黃 彭 ，胡 森 ，舒 琳 ，秦 文 ，賴小嬌 ，吳 芳 ，2

（1.宜賓學(xué)院質(zhì)量管理與檢驗(yàn)檢測(cè)學(xué)部，四川 宜賓 644000；2.宜賓學(xué)院固態(tài)發(fā)酵資源利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 宜賓 644000；3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安 625000）

桑葚又名桑烏、桑果、桑棗，屬?？疲∕oraceae）桑屬（Morus L.）桑種（Morus alba L.）[1]，含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，如糖類、胡蘿卜素、VA、VB1、VB2、VC、有機(jī)酸、人體所需的18 種氨基酸，鈣、磷、銅、鋅等礦物質(zhì)元素[2-3]，以及各種活性成分，如花青素[4-5]、多糖[6]、多酚[7]、白藜蘆醇[8]，有“民間圣果”[9]、“中華果王”之美稱[10]。在醫(yī)學(xué)上，桑葚可增益肝腎、滋養(yǎng)血液產(chǎn)生益生因子，具有多種保健功能，可增強(qiáng)人體免疫力，促進(jìn)新陳代謝，屬藥食同源植物，深受廣大消費(fèi)者喜愛[11-12]。宜賓氣候溫和，現(xiàn)有桑園3.2 萬(wàn)hm2，位居四川省第二[13-14]。桑果柔軟多汁，采摘期較短，貯運(yùn)中易損傷腐爛變質(zhì)，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，影響其產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展[15]。因此對(duì)桑果進(jìn)行加工處理，減少果農(nóng)經(jīng)濟(jì)損失，增強(qiáng)桑葚產(chǎn)品市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力勢(shì)在必行。本文以宜賓桑葚為原料，研究了桑葚酒發(fā)酵工藝條件，并對(duì)其芳香物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定，獲得桑葚酒的最佳發(fā)酵工藝，以期為桑葚酒的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)，為提高桑葚加工附加值和促進(jìn)城鄉(xiāng)經(jīng)濟(jì)發(fā)展提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

桑葚：購(gòu)于宜賓安阜農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；白砂糖：購(gòu)于宜賓綠源超市；活性干酵母EC118、DV10 和KD：法國(guó)拉曼集團(tuán)產(chǎn)品，購(gòu)于上海杰兔工貿(mào)有限公司，固態(tài)發(fā)酵資源利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保藏。蛋白胨、瓊脂，北京奧博星生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；其余化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

5975C-7890A 型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，T6 型新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì)，TGL-16GB 型高速離心機(jī)，LDZX-75KBS 型高溫濕熱滅菌鍋，JJ060387 型超凈工作臺(tái)，DH1008 型水浴鍋，Hei-VAP Precision 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

1.2 方法

1.2.1 工藝流程

1.2.2 操作要點(diǎn)

1.2.2.1 清洗、榨汁

選擇新鮮無(wú)病變無(wú)腐爛的桑葚，去果柄，清水洗凈，打漿（固液比為 1∶1.5（g/mL））于 4 ℃保存?zhèn)溆肹16]。

1.2.2.2 成分調(diào)整

添加焦亞硫酸鈉調(diào)整SO2的濃度[17]，添加白砂糖調(diào)整糖含量，并用檸檬酸調(diào)整至pH 4.0，常溫靜止放置10 h。

1.2.2.3 酵母活化

取活性干酵母 EC118、DV10、KD 各 1 g，分別加入10 mL 2%葡萄糖溶液中，35 ℃恒溫水浴40 min 溶化。移取1 mL 酵母液于100 mL 滅菌后的YPD 液體培養(yǎng)基（1%酵母膏，2%葡萄糖，2%蛋白胨，自然pH，在121 ℃下高壓滅菌20 min）[18]中35 ℃恒溫培養(yǎng)48 h后，采用顯微鏡計(jì)數(shù)，調(diào)整菌種數(shù)為1×107CFU/mL，置于4 ℃冰箱中備用[19]。

