance liquid chromatography combined with triple four-bar tandem mass spectrometry

DONG Fang1，2， ZHANG Qun-feng2， RUAN Jian-yun 2

（1.Institute of Horticulture， Jiangxi Academy of Agricultural Sciences， Nanchang 330200， China;2.Tea Research Institute， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Hangzhou 310008， China）

Abstract： The extraction methods and detection conditions of flavonol glycosides （FGs） in teas were optimized based on ultra-high performance liquid chromatography combined with triple four-bar tandem mass spectrometry （UPLC-QqQ-MS/MS） technology， and the varieties and contents were determined. The target compounds were extracted with 75% （volume fraction） methanol aqueous solution， separated on Waters Acquity HSS T3 column （particle size was 1.8 μm， length × inner diameter was 100.0 mm × 2.1 mm）， and gradient elution was carried out using acetonitrile solution containing 0.1% （volume fraction） formic acid as moving phase. Positive electrospray ionization （ESI+） and mass spectrometry multiple reaction monitoring （MRM） methods were used to quantitatively determine 15 flavonol glycosides in made teas. The results indicated that the matrix standard curve of FGs showed a good linearity in the concentration range of 0.1-20.0 μg/ml， the limit of detection （LOD） was 0.08-0.23 μg/L， the limit of quantity （LOQ） was 0.25-0.76 μg/L， the relative standard deviation （RSD） was 1.30%-2.80%， and the peak out time was 3.60-7.40 min. Compared with the existing optimal detection technology， UPLC-QqQ-MS/MS method has fast analysis speed， high sensitivity and good stability， which can provide reference for improving the detection efficiency of tea quality components.

Key words： tea;flavonol glycosides;ultra-high performance liquid chromatography combined with triple four-bar tandem mass spectrometry;mass spectrometry multiple reaction monitoring;optimization

黃酮醇糖苷（Flavonols glycosides，F(xiàn)Gs）是茶葉中除兒茶素外較為重要的多酚類物質(zhì)之一，大都由黃酮醇苷元（楊梅素、槲皮素、山柰酚等）或黃酮苷元（芹菜素等）與糖分子（葡萄糖、半乳糖、蕓香糖等）結(jié)合形成O-糖苷[1-2]。已有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)Gs不僅對茶葉中的苦澀味及茶湯的光澤度、亮度具有重要作用[3-6]，而且具有類黃酮物質(zhì)的生理學(xué)共性，在生物體中發(fā)揮著抗氧化、清除活性氧自由基及抵御紫外線、抗菌抑菌等作用[7-8]。

國內(nèi)外有很多FGs檢測方法的報道，目前常用的檢測方法主要包括紫外分光光度法（UV spectrophotometer）、高效液相色譜法（HPLC）、液相色譜-質(zhì)譜檢測法（LC-MS）、超高效液相色譜法（UPLC）、毛細(xì)管電泳法（CE）及電化學(xué)檢測法（ED）等[9]。超高效液相色譜是一種基于HPLC系統(tǒng)開發(fā)的色譜技術(shù)，它充分利用了小粒度色譜柱、超高壓液相色譜泵的優(yōu)勢，能夠更靈敏、更快速地實(shí)現(xiàn)分離檢測，目前已在茶（Camellia sinensis L.）、洋蔥（Allium cepa L.）和銀杏（Ginkgo biloba L.）等多種植物的FGs檢測中得到應(yīng)用[10-12]。Kim等[13]采用UPLC-PDA（超高效液相色譜-二極管陣列）建立了針對蕎麥、紅茶、野生歐芹FGs類化合物的檢測方法，共有12種FGs得到了較好的分離，但是其含量的線性范圍較大，為0.88～14.00 mg/kg;Jiang等[14]首次采用UPLC檢測到綠茶、烏龍茶和紅茶中18種FGs類化合物，但是分離時間較長，為30～60 min;劉陽等[2]研究了FGs在綠茶中的浸出特性，并基于常規(guī)HPLC檢測方法，分離并定量了11種與茶湯滋味相關(guān)性最高的黃酮苷類物質(zhì)，但也存在分離時間長、定量準(zhǔn)確度低的問題。UPLC與MS/MS的聯(lián)用，已經(jīng)成為植物化學(xué)組分研究的新趨勢，為茶葉中化合物的痕量分析提供了定量保證。本研究基于多種FGs標(biāo)準(zhǔn)品，在已有研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用超高效液相色譜-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-QqQ-MS/MS），并結(jié)合紫外光譜、質(zhì)譜參數(shù)和色譜保留規(guī)律，測定茶葉中FGs種類和含量，以期實(shí)現(xiàn)快速分離和準(zhǔn)確鑒定茶葉中的FGs。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

