姚啟倫　霍仕平　張俊軍

摘要： 以4個(gè)不同的玉米自交系為材料，對(duì)高溫、干旱處理后的苗期植株進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。玉米自交系響應(yīng)高溫和干旱脅迫的差異表達(dá)基因（DEGs）分別為6 966和6 272個(gè)，在高溫和干旱脅迫下4個(gè)玉米自交系相同的DEGs分別是705和871個(gè)。同時(shí)響應(yīng)高溫和干旱的DEGs有100個(gè)。在耐旱、耐熱性強(qiáng)的玉米自交系中鑒定出18個(gè)特異的DEGs，其中鋅指轉(zhuǎn)錄因子、WRKY轉(zhuǎn)錄因子、GT轉(zhuǎn)錄因子和B2熱激轉(zhuǎn)錄因子在脅迫響應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)控作用。KEGG通路分析結(jié)果表明，耐旱、耐熱性強(qiáng)玉米自交響應(yīng)高溫干旱脅迫的DEGs富集在生物學(xué)過(guò)程、分子功能、代謝過(guò)程、遍在蛋白代謝和氮代謝途徑5條通路。熱帶、亞熱帶玉米種質(zhì)的耐旱、耐熱性強(qiáng)于溫帶玉米種質(zhì)，可在熱帶、亞熱帶玉米種質(zhì)中有效篩選耐旱、耐熱基因。

關(guān)鍵詞： 玉米自交系;高溫、干旱脅迫;轉(zhuǎn)錄組;差異表達(dá)基因;通路

中圖分類號(hào)： S513 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A 文章編號(hào)： 1000-4440（2021）01-0029-09

Key genes and pathways of maize inbred lines responding to heat and drought stress

YAO Qi-lun1， HUO Shi-ping2， ZHANG Jun-jun3

（1.School of Advanced Agriculture and Bioengineering， Yangtze Normal University， Chongqing 408100， China;2.Chongqing Three Gorges Acodemy of Agricultural Science， Chongqing 404100， China;3.Heilongjiang Hetian Fengze Agriculture Science and Technology Development Co.， Ltd.， Harbin? 067500， China）

Abstract： Transcriptome sequencing of the four different maize inbred lines subjected to high temperatures and water deficits， was performed at the stage of seedling. In total， 6 966 heat-responsive and 6 272 drought-responsive differentially expressed genes（DEGs） were identified in the four maize lines. In addition， 705 and 871 DEGs were identified as being commonly associated with heat and drought stress， respectively. There were 100 DEGs responding to both heat and drought stress. Eighteen DEGs were identified in maize inbred lines with strong drought tolerance and heat tolerance. The zinc finger transcription factor， WRKY transcription factor， GT transcription factor and B2 heat shock transcription factor played key regulatory roles in stress response. Analyses of KEGG pathway enrichment showed that the pathways such as biological process， molecular function， metabolic process， protein ubiquitination metabolism and nitrogen metabolism were the most highly enriched in the maize lines tolerant to heat and drought. It can be concluded that tropical and subtropical maize is tolerant to heat and drought， implying that it is plausible to screen goal genes in the tropical and subtropical germplasm.

Key words： maize inbred lines;heat and drought stress;transcriptome;differentially expressed genes（DEGs）;pathways