1.2.2.4 主發(fā)酵

接入活化好的酵母菌種液，恒溫發(fā)酵7 d。

1.2.2.5 陳釀、過(guò)濾

原酒在15 ℃陳釀5 個(gè)月，經(jīng)離心過(guò)濾除去酒中的膠體、蛋白質(zhì)等成分，取上清液，制得桑葚發(fā)酵原酒[20]。

1.2.2.6 調(diào)配

根據(jù)桑葚發(fā)酵酒的酒精度、含糖量、總酸等指標(biāo)，用桑葚發(fā)酵原酒、白砂糖和檸檬酸等進(jìn)行調(diào)配，使之符合發(fā)酵酒的品質(zhì)要求。

1.2.2.7 滅菌

調(diào)配后的桑葚發(fā)酵酒進(jìn)行罐裝，放入溫度為70 ℃水浴鍋中，殺菌30 min[21]。

1.2.2.8 冷卻

冷卻至室溫后，放在陰涼通風(fēng)處保存。

1.2.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.3.1 發(fā)酵菌種的篩選

量取40 mL 桑葚果汁于250 mL 錐形瓶中，調(diào)整初始糖度為180 g/L，添加焦亞硫酸鈉調(diào)整SO2濃度為70 mg/L，靜置10 h 后，分別接種5%活化后的EC118、DV10、KD 酵母菌種液，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d 待發(fā)酵結(jié)束后，以桑葚發(fā)酵酒的殘?zhí)橇亢途凭葹橹笜?biāo)，篩選出適合桑葚發(fā)酵的菌株，作為試驗(yàn)后續(xù)發(fā)酵用菌種。

1.2.3.2 酵母接種量對(duì)發(fā)酵的影響

量取40 mL 處理好的桑葚果汁于250 mL 錐形瓶中，用白砂糖調(diào)節(jié)桑葚汁初始含糖量為180 g/L，調(diào)整SO2含量為70 mg/L，靜置10 h 后，分別接種3%、5%、7%、9%和11%活化好的KD 酵母菌種液，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵7 d。完成發(fā)酵后，以桑葚酒的酒精度和殘?zhí)橇繛橹笜?biāo)，篩選出合適桑葚酒發(fā)酵的酵母接種量。

1.2.3.3 初始糖度對(duì)發(fā)酵的影響

量取40 mL 處理好的桑葚果汁于250 mL 錐形瓶中，用白砂糖分別調(diào)節(jié)桑葚汁初始含糖量分別為140、160、180、200、220 g/L，調(diào)整 SO2含量為 70 mg/L，靜置10 h 后，接種活化后KD 酵母菌種，接種量為5%，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵7 d。完成發(fā)酵后，以桑葚酒的酒精度和殘?zhí)橇繛橹笜?biāo)，篩選出合適桑葚酒發(fā)酵的初始糖度。

1.2.3.4 SO2濃度對(duì)發(fā)酵的影響

量取40 mL 處理好的桑葚果汁于250 mL 錐形瓶中，用白砂糖調(diào)節(jié)桑葚汁初始含糖量為180 g/L，分別調(diào)整 SO2濃度分別為 30、50、70、90、110 mg/L，靜置10 h 后，接種活化后KD 酵母菌種，接種量為5%，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵7 d。完成發(fā)酵后，以桑葚酒的酒精度和殘?zhí)橇繛橹笜?biāo)，篩選出合適桑葚酒發(fā)酵的SO2濃度。

1.2.3.5 溫度對(duì)發(fā)酵的影響

量取40 mL 處理好的桑葚果汁于250 mL 錐形瓶中，用白砂糖調(diào)節(jié)桑葚汁初始含糖量為180 g/L，調(diào)整SO2濃度為70 mg/L，靜置10 h 后，接種活化后酵母菌種，KD 接種量為 5%，分別置于 20、25、30、35、40 ℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵7 d。完成發(fā)酵后，以桑葚酒的酒精度和殘?zhí)橇繛橹笜?biāo)，篩選出合適桑葚酒發(fā)酵的溫度。

1.2.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選定初始糖度、SO2濃度、酵母接種量、發(fā)酵溫度為主要影響因素，每個(gè)因素3個(gè)水平，以殘?zhí)呛亢途凭葹榭疾熘笜?biāo)，進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)[22]，正交試驗(yàn)因素水平見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.2.5 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.2.5.1 殘?zhí)橇?/p>