綠茶成品茶（西湖龍井）產(chǎn)自浙江省杭州市西湖區(qū)中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所示范園（120°5′21.39″E，30°10′57.19″N），原料品種為龍井43，選用清明前1芽1葉，由杭州龍冠實(shí)業(yè)公司提供;紅茶成品茶（滇紅金針）產(chǎn)自云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所科研試驗基地（100°25′55.19″E，21°59′25.76″N），原料品種為云南勐海大葉種，選用清明前1芽1葉，由勐海縣云茶科技有限公司提供。

甲醇（質(zhì)譜級）、乙腈（質(zhì)譜級），產(chǎn)自德國Merck公司;甲酸（色譜級）、楊梅素-3-半乳糖苷（M-3-Ga）標(biāo)準(zhǔn)品、楊梅素-3-葡萄糖苷（M-3-G）標(biāo)準(zhǔn)品、槲皮素-3-半乳糖苷（Q-3-Ga）標(biāo)準(zhǔn)品、槲皮素-3-葡萄糖苷（Q-3-G）標(biāo)準(zhǔn)品、槲皮素-3-半乳糖-鼠李糖苷（Q-3-GaRh）標(biāo)準(zhǔn)品、槲皮素-3-葡萄糖-鼠李糖苷（Q-3-GRh）標(biāo)準(zhǔn)品、山柰酚-3-半乳糖苷（K-3-Ga）標(biāo)準(zhǔn)品、山柰酚-3-葡萄糖苷（K-3-G）標(biāo)準(zhǔn)品、山柰酚-3-半乳糖-鼠李糖苷（K-3-GaRh）標(biāo)準(zhǔn)品、山柰酚-3-葡萄糖-鼠李糖苷（K-3-GRh）標(biāo)準(zhǔn)品，所有標(biāo)準(zhǔn)樣品純度≥98%，均產(chǎn)自美國Sigma公司;試驗用水為Milli-Q超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

艾卡A11基本型分析研磨機(jī)，產(chǎn)自德國IKA公司;BT125D型電子分析天平，產(chǎn)自德國Sartorius公司;Thermo Heraeus Fresco 17微量冷凍離心機(jī)，產(chǎn)自美國賽默飛世爾科技公司;KQ-500E型超聲波清洗機(jī)，產(chǎn)自昆山超聲波儀器公司;超高效液相色譜-三重四極桿-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（ACQUITY UPLC-QqQ-MS/MS H-Class），配有ACQUITY UPLC二極管陣列（PDA）檢測器、Acquity HSS T3色譜柱（粒徑為1.8 μm，柱長×內(nèi)徑為 100.0 mm×2.1 mm），產(chǎn)自美國Waters公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 準(zhǔn)確稱取M-3-Ga標(biāo)準(zhǔn)品、M-3-G標(biāo)準(zhǔn)品、Q-3-Ga標(biāo)準(zhǔn)品、Q-3-G標(biāo)準(zhǔn)品、Q-3-GaRh標(biāo)準(zhǔn)品、Q-3-GRh標(biāo)準(zhǔn)品、K-3-Ga標(biāo)準(zhǔn)品、K-3-G標(biāo)準(zhǔn)品、K-3-GaRh標(biāo)準(zhǔn)品、K-3-GRh標(biāo)準(zhǔn)品，分別加入75%（體積分?jǐn)?shù)）甲醇溶液振蕩超聲處理（振蕩頻率為3 000 r/min，超聲功率為40 kHz，超聲時間為10 min），配制成質(zhì)量濃度為1.0 mg/ml的母液。用75%（體積分?jǐn)?shù)）甲醇溶液稀釋上述標(biāo)準(zhǔn)品的母液，配制成質(zhì)量濃度分別為0.1 μg/ml、1.0 μg/ml、2.0 μg/ml、10.0 μg/ml、20.0 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3.2 供試樣品的前處理 供試樣品的前處理方法參照Zhang等[15-16]的方法。取適量成品綠茶、成品紅茶，用研磨機(jī)磨碎后精確稱取50 mg磨碎的成品綠茶、成品紅茶樣品，分別溶解于1 ml 75%（體積分?jǐn)?shù)）甲醇溶液中，用最大頻率（40 kHz）連續(xù)超聲處理10 min，之后再于12 000 r/min離心10 min，取500 μl上清液，加入500 μl 75%（體積分?jǐn)?shù)）甲醇溶液稀釋，然后過0.22 μm聚四氯乙烯（PTFE）濾膜，用于上機(jī)分析，每種茶設(shè)3個重復(fù)。