高溫和干旱是抑制玉米生長(zhǎng)發(fā)育、制約玉米產(chǎn)量的主要非生物脅迫因子[1]。在干旱、半干旱區(qū)，玉米往往受到高溫干旱復(fù)合脅迫的不利影響[2-3]。全球有43 %的干旱、半干旱耕地，中國(guó)干旱、半干旱土地面積約占全國(guó)土地面積的近50 %[4-5]。隨著溫室效應(yīng)加劇，預(yù)計(jì)到本世紀(jì)末地表氣溫將上升1～5 ℃，1980-2008年，高溫脅迫導(dǎo)致全球玉米產(chǎn)量下降3.8%[6-7]。因此，篩選玉米耐旱、耐熱基因，培育耐旱、耐熱品種一直是玉米育種界面臨的重大課題。迄今關(guān)于高溫、干旱脅迫對(duì)玉米植株形態(tài)、生理生化和產(chǎn)量品質(zhì)不利影響的研究已有較多文獻(xiàn)報(bào)道。研究結(jié)果表明，高溫、干旱脅迫下，玉米葉片伸長(zhǎng)速率減慢，葉面積減小，莖稈變細(xì)[8-9];高溫、干旱會(huì)減少玉米葉綠素含量、擾亂光合系統(tǒng)，抑制光合作用[10-12];高溫、干旱會(huì)降低ADP-葡萄糖焦磷酸化酶、淀粉合成酶及分支酶活性，從而抑制碳水化合物合成[13-14];玉米灌漿期，高溫、干旱打破植株體內(nèi)激素間的平衡，減緩細(xì)胞分裂速率，縮小籽粒庫(kù)容，導(dǎo)致產(chǎn)量和品質(zhì)下降[15]。利用高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-seq）技術(shù)在分子水平解析植物對(duì)逆境脅迫的響應(yīng)是生物技術(shù)研究的熱點(diǎn)。通過(guò)分析生物細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄組的變化規(guī)律，可在分子水平探究特定生物學(xué)過(guò)程中基因組轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制[16-17]。玉米在傳播過(guò)程中逐漸分化形成了適應(yīng)其栽培環(huán)境的熱帶、亞熱帶和溫帶種質(zhì)，在分子水平研究不同玉米種質(zhì)的逆境響應(yīng)機(jī)制，可有效指導(dǎo)耐逆玉米基因的發(fā)掘與利用[18]。盡管轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-seq）技術(shù)已成功應(yīng)用于玉米逆境脅迫研究[19-20]，但在逆境脅迫研究中往往只涉及單個(gè)脅迫因子以及單一玉米自交系和雜交種。本研究選取熱帶、亞熱帶和溫帶種質(zhì)，且具有耐旱、耐熱性差異的玉米自交系為供試材料，設(shè)置高溫、干旱2個(gè)脅迫處理，結(jié)合高溫、干旱脅迫下不同玉米種質(zhì)的生理特性分析，在轉(zhuǎn)錄組水平分析不同種質(zhì)對(duì)高溫、干旱脅迫的分子響應(yīng)機(jī)制，以豐富植物逆境脅迫研究的數(shù)據(jù)資料，并為玉米耐旱、耐熱基因的篩選提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以長(zhǎng)江師范學(xué)院選育的4個(gè)玉米自交系Suwan-3、Suwan-10、Cim-5和Cim-16為供試材料，Suwan-3和Suwan-10分別以熱帶和亞熱帶玉米地方品種為基礎(chǔ)材料選育而成， Cim-5和Cim-16以國(guó)際玉米小麥改良中心（CIMMYT）的溫帶玉米群體為基礎(chǔ)材料選育而成。2016-2018年田間鑒定玉米自交系的耐旱、耐熱性，參照張麗梅等[21]的方法，分別計(jì)算各自交系經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量的耐旱指數(shù)（DTI）和耐熱指數(shù)（HTI），即干旱（或高溫）脅迫下經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量與正常條件（CK）下經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量的比值，根據(jù)經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量的DTI和HTI篩選出具有明顯耐旱耐熱性差異的熱帶、亞熱帶和溫帶玉米自交系Suwan-3、Suwan-10、Cim-5和Cim-16。 熱帶、亞熱帶玉米自交系Suwan-3、Suwan-10耐旱耐熱性強(qiáng)，經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量的DTI分別為0.86和0.83，HTI分別為0.91和0.93;溫帶玉米自交系Cim-5和Cim-16耐旱耐熱性弱，經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量的DTI分別為0.57和0.51，HTI分別為0.55和0.49。Suwan-3和Suwan-10作為耐旱、耐熱性強(qiáng)的玉米自交系（基因型）試驗(yàn)材料，Cim-5和Cim-16作為耐旱、耐熱性弱的玉米自交系（基因型）試驗(yàn)材料。