采用3，5-二硝基水楊酸法[23]測(cè)定。以吸光度為縱坐標(biāo)，以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，獲得總糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=1.09x-0.027，R2=0.995。

1.2.5.2 酒精度

使用100 mL 量筒量取50 mL 桑葚酒樣品并倒入蒸餾瓶中，用50 mL 蒸餾水將量筒洗滌3 次，并將洗滌液全部加入蒸餾瓶中。打開冷凝水，加熱至70 ℃開始蒸餾，用100 mL 容量瓶收集餾出液接近刻度線時(shí)，停止加熱。再用全自動(dòng)密度折光儀測(cè)定酒精度[24]。

1.2.5.3 香氣成分

采用GC-MS 聯(lián)用法進(jìn)行檢測(cè)[25-26]。色譜檢測(cè)條件參考游玲等[27]的方法，使用Lzp930 色譜柱（50 m×0.25 mm×0.25 μm），載氣為高純 N2，升溫程序：55 ℃保持 3 min，以 3.5 ℃/min 升溫至 150 ℃，保持 1 min，再以10 ℃/min 升溫至 170 ℃，保持 3 min，再以 10 ℃/min升溫至220 ℃，保持20 min。進(jìn)樣溫度220 ℃，檢測(cè)溫度 250 ℃，進(jìn)樣量 0.4 μL，分流比 10∶1。質(zhì)譜條件[28]：電子轟擊離子源（EI），溫度 230 ℃；四極桿溫度150 ℃；接口溫度280 ℃；電子能量70 eV；掃描質(zhì)量范圍35~400 m/z。利用NIST 11.L 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫(kù)進(jìn)行對(duì)比，按峰面積歸一化法求得各成分相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.2.5.4 感官品質(zhì)評(píng)價(jià)

邀請(qǐng)食品專業(yè)的老師和接受過(guò)品酒技能培訓(xùn)的同學(xué)共10 名，對(duì)桑葚酒的色、香、味等進(jìn)行綜合感官評(píng)分，感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)設(shè)計(jì)[29-31]如表2 所示。

表2 感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation criteria

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016 和SPSS 24.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌種對(duì)桑葚酒發(fā)酵的影響

菌種的品質(zhì)直接影響桑葚酒的發(fā)酵效果，接種發(fā)酵7 d 后桑葚酒殘?zhí)橇亢途凭热鐖D1 所示，3 種菌種發(fā)酵桑葚的能力不相同，其中KD＞DV10＞EC110。KD 酵母發(fā)酵后的酒精度顯著高于其余兩株菌種（P＜0.05），EC118 和 DV10 菌種的酒精度差異不顯著。KD 酵母發(fā)酵能力較強(qiáng)，其酒精度最高達(dá)到10.87%Vol，殘?zhí)橇孔畹停瑸?.92 g/L。因此桑葚發(fā)酵的優(yōu)勢(shì)菌種為KD 酵母。

圖1 不同菌種對(duì)桑葚發(fā)酵酒殘?zhí)橇亢途凭鹊挠绊慒ig.1 Effects of different strains on residual sugar content and alcohol content of mulberry wine

2.2 酵母接種量對(duì)桑葚酒發(fā)酵的影響

由圖2 可見，當(dāng)酵母接種量為3%時(shí)，發(fā)酵酒樣品中的酒精含量低，殘?zhí)呛扛哌_(dá)1.905 g/L，說(shuō)明接種量偏少時(shí)，酵母細(xì)胞增殖緩慢，導(dǎo)致發(fā)酵進(jìn)程緩慢，對(duì)發(fā)酵體系中糖等發(fā)酵基質(zhì)的利用不高，發(fā)酵不徹底。酵母接種量為5%~7%時(shí)，殘?zhí)呛肯鄬?duì)減小，其中當(dāng)接種量為5%時(shí)，發(fā)酵酒樣中酒精度達(dá)到最高（11.98%），這主要是隨著接種量的增加，酵母細(xì)胞增殖迅速，發(fā)酵迅速，發(fā)酵系統(tǒng)糖消耗快，發(fā)酵過(guò)程溫和，有利于酒精的積累和芳香物質(zhì)的形成。接種量超過(guò)7%后，殘?zhí)橇康淖兓鄬?duì)小，酒精含量差異大，主要是因?yàn)楫?dāng)接種量大時(shí)，酵母細(xì)胞大量繁殖，發(fā)酵系統(tǒng)中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗迅速，不利于發(fā)酵過(guò)程中芳香物質(zhì)的形成和積累，而且大量的代謝產(chǎn)物和次生代謝產(chǎn)物都會(huì)對(duì)發(fā)酵造成污染。所以選桑葚果酒發(fā)酵的酵母接種量為5%。