1.3.3 儀器分析條件 色譜條件：采用Waters Acquity HSS T3色譜柱（粒徑為1.8 μm，柱長×內(nèi)徑為100.0 mm×2.1 mm，產(chǎn)自Waters公司，產(chǎn)地為美國Milford）進(jìn)行分離。洗脫條件參照Zhang等[15，17]的方法，流動相A為0.1%（體積分?jǐn)?shù)）甲酸，流動相B為乙腈（混有體積分?jǐn)?shù)為0.1%的甲酸），洗脫程序：0 min，5%乙腈;0.1～3.0 min，5%～20%乙腈;3.1～4.3 min，20%乙腈;4.4～9.0 min，20%～45%乙腈;9.1～11.0 min，45%～100%乙腈;11.1～13.0 min，100%乙腈;13.1～15.0 min，回到5%乙腈的初始條件。所有試驗的柱溫均設(shè)置為40 ℃，樣品溫度設(shè)置為6 ℃，流速為0.4 ml/min，進(jìn)樣量為2 μl，紫外（UV）檢測波長為370 nm。

質(zhì)譜條件：采用Waters Xevo TQ質(zhì)譜儀（Waters公司，產(chǎn)地為Milford， MA， USA），使用電噴霧電離源（ESI）正離子模式，毛細(xì)管電壓設(shè)為3.5 kV，源溫度設(shè)為150 ℃，脫溶劑溫度設(shè)為500 ℃，錐孔氣體流速設(shè)為50 L/h，脫溶劑氣體流速設(shè)為800 L/h。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Mass Lynx 4.0軟件對MS檢測[含多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）]與紫外檢測器（PDA）檢測獲得的原始圖譜進(jìn)行質(zhì)譜峰或紫外光譜峰的提取和積分。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制、FGs含量的換算采用Excel 2010。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶葉中黃酮醇糖苷的定性檢測

本研究在相同色譜條件、相同質(zhì)譜條件下對不同茶葉中的黃酮醇糖苷（FGs）進(jìn)行UPLC分析和MRM分析，結(jié)果表明，不同組分的FGs化合物在3.60～7.40 min全部洗脫分離，對應(yīng)的UPLC色譜圖見圖1，根據(jù)最大波長吸光度，利用FGs標(biāo)準(zhǔn)品，結(jié)合二級質(zhì)譜碎片，并與參考文獻(xiàn)[10]、[14]、[17]、[18]比對，鑒定出茶葉中15種FGs，相關(guān)定性參數(shù)見表1。