1.2 脅迫處理

高溫、干旱脅迫處理在人工氣候箱中進(jìn)行，4個(gè)玉米自交系種子浸種催芽后在控制條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度29 ℃（晝）/23 ℃（夜），相對(duì)濕度70%，每天光照12 h。待幼苗生長(zhǎng)至5葉1心，4個(gè)自交系各種植18株，其中6株作對(duì)照、6株作高溫脅迫處理、6株作干旱處理，共72株（每株1個(gè)營(yíng)養(yǎng)缽）。作對(duì)照的4株自交系幼苗置于上述人工氣候箱內(nèi)繼續(xù)生長(zhǎng);作高溫處理的4個(gè)自交系幼苗在40 ℃（晝）/34 ℃（夜）、相對(duì)濕度70%、每天光照12 h的高溫條件下生長(zhǎng)7 d;作干旱處理的4個(gè)自交系幼苗在溫度29 ℃（晝）/23 ℃（夜）、相對(duì)濕度20%、每天光照12 h的控水條件下生長(zhǎng)7 d。取每個(gè)自交系各個(gè)處理3株植株的葉片，葉片剪碎后分成2份分別用作生理指標(biāo)測(cè)定和mRNA轉(zhuǎn)錄組分析。

1.3 生理指標(biāo)測(cè)定

利用便攜式光合儀（LI-6400XT）室外檢測(cè)待測(cè)植株旗葉的葉綠素?zé)晒鈪?shù)值：光反應(yīng)最大熒光（F′m）、光反應(yīng)最小熒光（F′o）、暗適應(yīng)最大熒光（Fm）、暗適應(yīng)最小熒光（Fo）和穩(wěn)態(tài)熒光（Fs）;基于F′m、F′o、Fm、Fo和Fs，計(jì)算PS II潛在光量子產(chǎn)量（Fv/Fo）、PS II最大光化學(xué)量子產(chǎn)量（Fv/Fm）、PS II 有效光化學(xué)量子產(chǎn)量（ΦPSII）和光化學(xué)熒光淬滅系數(shù)（QP） [22-27]。采用李小芳等[28]的方法室內(nèi)檢測(cè)葉綠素含量、丙二醛（MDA）含量、過(guò)氧化物酶（POD）活性和超氧化物歧化酶（SOD）活性。數(shù)據(jù)分析采用Microsoft Excel 2010和DPS軟件。

1.4 葉片RNA提取

采用TRIzol（Invitrogen， Carisbad， CA， USA）法提取對(duì)照、高溫處理和干旱處理下的4個(gè)自交系的葉片RNA，用無(wú)RNA的DNA酶Ⅰ去除樣品中的DNA，同時(shí)檢測(cè)樣品中RNA濃度及其完整性（要求RNA完整值大于6.5），共構(gòu)建12個(gè)mRNA文庫(kù)。

1.5 轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)構(gòu)建與測(cè)序

經(jīng)片段化后的mRNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，篩選300～500 bp大小的cDNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)質(zhì)量經(jīng)Agilent 2100 Bioanalyzer（Agilent Technologies Santa Clata， CA， USA）檢測(cè)合格后，在Illumina HiSeq 2500測(cè)序平臺(tái)（海元莘生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司）上進(jìn)行。測(cè)序的基本原理是邊合成邊測(cè)序，采用Illumina novaseq 6000測(cè)序，雙端測(cè)序讀數(shù)150 bp、讀長(zhǎng)300 bp。在測(cè)序的流式細(xì)胞中加入4種熒光標(biāo)記的 dNTP、DNA 聚合酶以及接頭引物進(jìn)行擴(kuò)增，在每一個(gè)測(cè)序簇延伸互補(bǔ)鏈時(shí)，每加入一個(gè)被熒光標(biāo)記的 dNTP 就能釋放出相對(duì)應(yīng)的熒光，測(cè)序儀通過(guò)捕獲熒光信號(hào)，并通過(guò)計(jì)算機(jī)軟件將光信號(hào)轉(zhuǎn)化為測(cè)序峰，從而獲得堿基序列信息。

1.6 轉(zhuǎn)錄組序列分析

過(guò)濾掉接頭污染、低質(zhì)量（Q<30）和位置堿基氮含量> 5%的初始序列，獲取過(guò)濾后序列作后續(xù)分析。過(guò)濾后序列比對(duì)到玉米B73參考基因組（https：//download.maizegdb.rg/Zm-B73-REFERENCE-GRAMENE-4.0/Zm00001d.2.genomic. fa），利用RSEM（0.9.3版本）軟件作基因表達(dá)量估算。以P<0.05和|log2FC|≥1為標(biāo)準(zhǔn)，用edgeR軟件作差異表達(dá)基因（DEGs）分析 [29]。在NCBI的玉米基因數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取DEGs的功能信息，基于內(nèi)部perl腳本在maizeGDB網(wǎng)站上獲取DEGs的GO注釋。

