袁志鷹 李 哲林美妤李子儀陳乃宏劉 芳李 亮*

(1.湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙 410208；2.中醫(yī)心肺病證辨證與藥膳食療重點研究室，湖南 長沙 410208；3.中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院藥物研究所，北京 100050）

抑郁癥是指以顯著而持久的情緒低落、活動能力減退、思維與認知功能遲緩為主要臨床特征的一類心境障礙慢性疾病,近年來發(fā)病率逐年攀升［1-3］。我國東漢醫(yī)圣張仲景在《金匱要略》 中對百合病、梅核氣、奔豚氣等病癥的論述,與現(xiàn)代醫(yī)學對抑郁癥的表述非常相似［4］。

百合雞子湯最早記載于《金匱要略》 卷中,為治療百合病的系列經(jīng)方之一。百合雞子湯由百合、雞子黃組方而成,百合甘、微寒,歸心、肺經(jīng),君以百合,甘涼清肺、清心安神；雞子黃味甘性平,歸心、腎、脾經(jīng),佐以雞子黃救厥陰之陰,安胃氣,胃為肺母,胃安則肺氣和而令行。二味藥材均為藥食同源,可歸屬于經(jīng)典的中醫(yī)藥膳經(jīng)方,具有產(chǎn)品開發(fā)的重大價值。目前尚未見百合雞子湯抗抑郁分子生物學研究報道,因此百合雞子湯抗抑郁作用值得我們深入研究。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子 (brain-derived neurotrophic factor,BDNF) 可與酪氨酸激酶受體 B(tyrosine kinase receptor B,TrkB) 結(jié)合激活BDNF/TrkB 信號傳導(dǎo)作用,為公認的神經(jīng)可塑性分子標記物［5-7］。磷脂酰肌醇-3 激酶/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(phosphatidylinositol-3 kinase/protein kinase B/mammalian target of rapamycin,PI3K/Akt/mTOR) 是BDNF/TrkB 的下游信號通路,在神經(jīng)元存活、神經(jīng)元再生以及突觸間信息傳遞等發(fā)揮著重要作用［8-11］。本實驗在前期對百合飲片標準化研究的基礎(chǔ)上［12-15］,慢性不可預(yù)見性溫和應(yīng)激(chronic unpredictable mild stress,CUMS) 法復(fù)制大鼠抑郁模型,并采用抑郁行為學指標結(jié)合蛋白質(zhì)印跡法(Western-Blot) 技術(shù)探討百合雞子湯在CUMS 動物模型中抗抑郁作用及其對BDNF 和下游PI3K/Akt/mTOR 信號通路水平產(chǎn)生的影響,揭示百合雞子湯抗抑郁作用機制,為百合雞子湯的深度開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 動物 SPF 級成年雄性SD 大鼠,體質(zhì)量230～250 g,購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司,實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK (湘) 2016-0002。在室溫(24±1)℃、相對濕度(55±10)%、光/暗周期12 h/12 h (光照時間7:00～19:00) 的條件下飼養(yǎng)。大鼠自購入起適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d,自由獲取食物和飲用水。

1.2 藥物與試劑 按照處方量配比(百合、雞子黃質(zhì)量比2 ∶1),稱取百合適量,加入10 倍量蒸餾水水煎提取1 h,收集水煎液,再用5 倍量水提取1 h,合并2 次水煎液,減壓濃縮至1 倍體積,50 ℃下加入雞子黃,混勻并加熱10 min,即得百合雞子湯,4 ℃保存待用。課題組前期發(fā)現(xiàn),百合雞子湯特征成分中王百合苷A 含量最高(11.05～13.76 mg/mL),而王百合苷B 含量為4.68～9.41 mg/mL,王百合苷C 含量為0.34～0.69 mg/ mL,王百合苷E 含量為0.60～0.87 mg/mL。

百合(20181201,湖南龍山和順百合種植基地) 經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學中藥鑒定教研室周小江教授鑒定為百合科植物卷丹Lilium lancifoliumThunb.的干燥鱗莖。氟西汀膠囊［批號B14201010566,禮來(蘇州) 制藥有限公司］；甲醇(批號1797207537,色譜純,德國默克公司)；乙腈(批號AH0154HC,色譜純,美國霍尼韋爾公司)。鼠抗大鼠BDNF (批號66292-1-Ig,美國Proteintech 公司)、兔抗大鼠TrkB (批號4603,美國Cell Signaling Technology 公司)、p-TrkB (批號4621,美國Cell Signaling Technology 公司)、PI3K (批號4292,美國Cell Signaling Technology 公司)、p-PI3K (ab182651,英國Abcam 公司)、AKT (批號4691,美國Cell Signaling Technology 公司)、p-Akt (批號4060,美國Cell Signaling Technology 公司)、mTOR (批號2983,美國Cell Signaling Technology 公司)、p-mTOR (批號5536,美國Cell Signaling Technology 公司)。RIPA 裂解液(批號P0013B,上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；SuperECL Plus超敏發(fā)光液(批號K-12045-D50,美國advansta 公司)。

1.3 儀器 電子分析天平(ML204,瑞士Mettler-Toledo 公司)；臺式超聲波清洗儀(KM-250DE,昆山美美超聲儀器有限公司)；循環(huán)真空水泵(SHZ-DIII,鞏義市予華儀器有限公司)；臺式冷凍離心機(H1650R,湖南湘儀集團)；電泳儀(DYY-6C,北京六一生物科技有限公司)；電泳槽(DYCZ-24DN,北京六一生物科技有限公司)；轉(zhuǎn)膜儀(DYCZ-40D,北京六一生物科技有限公司)。