由圖1還可以看出，楊梅素-3-葡萄糖-鼠李糖苷（M-3-GRh）、槲皮素-3-半乳糖-鼠李糖-葡萄糖苷（Q-3-GaRhG）、槲皮素-3-葡萄糖-鼠李糖-葡萄糖苷（Q-3-GRhG）、山柰酚-3-半乳糖-鼠李糖-葡萄糖苷（K-3-GaRhG）和山柰酚-3-葡萄糖-鼠李糖-葡萄糖苷（K-3-GRhG）分別對應(yīng)1號峰、4號峰、5號峰、10號峰和11號峰，根據(jù)它們的相對分子質(zhì)量、色譜保留的一般規(guī)律、二級質(zhì)譜碎片和相關(guān)報道[10，14，17-18]進(jìn)行綜合鑒定;其余FGs根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行驗證，M-3-Ga、M-3-G、Q-3-GaRh、Q-3-GRh、Q-3-Ga、Q-3-G、K-3-GaRh、K-3-GRh、K-3-Ga和K-3-G分別對應(yīng)2、3、6、7、8、9、12、13、14和15號峰。根據(jù)色譜保留的一般規(guī)律，在反相色譜柱洗脫的過程中，按出峰時間排序依次為楊梅素糖苷（3個羥基）、槲皮素糖苷（2個羥基）、山柰酚糖苷（1個羥基），10號峰對應(yīng)的K-3-GaRhG不符合這一規(guī)律;對于相同苷元，按出峰時間排序依次為三糖糖苷、二糖糖苷、單糖糖苷，而對于不同苷元的FGs，出峰順序為半乳糖苷類化合物、葡萄糖苷類化合物。由二級質(zhì)譜碎片信息可知，楊梅素糖苷、槲皮素糖苷和山柰酚糖苷的主要碎片離子質(zhì)荷比分別為319、303和287。

2.2 黃酮醇糖苷標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)譜分析和色譜分析

為了優(yōu)化FGs的定量方法，選取Q-3-GRh、M-3-Ga、Q-3-G、K-3-G、K-3-GaRh標(biāo)準(zhǔn)品，采用多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）和紫外檢測器（PDA）檢測方法分別建立FGs標(biāo)準(zhǔn)品峰面積與對應(yīng)質(zhì)量濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，綜合比較2種檢測方法的靈敏性和穩(wěn)定性。

由表2可以看出，在2種檢測方法下，5種FGs標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積與對應(yīng)質(zhì)量濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)曲線在0.1～20.0 μg/ml質(zhì)量濃度范圍內(nèi)均具有較好的線性關(guān)系（R2>0.99）。從檢測限和定量限來看，利用MRM方法的檢測限（LOD）為0.08～0.23 μg/L，定量限（LOQ）為0.25～0.76 μg/L;而PDA方法，LOD為1.00～1.58 μg/L，LOQ為3.33～5.25 μg/L，整體上高于前者1～2個數(shù)量級。由此可見，MRM方法的檢測靈敏度更高。

將提取的同一茶葉樣品在2種檢測方法下各重復(fù)檢測6次，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，色譜峰的保留時間波動均小于0.1 min，并且標(biāo)準(zhǔn)品峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）約為0.5%，說明MRM方法與PDA方法檢測的精密度良好。

準(zhǔn)確稱取6份質(zhì)量為50 mg的綠茶樣品，按照方法1.3.2進(jìn)行樣品前處理，然后每份樣品均采用MRM和PDA 2種方法檢測。如表3所示，MRM方法的5種FGs的RSD為1.30%～2.80%，PDA方法的5種FGs的RSD為2.70%～4.70%，說明MRM方法的重復(fù)性較PDA方法好。

2.3 茶葉中黃酮醇糖苷的定量檢測

由于質(zhì)譜具有高靈敏度、方法穩(wěn)定等特點(diǎn)，加上茶葉中的FGs具有良好的色譜分離性能，因此本研究根據(jù)現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)品，選擇MRM模式，利用二級質(zhì)譜準(zhǔn)確定量綠茶、紅茶中的FGs，優(yōu)化后的FGs質(zhì)譜參數(shù)見表4，其中母離子均采用加氫離子峰[M+H]+，子離子則為黃酮醇苷元離子。