1.7 差異表達(dá)基因（DEGs）的定量驗(yàn)證

以持家基因Actin為標(biāo)準(zhǔn)，選擇8個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行實(shí)時(shí)定量（qRT-PCR）分析，利用Primer 5.0軟件在線設(shè)計(jì)qRT-PCR反應(yīng)引物（表1），qRT-PCR反應(yīng)程序按照ABI2100反應(yīng)體系（Applied Biosystems， CA， USA）的操作要求進(jìn)行。各個(gè)試驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)，采用相對(duì)定量（2-△△Ct）法[30]估算基因表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米自交系對(duì)高溫、干旱的生理響應(yīng)

由表2可知，供試材料在單一脅迫因子高溫或干旱條件下，玉米自交系Cim-5和Cim-16 的過(guò)氧化物酶、超氧化物歧化酶活性以及丙二醛含量較對(duì)照顯著增加， 4個(gè)葉綠素?zé)晒鈪?shù)值（Fv/Fo、Fv/Fm、ΦPS II和QP）較對(duì)照顯著下降;熱帶、亞熱帶玉米自交系Suwan-3和Suwan-10 除丙二醛含量較對(duì)照顯著增加外，過(guò)氧化物酶、超氧化物歧化酶活性及4個(gè)葉綠素?zé)晒鈪?shù)值則無(wú)顯著變化，這表明在生理上熱帶、亞熱帶玉米種質(zhì)的耐旱、耐熱性強(qiáng)于溫帶種質(zhì)。

2.2 玉米自交系響應(yīng)高溫、干旱脅迫的轉(zhuǎn)錄組分析

由表3可知，測(cè)序得到的初始序列經(jīng)過(guò)除去接頭污染、低質(zhì)量（Q<30）和位置堿基氮含量> 5%的過(guò)濾處理后，4個(gè)自交系在對(duì)照、高溫和干旱處理?xiàng)l件下的過(guò)濾后序列變幅為44 560 000～54 040 000條，其過(guò)濾后序列占初始序列的比例在97.5 %以上，說(shuō)明轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)質(zhì)量良好。

在4個(gè)玉米自交系轉(zhuǎn)錄組中共檢測(cè)到6 966個(gè)響應(yīng)高溫脅迫的差異表達(dá)基因，自交系Suwan-3、Suwan-10、Cim-5和Cim-16分別有1 444、1 281、2 509和1 732個(gè)差異表達(dá)基因（圖1A）;在4個(gè)玉米自交系轉(zhuǎn)錄組中共檢測(cè)到6 272個(gè)響應(yīng)干旱脅迫的DEGs，自交系Suwan-3、Suwan-10、Cim-5和Cim-16分別有1 843、1 841、1 414和1 174 個(gè)差異表達(dá)基因（圖1B）;4個(gè)玉米自交系在高溫、干旱和高溫干旱脅迫下相同的DEGs分別是705、871和100個(gè)， 分別占差異表達(dá)基因總數(shù)的42%、52%和6%（圖1C）?？傮w上，溫帶玉米自交系響應(yīng)高溫、干旱脅迫的差異表達(dá)基因數(shù)（6 829）高于熱帶、亞熱帶玉米自交系（6 409）。這表明在分子水平，高溫、干旱脅迫對(duì)溫帶玉米自交系的影響更大。

2.3 熱帶、亞熱帶玉米自交系在高溫、干旱脅迫下特異的差異表達(dá)基因

為探明玉米自交系中的耐旱、耐熱關(guān)鍵基因，用在FPKM（1 000 000條序列中單個(gè)基因的數(shù)目）中比對(duì)上的Reads數(shù)目來(lái)度量基因表達(dá)水平，在P<0.05和|log2FC|≥1標(biāo)準(zhǔn)下，在耐旱、耐熱性強(qiáng)的熱帶、亞熱帶玉米自交系Suwan-3和Suwan-10 中篩選特異的差異表達(dá)基因。由表4可知，在耐旱、耐熱性強(qiáng)的玉米自交系Suwan-3和Suwan-10中有18個(gè)特異的差異表達(dá)基因同時(shí)響應(yīng)高溫和干旱脅迫。這18個(gè)差異表達(dá)基因極顯著差異表達(dá)，其中鋅指轉(zhuǎn)錄因子、WRKY轉(zhuǎn)錄因子、GT轉(zhuǎn)錄因子和B2熱激轉(zhuǎn)錄因子一致上調(diào)，這4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子在玉米響應(yīng)高溫、干旱脅迫中可能發(fā)揮關(guān)鍵的遺傳調(diào)控作用。