圖2 酵母接種量對(duì)桑葚酒殘?zhí)橇亢途凭鹊挠绊慒ig.2 Effects of yeast inoculations on residual sugar content and alcohol content of mulberry wine

2.3 初始糖度對(duì)桑葚酒發(fā)酵的影響

由圖3 可知，在整個(gè)桑葚發(fā)酵過(guò)程中，隨著初始糖含量的增加，桑葚酒中的酒精含量也隨之增加。初始糖度為140~160 g/L 時(shí)，發(fā)酵后的殘?zhí)橇肯鄬?duì)較少，酒精度較低，酒味清淡，桑葚風(fēng)味不明顯；初始糖度為180 g/L 時(shí)，酒樣酒精度較高，達(dá)到11.79%，酒體風(fēng)味濃郁；當(dāng)初始糖度為200 g/L 和220 g/L 時(shí)，殘?zhí)橇肯鄬?duì)較高，酒精度變化明顯，酒體口感偏甜。說(shuō)明偏高的初始糖度可能影響了酵母的生產(chǎn)代謝，抑制了發(fā)酵過(guò)程中酒精的積累。所以選桑葚果酒發(fā)酵的初始糖度為180 g/L。

圖3 初始糖度對(duì)桑葚酒殘?zhí)橇亢途凭鹊挠绊慒ig.3 Effects of initial sugar contents on residual sugar content and alcohol content of mulberry wine

2.4 SO2 濃度對(duì)桑葚酒發(fā)酵的影響

適量SO2能夠有效地抑制雜菌生長(zhǎng)，促進(jìn)果酒發(fā)酵順利進(jìn)行的同時(shí)還具有抗氧化等作用。但SO2過(guò)量不僅使酒的品質(zhì)變劣，還易對(duì)人體健康造成危害[17]。由圖4 可知，隨著SO2濃度的增加，殘?zhí)橇吭黾樱凭日w呈下降趨勢(shì)，并帶有刺激性氣味?？赡苁怯捎赟O2的增酸作用，抑制了酵母菌株的生長(zhǎng)，對(duì)糖的消耗能力減弱。當(dāng)SO2濃度為30 mg/L 時(shí)，桑葚酒中殘?zhí)呛孔畹停凭葦?shù)最高，酒香較濃郁，且刺激性氣味可以忽略不計(jì)。所以選擇SO2濃度為30 mg/L 作為桑葚酒發(fā)酵的添加濃度。

圖4 SO2 添加量對(duì)桑葚酒殘?zhí)橇亢途凭鹊挠绊慒ig.4 Effects of SO2 concentrations on residual sugar content and alcohol content of mulberry wine

2.5 發(fā)酵溫度對(duì)桑葚酒發(fā)酵的影響

適宜的發(fā)酵溫度對(duì)酵母的活性及香味物質(zhì)形成具有重要作用。當(dāng)溫度較低時(shí)，酵母生長(zhǎng)快，但發(fā)酵速度慢，導(dǎo)致發(fā)酵周期延長(zhǎng)；當(dāng)溫度較高時(shí)，發(fā)酵速度快，但容易損失香味物質(zhì)[32]。如圖5 所示，當(dāng)發(fā)酵溫度低于25 ℃時(shí)，由于酵母細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，糖利用率低，導(dǎo)致酒精積累少而殘?zhí)橇扛?；?dāng)溫度超過(guò)25 ℃時(shí)，酵母生長(zhǎng)可能受到抑制，導(dǎo)致發(fā)酵動(dòng)力不足，殘?zhí)橇扛呔凭鹊?，香味物質(zhì)降低；當(dāng)溫度控制在25 ℃時(shí)，發(fā)酵效果好，發(fā)酵過(guò)程平穩(wěn)且徹底，殘?zhí)橇孔畹?，?.65 g/L，酒精度最高，為11.57%。所以選擇25 ℃為桑葚酒的發(fā)酵溫度。