針對未購置標(biāo)準(zhǔn)品的FGs進(jìn)行相對定量，具體參照王智聰?shù)萚10]的公式進(jìn)行計算。選取決定系數(shù)較高的標(biāo)準(zhǔn)曲線（以M-3-Ga為標(biāo)準(zhǔn)品），用外標(biāo)法準(zhǔn)確定量成茶中的M-3-Ga含量，成茶中其他FGs的含量則根據(jù)M-3-Ga質(zhì)譜峰面積及含量確定。由于無法準(zhǔn)確得到無標(biāo)準(zhǔn)品FGs的質(zhì)譜響應(yīng)差異，因此假定FGs與M-3-Ga質(zhì)譜響應(yīng)一致，具體公式如下：

Cj=AjMjCiDV/mAiMi

式中：Cj、Ci分別表示成茶茶湯中待測FGs含量、M-3-Ga含量;Aj、Ai分別表示待定量FGs化合物的峰面積、M-3-Ga的峰面積;Mj、Mi分別表示待定量FGs化合物的相對分子質(zhì)量、M-3-Ga的相對分子質(zhì)量;D表示進(jìn)樣前稀釋倍數(shù);V表示提取液體積;m表示樣品質(zhì)量。

如表5所示，不同F(xiàn)Gs組分含量在綠茶和紅茶間存在一定差異。綠茶中總黃酮醇糖苷含量為5 492.40 mg/kg，而紅茶中總黃酮醇糖苷含量為5 910.19 mg/kg，高于綠茶中總黃酮醇糖苷含量。在綠茶中，K-3-GRhG、Q-3-GRhG的含量較高，分別為1 078.03 mg/kg、881.08 mg/kg，而含量較低的是Q-3-GaRh、K-3-GaRh、K-3-G，分別為14.69 mg/kg、14.80 mg/kg、35.19 mg/kg;在紅茶中，K-3-GRhG含量最高，達(dá)2 027.34 mg/kg，而Q-3-GaRh、K-3-GaRh、K-3-G的含量較低，分別為47.91 mg/kg、42.92 mg/kg、22.59 mg/kg。從不同苷元類型的黃酮醇糖苷含量來看，綠茶中楊梅素糖苷（M-3-GRh、M-3-Ga、M-3-G）總含量為940.18 mg/kg，顯著高于紅茶中楊梅素糖苷總含量（673.64 mg/kg）;槲皮素糖苷（Q-3-GaRhG、Q-3-GRhG、Q-3-GaRh、Q-3-GRh、Q-3-Ga、Q-3-G）總含量在綠茶中最高，為2 434.29 mg/kg，顯著高于紅茶中槲皮素糖苷總含量（2 061.34 mg/kg）;而山柰酚糖苷（K-3-GaRhG、K-3-GRhG、K-3-GaRh、K-3-GRh、K-3-Ga、K-3-G）總含量在紅茶中占絕對優(yōu)勢，為3 175.21 mg/kg，顯著高于綠茶中的山柰酚糖苷總含量（2 117.93 mg/kg）。

本研究利用質(zhì)譜MRM檢測法，基于10種標(biāo)準(zhǔn)品對茶葉FGs檢測的質(zhì)譜條件進(jìn)行了優(yōu)化，在成品茶（綠茶、紅茶）中鑒定出15種FGs，包括3種楊梅素糖苷、6種槲皮素糖苷和6種山柰酚糖苷。此外，本研究對已有標(biāo)準(zhǔn)品的FGs進(jìn)行了絕對定量，其余5種基于王智聰?shù)萚10]的方法進(jìn)行相對定量分析。與現(xiàn)有主流方法[3， 10]（表6）相比，優(yōu)化后的質(zhì)譜條件使FGs化合物的檢測時間縮短了30%，并且組分的分離度更強(qiáng)。Wu等[3]利用負(fù)離子檢測模式比較了UPLC-QqQ-MS/MS與HPLC-MS的差異，結(jié)果表明，UPLC-QqQ-MS/MS法的檢測靈敏度高于HPLC-MS法。而本研究采用正離子模式，進(jìn)一步證實(shí)了在相同儀器設(shè)備條件下由二級質(zhì)譜（MRM檢測方法）建立的FGs檢測方法的檢出限整體上低于PDA方法1～2個數(shù)量級，靈敏度更高。與Wu等[3]的方法相比，用正離子模式MRM方法檢測的FGs質(zhì)譜峰響應(yīng)強(qiáng)度更高，能夠有效降低樣品機(jī)制效應(yīng)（即干擾組分對目標(biāo)組分電離的影響）對分析的干擾程度，有利于低質(zhì)量濃度FGs的定量分析。

