張丹 牛澤清 吳清濤 達(dá)娃 朱朝東**

（1.中國科學(xué)院動物研究所動物進(jìn)化與系統(tǒng)學(xué)院重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2.中國科學(xué)院大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 100000；3.西藏自治區(qū)高原生物研究所，西藏 拉薩 850000）

蜜蜂總科物種豐富，分布廣泛，在農(nóng)林生態(tài)系統(tǒng)中具有重要的作用[1-4]。根據(jù)Ascher等人統(tǒng)計(jì)，目前全世界已被描述的蜜蜂物種超過24000 種[5]。中國目前已記述種類為1432種，還有大量的物種待發(fā)現(xiàn)。在物種鑒定和系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系的解決過程中，物種的概念以及物種的界定仍是生物系統(tǒng)學(xué)以及分類研究中最基本的問題[6]。甚至對于同一個研究類群，不同的研究人員可能界定物種的標(biāo)準(zhǔn)也有差異。隨著多學(xué)科的結(jié)合與發(fā)展，關(guān)于物種概念的爭論與解釋一直存在，尤其是對于近緣種和隱存種的界定問題。

盜條蜂（Anthophora plagiata）中胸背板及腹部體毛顏色差異較大（從灰白色至狐紅色）。在前人的研究中，不同的學(xué)者根據(jù)體毛顏色的差異將其劃分為不同的物種[1]。根據(jù)生物學(xué)物種概念，一般認(rèn)為同一個物種雄性生殖器結(jié)構(gòu)形同。對于雄性物種，可以通過解剖生殖器，根據(jù)其結(jié)構(gòu)來判斷是否是相同的種[7]，但對于雌性個體，這種外表特征的變化，例如盜條蜂體毛顏色的變化，在一定程度上很難判斷是種內(nèi)還是種間變異。

在過去的十幾年中，DNA條形碼技術(shù)已發(fā)展成為一種成熟的技術(shù)，在生物學(xué)等相關(guān)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，同時也為生物分類學(xué)的發(fā)展帶來新的機(jī)遇[8]。研究者們通過DNA條形碼的方法，發(fā)現(xiàn)很多類群存在隱形種，例如對歐洲蝴蝶隱形種多樣性的研究[9]；除了隱存種，通過DNA條形碼技術(shù)可以將全變態(tài)昆蟲幼蟲和成蟲相聯(lián)系，這一方法已在水生昆蟲的鑒定與檢測等方面廣泛應(yīng)用[10]；DNA 條形碼技術(shù)的發(fā)展也為蜜蜂總科物種雌雄配對問題找到了一個突破口[11-13]，例如，2010 年Gibbs 等人在對加拿大淡脈隧蜂屬（Lasioglossum）的研究中，利用DNA 條形碼技術(shù)對該屬物種進(jìn)行雌雄配對，為后續(xù)該屬的研究奠定了基礎(chǔ)[14]。

本研究中我們結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和DNA 條形碼技術(shù)，研究盜條蜂（蜜蜂總科：蜜蜂科：條蜂屬）的毛色變異，探討不同毛色的個體是否為同一個物種的問題。

1 材料方法

1.1 標(biāo)本采集

標(biāo)本采集時間為2019—2020 年6 月、7 月和8 月，采集地點(diǎn)主要包括西藏自治區(qū)（定日縣、聶拉木、普蘭縣、亞東縣）以及青海省（格爾木市）。本研究主要以掃網(wǎng)的方法采集標(biāo)本，將采集到的標(biāo)本放入裝有硅膠的凍存管中，并制作干制標(biāo)本。

1.2 形態(tài)學(xué)鑒定

本研究中共計(jì)檢視22 頭盜條蜂標(biāo)本。所有檢視標(biāo)本都儲存在中國科學(xué)院動物研究所標(biāo)本館。本研究所用檢視標(biāo)本的顯微鏡為：Nikon SMZ1500 檢視標(biāo)本，并連接Nikon D7000 數(shù)碼相機(jī)多張拍攝，然后利用Helicon Focus 對照片進(jìn)行疊加，合成清晰的照片，后期使用Photoshop CS6軟件合成圖版。