圖5 發(fā)酵溫度對(duì)桑葚酒殘?zhí)橇亢途凭鹊挠绊慒ig.5 Effects of fermentation temperatures on residual sugar content and alcohol content of mulberry wine

2.6 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表3 可見，以酒精度為考察指標(biāo)，影響桑葚酒發(fā)酵工藝各因素的主次順序?yàn)椋篈＞C＞B＞D；最佳發(fā)酵工藝條件為A2B2C3D2，即初始糖度180 g/L，酵母接種量5%，SO2濃度40 mg/L，發(fā)酵溫度25 ℃。以感官品質(zhì)為考察指標(biāo)，影響桑葚酒發(fā)酵工藝各因素的主次順序?yàn)椋篋＞A＞B＞C；最佳發(fā)酵工藝條件為A2B2C3D3，即初始糖度180 g/L，接種量5%，SO2濃度40 mg/L，發(fā)酵溫度27 ℃，由于D2和D3的感官品評(píng)分差異不顯著（P=0.876＞0.05），在實(shí)際操作中可忽略其影響，因此溫度選擇25 ℃。在A2B2C3D2條件下進(jìn)行3 次驗(yàn)證試驗(yàn)，制得桑葚酒感官品質(zhì)得分為81.7±1.24 分，酒精度為12.09%±0.16%，色澤明亮、無(wú)異雜味；風(fēng)格良好，具有桑葚獨(dú)特的滋味，更容易讓人接受。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Orthogonal test results

2.7 香氣成分檢測(cè)結(jié)果

利用GC-MS 法對(duì)最優(yōu)條件下發(fā)酵的桑葚酒進(jìn)行香氣成分分析，得離子峰圖6。由圖6 可以看出，各揮發(fā)性物質(zhì)的保留時(shí)間差異很大，大部分物質(zhì)在1~10 min 內(nèi)出現(xiàn)，其中甲醇、乙醛、乙醇等主要集中在5 min 左右，異戊醇、糠醛等的保留時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)，在14 min 后。

圖6 離子峰圖Fig.6 Diagram of ion peak

由表3 可見，檢測(cè)出相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于1%的化合物共11 種，這些物質(zhì)的存在，賦予了桑葚酒特有的香氣與風(fēng)味。其中乙醇的含量最高，甲醇和兩種酯類物質(zhì)相對(duì)含量較少；酯類物質(zhì)賦予桑葚酒果香、花香；苯乙醇和異丁醇的含量相對(duì)較高，其中苯乙醇屬于芳香醇類，是酵母的代謝產(chǎn)物，其感官閾值相對(duì)較低，所以香氣值很高[33]，它們?yōu)樯］鼐铺峁┝颂厥獾娘L(fēng)味。

表3 香氣成分檢測(cè)結(jié)果Table 3 Test results of aromatic substances

3 結(jié)論

本研究以宜賓本地產(chǎn)刺桑葚為原料，經(jīng)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化桑葚發(fā)酒工藝條件。結(jié)果表明，桑葚酒最佳發(fā)酵工藝條件為：初始糖度180 g/L，KD 酵母接種量5%，SO2濃度40 mg/L，發(fā)酵溫度25 ℃，發(fā)酵時(shí)間7 d。在此工藝條件下發(fā)酵出的桑葚酒，酒精度為12.09%±0.16%，感官得分81.7±1.24 分。利用GC-MS 聯(lián)用檢測(cè)出發(fā)酵酒主要香氣物質(zhì)為：醇類6種，醛類3 種，酯類2 種，這些化合物賦予了桑葚酒獨(dú)特的風(fēng)味。