3 討論

3.1 MRM檢測方法的優(yōu)勢

本研究選取5種黃酮醇糖苷標(biāo)準(zhǔn)品（Q-3-GRh、M-3-Ga、Q-3-G、K-3-G、K-3-GaRh），分別同時采用MRM檢測方法和PDA檢測方法，基于方法的靈敏度和穩(wěn)定性指標(biāo)分析比較了二者對于茶葉中FGs的定性、定量效果。結(jié)果顯示，在MRM方法下，成茶中15種FGs被定量測定，并且FGs的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線在0.1～20.0 μg/ml質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，其定量限為0.25～0.76 μg/L，檢測限為0.08～0.23 μg/L，以上參數(shù)均優(yōu)于PDA檢測方法。同時，本研究利用目標(biāo)化合物的二級質(zhì)譜碎片進(jìn)行定量，可以選擇性地檢測被定量化合物，使同分異構(gòu)體（如M-3-Ga/M-3-G、Q-3-GaRh/Q-3-GRh）得到較好分離。此外，根據(jù)精密度試驗和重復(fù)性試驗的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，MRM檢測方法的穩(wěn)定性優(yōu)于PDA檢測方法。由此可見，基于二級質(zhì)譜MRM模式建立的茶葉中FGs的MRM檢測方法靈敏度和分離度高、穩(wěn)定性好。然而，當(dāng)不需要較高的靈敏度和特異的分離度時，PDA檢測方法可以作為MRM檢測的1種快速且經(jīng)濟(jì)的替代方法，茶葉中主要FGs化合物的色譜峰根據(jù)其保留時間能夠輕松地得到鑒定，并通過積分進(jìn)行定量分析[21]。

3.2 MS（MRM）檢測條件的優(yōu)化

樣品前處理對于樣品鑒定和結(jié)果的準(zhǔn)確性有至關(guān)重要的影響[22]。溶劑法是黃酮類化合物常用的提取方法，利用熱水法和有機(jī)溶劑法均能提取黃酮醇苷類物質(zhì)。陳叢瑾等[23]研究發(fā)現(xiàn)，黃酮苷類物質(zhì)易溶于水以及甲醇、乙醇等強(qiáng)極性溶劑，高濃度的醇易于提取苷元，而用60%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇或甲醇能有效提取含苷類的黃酮類化合物。盡管沸水也能夠提高黃酮苷類物質(zhì)提取率，但易將蛋白質(zhì)、糖類等化合物溶于水中，從而降低了黃酮醇苷的浸出率。因此，本研究以75%（體積分?jǐn)?shù)）甲醇作為提取劑，結(jié)果顯示，色譜峰分離效果優(yōu)于其他試驗結(jié)果[2-3，13，20-21]。超高效液相色譜（UPLC）的出峰時間通常由物質(zhì)本身的性質(zhì)、固定相（色譜柱填料、柱長短、粒徑）、流動相、柱溫和流速等因素共同決定。本研究采用T3色譜柱，與Kim等[13-14]采用的C18色譜柱相比，T3色譜柱對極性較強(qiáng)的FGs類化合物的保留效果好。Kim等[13]選用含有1.0%（體積分?jǐn)?shù)）甲酸的15%（體積分?jǐn)?shù)）乙腈作為流動相進(jìn)行等度洗脫，本研究使用含有0.1%（體積分?jǐn)?shù)）甲酸的99.9%（體積分?jǐn)?shù)）乙腈作為流動相，進(jìn)行梯度洗脫，并且在分離時間、峰型方面的優(yōu)勢明顯，能夠保證短時間內(nèi)將樣品中的強(qiáng)保留組分洗脫。此外，在本研究中柱溫設(shè)為40 ℃，流速設(shè)為0.4 ml/min，相較于Kim等[13-14]的方法，在溫度、流速上均提高了50%，由此說明，在相同儀器條件下，適當(dāng)提高柱溫、流速有利于縮短FGs的分離時間，提高分離度。