1.3 樣本DNA提取、擴(kuò)增及測序

將所有采集的標(biāo)本制成針插標(biāo)本以后，選取其中12頭標(biāo)本進(jìn)行分子測序（見表1）。取標(biāo)本右側(cè)中足置于1.5ml 的離心管中加無水乙醇保存，將其帶回實(shí)驗(yàn)室后，測定其一段線粒體細(xì)胞色素C 氧化酶亞型I 基因序列（cytochrome oxidase subunit I,COI）。在DNA提取前，加液氮至離心管研磨樣本至粉末狀。本研究使用DNeasy Blood＆Tissue Kit（Qiagen GmbH，Hilden，Germany）試劑盒嚴(yán)格按照其說明書要求進(jìn)行基因組DNA 提取。COI 基因所用引物為C1-J1514 和C1-N2194[15-16]；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction,PCR）體系為30ul 體系（COI）：10μl ddH2O、15μl Premix TaqTM（LA TaqTMversion2.0plus dye）（TaKaRa）、1ul 單向引物（10μM）、3μl DNA 模板；反應(yīng)體系如下：94℃解鏈2 分鐘、45℃退火40 秒、72℃延伸1 分鐘（4個循環(huán)）、94℃解鏈40 秒、50℃退火40 秒、72℃1 分鐘（35 循環(huán)），72℃終延伸6 分鐘。獲取PCR 產(chǎn)物后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳（濃度1%）觀察后，將條帶清晰的PCR 原液送至公司雙向測序（測序儀規(guī)格：BigDye v3.1,ABI 3730xl DNA 分析儀）。

表1 分子測序樣本信息表

1.4 序列比對、物種界定及系統(tǒng)發(fā)生分析

獲得序列以后，將每條序列上傳至NCBI(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgiz)進(jìn)行初步比對，以確保每條數(shù)據(jù)都為蜜蜂科物種的序列。之后通過BioEdit［17］使用ClustalW進(jìn)行比對。由于COI是蛋白質(zhì)編碼基因，我們使用MEGA 7［18］檢測是否有終止密碼子的存在，并輔以手動調(diào)整。

本研究采用ABGD 的方法對物種整理好的序列進(jìn)行物種界定。將比對好的序列，提交至ABGD［19］在線分析網(wǎng)站（https://bioinfo.mnhn.fr/abi/public/abg-d/），參數(shù)設(shè)置如下：Pmin=0.001,Pmax=0.1,Steps=50,X=0.5,Nb bins=50,遺傳距離模型為K80。

本研究利用IQ-TREE［20］構(gòu)建最大似然法系統(tǒng)發(fā)育樹（ML），調(diào)用內(nèi)置ModelFinder 計(jì)算最佳模型為GTR+I+G，選擇吳氏條蜂Anthophora wuae(Brooks,1988)為外群。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)結(jié)果

盜條蜂Anthophora(Melea)plagiata(Illiger,1806)

Megilla plagiataIlliger,1806:140,♀.

Apis parietinaFabricius,1793:323.(Homonym).

Anthophora villosaHerrich-Sch?ffer,1840:73,♂.

Anthophora parietinavar.fulvocinereaDours,1869:168,♀,♂.

Anthophora turanicaFedtschenko,1875:10,♀.

Anthophora parietinavar.schenkiiDalla Torre,1877:162.

Anthophora simplicipesMorawitz,1880:344,♂.

Anthophora mlokosewitziRadoszkowski,1884b:24-25,♀.

Anthophora nigripesMorawitz,1887:205,♀.(Homonym).

Podalirius simplicipes semiaterFriese,1897:268,♀.

Anthophora pulcherrimaBingham,1897:532-533,♀,♂.

Podalirius parietinus nigrescensFriese,1897:270,♀.

Anthophora filchneraeFriese,1908:98,♂.

Anthophora khambanaCockerell,1910b:415,♀.

Anthophora khambanavar.atramentataCockerell,1911i:177,♀.

Anthophora pilosellaFriese,1919:278,♀,♂.

Anthophora semenoviKuznetzov-Ugamsky,1927:329.

Anthophora parietina pamiricolaHedicke,1930b:853,♀,♂.

Anthophora khambana chodjanaHedicke,1938:195.

Anthophora parietina baltistanicaHedicke,1940:85.