采用qRT-PCR技術(shù)，選擇8個(gè)響應(yīng)高溫、干旱的關(guān)鍵基因Zm00001d053913、Zm00001d018803、Zm00001d035139、Zm00001d002801、Zm00001d012325、Zm00001d015743、Zm00001d017597和 Zm00001d020614，驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組中差異表達(dá)基因的表達(dá)結(jié)果，盡管基因Zm00001d012325、Zm00001d015743、Zm00001d017597和 Zm00001d020614在轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中差異表達(dá)不顯著，但這4個(gè)基因在植物響應(yīng)高溫、干旱中發(fā)揮重要作用。由圖2可見(jiàn)，基因Zm00001d053913、Zm00001d002801、Zm00001d015743和Zm00001d017597上調(diào)表達(dá)，而基因Zm00001d018803、Zm00001d035139、Zm00001d012325和 Zm00001d020614下調(diào)表達(dá)，實(shí)時(shí)定量試驗(yàn)數(shù)據(jù)與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)（RNA-Seq prolifing）結(jié)果一致?；騔m00001d035139 （編碼MA3結(jié)構(gòu)域蛋白）在轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中上調(diào)表達(dá)，而在差異表達(dá)基因的定量驗(yàn)證中下調(diào)表達(dá)，這可能是在基因的定量驗(yàn)證中以持家基因Actin作參照的結(jié)果。

2.4 玉米自交系差異表達(dá)基因的GO注釋

通過(guò)對(duì)差異表達(dá)基因的GO（Gene Ontology）分析，可確定與差異表達(dá)基因相關(guān)的基因本體項(xiàng)（GO terms），追溯差異表達(dá)基因的GO分類條目，揭示差異表達(dá)基因與其功能調(diào)節(jié)關(guān)系。根據(jù)Kim等[29]的方法，顯示4個(gè)玉米自交系差異表達(dá)基因的GO分類注釋結(jié)果，由圖3中的A2 Vs A1和B2 Vs B1可見(jiàn)，熱帶、亞熱帶玉米自交系Suwan-3和Suwan-10響應(yīng)高溫脅迫的差異表達(dá)基因在腺嘌呤核苷結(jié)合、腺嘌呤脫氧核苷結(jié)合、脫氧核苷結(jié)合、核苷結(jié)合、細(xì)胞大分子代謝、細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器部分（Intracellur organelle part）、細(xì)胞器部分（Organelle part）、初級(jí)代謝過(guò)程、分子功能、催化活性、大分子代謝途徑和生物學(xué)過(guò)程12個(gè)基因本體項(xiàng)同時(shí)上調(diào)（A2 Vs A1和B2 Vs B1）;響應(yīng)干旱脅迫的差異表達(dá)基因在生物學(xué)過(guò)程、大分子代謝途徑、分子功能、代謝途徑、質(zhì)膜、脅迫響應(yīng)、蛋白質(zhì)代謝途徑以及堿基、核苷、核苷酸和核酸代謝途徑8個(gè)基因本體項(xiàng)共富集（A3 Vs A1和B3 Vs B1）;熱帶、亞熱帶和溫帶玉米自交系響應(yīng)高溫、干旱脅迫的差異表達(dá)基因僅在分子功能和生物學(xué)過(guò)程2個(gè)基因本體項(xiàng)同時(shí)上調(diào)，這表明高溫、干旱脅迫主要影響玉米分子功能和生物學(xué)過(guò)程。

2.5 熱帶、亞熱帶玉米自交系差異表達(dá)基因的KEGG通路

KEGG通路分析結(jié)果（圖4）表明，高溫、干旱脅迫下自交系Suwan-3和Suwan-10有30個(gè)通路受到調(diào)控，涉及16個(gè)生物學(xué)途徑、9個(gè)細(xì)胞組分和5個(gè)生物學(xué)功能通路，生物學(xué)過(guò)程、分子功能、代謝過(guò)程、遍在蛋白和氮代謝途徑5條通路上有大量差異表達(dá)基因富集。顯著性檢驗(yàn)閥值（P值）顯示，大量極顯著的差異表達(dá)基因富集在分子功能、代謝過(guò)程、遍在蛋白代謝、氮代謝途徑和生物學(xué)調(diào)節(jié)通路。由此推測(cè)這些通路在玉米響應(yīng)高溫、干旱脅迫中發(fā)揮主要作用。