3.3 黃酮醇糖苷在成茶中的積累與分布

不同茶樹品種、產(chǎn)地的生長環(huán)境和加工工藝造成了茶葉品質(zhì)成分的差異。有研究發(fā)現(xiàn)，UV-B輻射的增強(qiáng)、溫度的升高均能夠提升植物體的FGs含量[24-25]。本研究發(fā)現(xiàn)，與浙江茶區(qū)相比，云南茶區(qū)緯度低、海拔高，紫外線強(qiáng)度相對較高，加上較高的環(huán)境溫度會誘導(dǎo)茶樹體內(nèi)的碳代謝，從而促進(jìn)多酚類物質(zhì)（FGs、兒茶素等）的積累;相反，在浙江茶區(qū)，緯度高，海拔低，春季溫度相對較低，有利于加速茶樹體內(nèi)的氮代謝，促進(jìn)茶樹體內(nèi)氨基酸的合成，而茶樹類黃酮物質(zhì)的合成相對受到抑制[26-27]。FGs對于茶湯的苦味、澀味具有增強(qiáng)作用，一般認(rèn)為酚氨比值低的茶鮮爽味高，適制綠茶，而酚氨比值高的茶苦味和澀味較高，適合加工成紅茶[18]。由此可見，云南茶區(qū)的茶葉更有利于加工成紅茶、黑茶等發(fā)酵茶，而浙江茶區(qū)的環(huán)境條件為綠茶的加工提供了品質(zhì)保證。

從品種的適制性來看，不同葉型茶樹品種的適制性也有差異。研究發(fā)現(xiàn)，與小葉種茶樹相比，大葉種茶樹的多酚類物質(zhì)含量高10%以上，因此更適合加工成紅茶，而小葉種茶樹的氨基酸含量高，適合制成綠茶[28]。戴偉東等[18]對FGs與茶樹品種適制性的研究發(fā)現(xiàn)，黃酮醇半乳糖苷化代謝旺盛的茶樹品種適制綠茶，而黃酮醇葡萄糖苷化代謝旺盛的茶樹品種適制紅茶。FGs組分中的K-3-G/K-3-Ga組分被認(rèn)為與茶湯澀味高度相關(guān)，其含量的積累變化規(guī)律對茶葉的適制性起到了指示作用。而在本研究中，成品紅茶中的K-3-G含量及其葡萄糖苷化程度（K-3-G與K-3-Ga的比值）均小于綠茶成品茶，推測茶葉在發(fā)酵過程中可能降低了K-3-G含量，從而使紅茶的澀味降低。

陳宗懋等[29]的統(tǒng)計結(jié)果顯示，紅茶中的總FGs含量要高于綠茶，這與本研究結(jié)果一致。但Peterson等[30]的研究結(jié)果與之相反，即在綠茶、烏龍茶中，總FGs含量則高于紅茶。Jiang等[14]通過UPLC方法，在3類成品茶中共檢測到18種FGs，發(fā)現(xiàn)綠茶中的山柰酚糖苷組分含量最高，而紅茶中的槲皮素糖苷含量占絕對優(yōu)勢。本研究結(jié)果則與之相反，即在綠茶中以槲皮素糖苷為主，而在紅茶中則以山柰酚糖苷為主。由此可見，茶葉中的FGs含量可能受多種因素影響而呈動態(tài)變化，對不同茶類FGs的積累與分布規(guī)律仍需深入研究。

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（責(zé)任編輯：徐 艷）

收稿日期：2020-05-14

基金項目：國家重點(diǎn)研發(fā)計劃項目（2016YFD0200900）;國家茶產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項（CARS-19）

作者簡介：董 方（1992-），男，陜西西鄉(xiāng)人，碩士研究生，研究方向為茶樹栽培生理與生態(tài)。（E-mail）18305811752@163.com

通訊作者：張群峰，（E-mail）hill@tricaas.com