Anthophora parietina ladakhanaHedicke,1940:86.

Anthophora pulcherrima himalayaensisWu,1982b:413,♀,♂.

鑒別特征：雌體長12mm～16mm；唇基刻點(diǎn)粗大，唇基中央具縱脊；觸角鞭節(jié)第一節(jié)等長于2～4 節(jié)之和；顎眼距寬大于長，長約為寬的2/3；顏面被灰白色或灰黃色或黑色長毛；中胸背板被灰白色或黑色長毛（中胸背板及側(cè)板黑毛較多）；足一般被灰白色、灰黃色或黑色長毛，足內(nèi)側(cè)毛黑褐色；腹部背板第一節(jié)被灰黃色、或黃褐色或黑色長毛，腹部第2～5 節(jié)背板變化極大，灰黃色、黃褐色或狐紅色（詳見圖1）。

圖1 盜條蜂雌性體毛變換示意圖,標(biāo)尺：A-D：1mm

雄體長10mm～14mm；雄性唇基、上唇均為黃色；后足基跗節(jié)內(nèi)側(cè)端部2/3 處具1 齒狀突起；腹部第七背板中央呈半圓形凹陷；雄性同雌性，毛色變化極大，胸部及腹部第一節(jié)背板被灰白色、灰黃色、黃褐色或狐紅色長毛，腹部背板2～6 節(jié)被灰黃色、或狐紅色長毛；足被灰白色、灰黃色長毛（圖2A-E）；雄性生殖器結(jié)構(gòu)及第7、第8腹板結(jié)構(gòu)見圖2F-H［21-22］。

圖2 盜條蜂雄性示意圖

檢視標(biāo)本：1 ♀1♂，西藏阿里普蘭縣赤德村（E81.1427,N30.2954），4100m,19-VI-2020,吳清濤，張丹采;6♂，西藏亞東縣上亞東鄉(xiāng)（E88.9300,N27.5035），3724m,30-V-2020,吳清濤，張丹采;1♀8♂,西藏定日縣長所鄉(xiāng)（E87.4925,N28.5273），4109m,2-VII-2020,吳清濤，張丹采;1♀,西藏阿里普蘭縣赤德村（E81.1427,N30.2954），4100m,18-VII-2020,吳清濤，張丹采;1♀,西藏普蘭縣普蘭村（E81.2531,N30.2001），3837m,17-VII-2020,吳清濤，張丹采;1♂,青海格爾木市無極龍鳳宮附近（E94.3679,N35.8887），3709m,28-VII-2020,吳清濤，張丹采;1 ♀，西藏吉隆縣佩枯措附近（E85.5865,N28.7554），4566m，4-VIII-2019,吳清濤，張丹采;1 ♀，西藏聶拉木縣乃龍鄉(xiāng)古城堡附近（E86.3519,N28.7757），3859m,29-VII-2019，吳清濤，張丹采。

采訪植物記錄：Astragalus strictus(勁直黃芪)、Berberis lecomtei（光葉小蘗）、Astragalus adsurgens(斜莖黃芪)。

國外分布：歐洲，中亞。

國內(nèi)分布：吉林、內(nèi)蒙古、河北、北京、甘肅、青海、新疆、江蘇、浙江、四川、云南、西藏。

2.2 物種界定及鑒定結(jié)果

本研究中我們對采自西藏不同地方的12 個盜條蜂樣本正反向測序，共計(jì)獲得COI 序列21 條，通過對序列的比對最后獲得COI 序列的長度為576bp。將序列上傳至ABGD 網(wǎng)站分析，發(fā)現(xiàn)“Barcoding gap”存在于0.01-0.014之間，說明該樣本為一個物種。

圖3 利用IQ-TREE基于COI基因構(gòu)建的ML樹

本研究中，基于COI 基因的ABGD 分析得到了與形態(tài)分類同樣的結(jié)果，說明對于蜜蜂中的某些類群，毛色并不是一個穩(wěn)定的形態(tài)分類學(xué)特征。

致謝

衷心感謝中國科學(xué)院動物研究所喬格俠研究員及西藏自治區(qū)第二次青藏科考領(lǐng)導(dǎo)小組辦公室尹君老師對本研究的大力支持。