3 討論

3.1 不同玉米種質(zhì)響應(yīng)高溫、干旱脅迫的關(guān)鍵基因

生產(chǎn)上高溫往往伴隨干旱，不同基因型的玉米種質(zhì)存在耐旱、耐熱性差異[4，7]。本研究轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果顯示，高溫、干旱脅迫下不同種質(zhì)來(lái)源的4個(gè)玉米基因型存在大量差異表達(dá)基因，4個(gè)玉米基因型均有100個(gè)相同的同時(shí)響應(yīng)高溫和干旱脅迫的差異表達(dá)基因，在耐旱、耐熱性強(qiáng)的玉米自交系中有18個(gè)特異的差異表達(dá)基因，由此推測(cè)這18個(gè)差異表達(dá)基因調(diào)節(jié)玉米對(duì)高溫、干旱脅迫的適應(yīng)性。植物對(duì)高溫、干旱脅迫的分子響應(yīng)是一個(gè)包括眾多轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[31]。熱激轉(zhuǎn)錄因子（HSFs）在玉米響應(yīng)高溫、干旱脅迫中發(fā)揮重要作用，植物中的HSFs包括A、B和C 3類，除響應(yīng)高溫脅迫外，HSFs還參與其他逆境脅迫的響應(yīng)[32]。本研究發(fā)現(xiàn)，高溫、干旱脅迫下，一個(gè)B類HSFs在耐旱、耐熱性強(qiáng)的玉米自交系中顯著上調(diào)。GT轉(zhuǎn)錄因子、WRKY轉(zhuǎn)錄因子和鋅指轉(zhuǎn)錄因子也是玉米響應(yīng)非生物脅迫的主要調(diào)控因子[33]。這3個(gè)轉(zhuǎn)錄因子同樣存在于本研究18個(gè)特異的差異表達(dá)基因編碼中。轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果表明，除轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子外，還有一些基因參與玉米響應(yīng)高溫、干旱脅迫，這些基因編碼重要的結(jié)構(gòu)蛋白和功能蛋白，其中Zm00001d035139和Zm00001d035475基因分別編碼MA3結(jié)構(gòu)域蛋白和異戊烯輔酶A脫氫酶。

3.2 不同玉米種質(zhì)響應(yīng)高溫、干旱脅迫的通路

通路分析是脅迫生物學(xué)中常用的方法。通路即代謝途徑，通過(guò)調(diào)控植物體內(nèi)物質(zhì)合成、生理活性和光合產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)，進(jìn)而響應(yīng)逆境脅迫[34]。生物學(xué)過(guò)程、代謝過(guò)程和生物學(xué)調(diào)節(jié)是植物體內(nèi)重要的代謝通路，參與能量物質(zhì)和生理活性物質(zhì)的合成與運(yùn)輸[35]。Zenda等[36]研究發(fā)現(xiàn)，耐旱玉米自交系在干旱脅迫下生物學(xué)過(guò)程、代謝過(guò)程和生物學(xué)調(diào)節(jié)通路上的差異表達(dá)基因高度富集，這與本研究KEGG通路分析結(jié)果一致。氮代謝途徑是植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的一條主要的生理代謝通路，直接參與植物細(xì)胞成分合成與細(xì)胞活性調(diào)節(jié)[33]。氮代謝途徑是旱生植物響應(yīng)干旱脅迫的關(guān)鍵通路，遍在蛋白作為調(diào)控因子參與植物逆境脅迫響應(yīng)，在高溫、干旱等逆境脅迫下遍在蛋白代謝通路上的差異表達(dá)基因高度富集[37]。本研究KEGG通路分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，耐旱、耐熱性強(qiáng)的玉米基因型在高溫、干旱脅迫下，氮代謝和遍在蛋白代謝通路上的差異表達(dá)基因顯著富集。

綜上，在高溫、干旱脅迫下，不同玉米種質(zhì)耐旱、耐熱基因通過(guò)差異表達(dá)調(diào)控其代謝通路，從而顯現(xiàn)生理上的耐旱、耐熱性差異，使玉米耐旱、耐熱基因的篩選成為可能?；谇捌谔镩g鑒定及本研究結(jié)果，熱帶、亞熱帶玉米種質(zhì)耐旱、耐熱性強(qiáng)于溫帶玉米種質(zhì)，在熱帶、亞熱帶玉米種質(zhì)中篩選耐旱、耐熱基因更有效。

參考文獻(xiàn)：

[1] KADAM N N， XIAO G， MELGAR R J， et al. Agronomic and physiological responses to high temperature， drought， and elevated CO2 interactions in cereals[J]. Advances in Agronomy， 2014， 127： 111-156.

[2] LOBELL D B， SCHLENKER W， COSTA-ROBERTS J. Climate trends and global crop production since 1980[J]. Science， 2011， 333： 616-620.

[3] GONG F， YANG L， TAI F， et al. “Omics” of maize stress response for sustainable food production： opportunities and challenges[J]. OMICS， 2014， 18： 714-732.

[4] 王曉琴，袁繼超，熊慶娥. 玉米抗旱性的研究及展望[J]. 玉米科學(xué)，2002，10（1）：57-60.

[5] 齊 健，宋鳳斌，劉勝群. 苗期玉米根葉對(duì)干旱脅迫的生理響應(yīng)[J]. 生態(tài)環(huán)境，2006，15（6）：1264-1268.

[6] 吳 昊，李燕敏，謝傳曉. 作物耐熱生理基礎(chǔ)與基因發(fā)掘研究進(jìn)展[J]. 作物雜志，2018（5）：1-9.

[7] 劉克祿，陳衛(wèi)國(guó). 植物耐熱相關(guān)基因研究進(jìn)展[J]. 植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2015，16（1）：127-132.

[8] 付 景，孫寧寧，劉天學(xué)，等. 高溫脅迫對(duì)玉米形態(tài)、葉片結(jié)構(gòu)及其產(chǎn)量的影響[J].玉米科學(xué)，2019，27（1）：46-53.

[9] KARIM M A， FRACHEBOUD Y， STAMP P. Effect of high temperature on seedling growth and photosynthesis of tropical maize genotypes[J]. Agronomy and Crop Sci， 2000， 184： 217-223.

[10]HASANUZZAMAN M， NAHAR K， ALAM M M， et al. Physiological， biochemical， and molecular mechanisms of heat stress tolerance in plants[J]. Int J Mol Sci， 2013， 14： 9643-9684.

[11]BIAT C A， GERATS T. Plant tolerance to high temperature in a changing environment： scientific fundamentals and production of heat stress-tolerant crops[J]. Front Plant Sci， 2013， 4： 273.

[12]KARIM M A， FRACHEBOUD Y， STAMP P. Photosynthetic activity of developing leaves of Zea mays less affected by heat stress than that of developed leaves[J]. Plant Physiol， 1999， 105： 685-691.

[13]BERRY J， BJOKMAN O. Photosynthetic response and adaptation to temperature in higher plants[J]. Annu Rev Plant Physiol， 1980， 98（673）： 491-543.

[14]WATERS A J， MAKAREVITCH I， NOSHAY J. Natural variation for gene expression responses to abiotic stress in maize[J]. The Plant Journal， 2017， 89： 706-717.

[15]裴志超，張偉強(qiáng)，周繼華，等. 干旱脅迫對(duì)不同基因型玉米產(chǎn)量及其構(gòu)成因素的影響[J]. 玉米科學(xué)，2019，27（4）：115-124.

[16]MCGETTIGAN P A. Transcriptomics in the RNA-seq era[J]. Curr Opin Chem Biol， 2013， 17： 4-11.

[17]CASARETTO J A， El-KEREAMY A， ZENG B， et al. Expression of OsMYB55 in maize activates stress-responsive genes and enhances heat and drought tolerance[J]. BMC Genomics， 2016， 17： 312-327.

[18]MEYER R S， PURUGGANAN M D. Evolution of crop species： genetics of domestication and diversification[J]. Nat Rev Genet， 2013， 14： 840-852.

[19]張 健，唐 露，張雅潔，等. 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)在植物水淹脅迫研究中的應(yīng)用[J]. 分子植物育種，2019，17（4）：1191-1202.

[20]LI P C， CAO W， FANG H M， et al. Transcriptic profiling maize （Zay mays L.） leaf response to abiotic stresses at the seedling stage[J]. Front Plant Sci， 2017， 8： 290-305.

[21]張麗梅，賀立源，李建生. 玉米自交系耐低磷材料苗期篩選研究 [J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2004，37（12）： 1955-1959.

[22]HORTENSTEINER S. Chlorophyll degradation during senescence[J]. Annu Rev Plant Biol， 2006， 57：55-77.

[23]CHEN J P， BURKE J J， XIN Z G. Chlorophyll fluorescence analysis revealed essential roles of FtsH11 protease in regulation of the adaptive responses of photosynthetic systems to high temperature[J]. BMC Plant Biology， 2018， 18： 11-24.

[24]DABROWSKI P， BACZEWSKA A H， PAWLUSKIEWICZ B， et al. Prompt chlorophyll a fluorescence as a rapid tool for diagnostic changes in PSII structure inhibited by salt stress in perennial ryegrass[J]. J Photochem Photobiol B， 2016， 157： 22-31.

[25]SU L Y， DAI Z W， LI S H. A novel system for evaluating drought-cold tolerance of grapevines using chlorophyll fluorescence[J]. BMC Plant Biology， 2015， 15： 82-94.

[26]SCHREIBER U， SCHLIWA U， BILGER W. Continuous recording of photochemical and non-photochemical chlorophyll fluorescence quenching with a new type of modulation fluorometer[J]. Photosynth Res， 1986， 10： 51-62.

[27]YU Q， SHEN Y， WANG Q， et al. Light deficiency and waterlogging affect chlorophyll metabolism and photosynthesis in Magnolia sinostellata[J]. Trees， 2019， 33： 11-22.

[28]李小芳，張志良. 植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo) [M]. 北京：高等教育出版社，2015.

[29]KIM D， LANGMEAD B， SALZBERG S L. HISAT： A fast spliced aligner with low memory requirements[J]. Nature Methods， 2015， 12（4）： 357-360.

[30]WU T D， NACU S. Fast and SNP-tolerant detection of complex variants and splicing in short reads[J]. Bioinformatics， 2010， 26： 873-881.

[31]BIANCHI V J， RUBIO M， TRAINOTTI L， et al. Prunus transcription factors： breeding perspectives[J]. Front Plant Sci， 2015， 6： 443-449.

[32]ZENDA T S， LIU S T， WANG X， et al. Comparative proteomic and physiological analyses of two divergent maize inbred lines provide more insights into drought-stress tolerance mechanisms[J]. Int J Mol Sci， 2018， 19： 3225.

[33]WANG H， WANG H， SHAO H， et al. Recent advances in utilizing transcription factors to improve plant abiotic stress tolerance by transgenic technology[J]. Front Plant Sci， 2016，7：67-73.

[34]LUO M， ZHAO Y， WANG Y， et al. Comparative proteomics of contrasting maize genotypes provides insights into salt-stress tolerance mechanisms[J]. J. Proteome Res， 2018， 17： 141-153.

[35]SHINDE H， TANAKA K， DUDHATE A， et al. Comparative de novo transcriptomic profiling of the salinity stress responsiveness in contrasting pearl millet lines[J]. Environ Exp Bot， 2018， 155： 619-627.

[36]ZENDA T S， LIU S T， WANG X， et al. Key maize drought-responsive genes and pathways revealed by comparative transcriptome and physiological analyses of contrasting inbred lines[J]. Int J Mol Sci， 2019，20：1268.

[37]AHMADI A， EMAM Y， PESSARAKLI M. Biochemical changes in maize seedlings exposed to drought stress conditions at different nitrogen levels[J]. J Plant Nutr， 2010， 33： 541-556.

（責(zé)任編輯：陳海霞）

收稿日期：2020-03-17

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31371633）;重慶市教委優(yōu)秀成果轉(zhuǎn)化項(xiàng)目（KJZH17133）

作者簡(jiǎn)介：姚啟倫（1964-），男，重慶萬(wàn)州人，博士，教授，主要從事玉米遺傳育種研究。（Tel）13908253365;（E-mail）yql641@aliyun.com