2 方法

2.1 分組和給藥 36 只SD 大鼠按體質(zhì)量隨機分為6 組(CUMS 抑郁模型組、正常組、氟西汀陽性藥組、百合湯低劑量組、百合湯中劑量組、百合湯高劑量組),每組6 只。給藥量按照《中藥藥理實驗方法學》 中人體和動物體表面積用藥劑量換算法,陽性藥組氟西汀每天1.8 mg/kg、百合雞子湯低劑量每天2.7 g/kg、百合雞子湯中劑量每天5.4 g/kg、百合雞子湯高劑量每天10.8 g/kg,模型組與空白對照組用蒸餾水灌胃,每天10 mL/kg。造模灌胃同時進行,連續(xù)干預(yù)30 d。

2.2 造模 36 只SD 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d 后,除空白組外單籠飼養(yǎng),并接受各種應(yīng)激刺激,方法包括［16-17］24 h禁食、24 h 禁水、黑白顛倒、4 ℃冰浴5 min、夾尾1 min、潮濕墊料、空籠24 h、傾籠45 度、噪音3 h,每日隨機給予1～2種,同種不連續(xù)出現(xiàn),使大鼠不能預(yù)料刺激的發(fā)生以避免產(chǎn)生適應(yīng),持續(xù)30 d。

2.3 行為學檢測 采用強迫游泳實驗(forced swimming test,FST)。造模結(jié)束后,向高50 cm、直徑30 cm 的透明圓柱形筒中放入25 ℃清水,深度約35 cm,將大鼠放入其中,適應(yīng)1 min 后記錄后4 min 內(nèi)大鼠游泳不動時間(以大鼠漂浮不動,僅露出鼻孔保持呼吸,四肢偶爾滑動以保持身體不至于沉下去記為不動),以大鼠的絕望行為表示其抑郁行為。

2.4 Western blot 檢測

2.4.1 前額葉皮質(zhì)組織樣本收集及處理 行為學測試結(jié)束后,各組大鼠禁食不禁水24 h,用頸推脫臼法處死動物,通過剪刀鑷子等手術(shù)器械剪開顱骨,剝離筋膜,迅速取出大腦置于PBS 緩沖液中潤洗后用濾紙吸干水分,在冰上放置一個培養(yǎng)皿,在培養(yǎng)皿表面將所需要的前額葉皮質(zhì)在冰上剝離,液氮速凍,-80 ℃冰箱保存待用。

2.4.2 Western blot 分析 在凍存前額葉皮質(zhì)中加入組織裂解液,電動勻漿,離心,取上清液。配制4.8% 濃縮膠與10%分離膠,上樣,電泳至溴酚藍電泳至膠底部時終止電泳。將凝膠中的蛋白分子轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜(NC 膜)上,封閉2 h,4 ℃過夜,用PBST 緩沖液洗滌后加入相應(yīng)的一抗,室溫孵育90 min,4 ℃孵育過夜,PBST 洗滌3 次后,加入稀釋后的二抗與膜共同室溫孵育60 min 再洗滌3次,使用ECL 化學發(fā)光液與膜孵育1 min,濾紙吸盡液體,塑封膜將膜包裹雜交膜,在暗盒內(nèi)與X 膠片曝光5～120 min,顯影沖洗,將曝光后的底片掃描,并用quantity one 專業(yè)灰度分析軟件分析目標條帶的灰度值。

2.5 統(tǒng)計學分析 采用GraphPad Prism7.0 軟件進行分析,數(shù)據(jù)以() 表示,組間比較采用單因素方差分析統(tǒng)計。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠強迫游泳實驗 強迫游泳實驗中的不動時間可以反映出受試大鼠的絕望狀態(tài),大鼠的不動時間越長表明其越絕望。如圖1 所示,與正常對照組相比,模型組大鼠在強迫游泳實驗中的不動時間延長(P＜0.01)；與模型組相比,氟西汀組、百合雞子湯的低、中高劑量組大鼠在強迫游泳實驗中的不動時間縮短(P＜0.01)。從大鼠強迫游泳實驗中可以看出,在改善動物抑郁行為學試驗方面,百合雞子湯可改善大鼠抑郁癥狀,尤其是中、高劑量組效果更好。

圖1 大鼠強迫游泳實驗結(jié)果（n=6）

3.2 百合雞子湯對大鼠前額葉皮質(zhì)BDNF/TrkB-PI3K/Akt/mTOR 蛋白表達的影響 給予百合雞子湯持續(xù)干預(yù)30 d 后,與正常對 照組相比,模型組 BDNF、p-TrkB/TrkB、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR 的蛋白表達下降(P＜0.01)；相比于模型組,CUMS +百合雞子湯中、高劑量組的BDNF、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt 的蛋白表達升高(P＜0.01),氟西汀陽性藥組BDNF、p-TrkB/TrkB、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR 的蛋白表達升高(P＜0.05),CUMS +百合雞子湯低劑量組亦可升高mTOR蛋白表達水平,但對于BDNF、p-mTOR/mTOR 蛋白表達水平的升高,差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05),見圖2。

4 討論

CUMS 模型已經(jīng)成為一種廣泛使用的嚙齒類動物抑郁癥模型,該模型是讓大鼠或小鼠在持續(xù)時間段內(nèi)(10 d～8 周) 重復(fù)暴露于各種不可預(yù)測的輕度壓力下,而形成與抑郁癥患者相似的行為學或病理生理學代謝物方面的改變,是國內(nèi)外比較認可的抑郁模型,也是抗抑郁藥物評價的主要動物模型［18］。因此本實驗采用復(fù)制CUMS 抑郁大鼠模型研究百合雞子湯,且通過動物抑郁行為學來評價CUMS 抑郁模型是否復(fù)制成功。

大鼠生性喜歡探索,前期曠場實驗研究顯示,CUMS組大鼠水平穿越和垂直豎立次數(shù)均明顯降低。本實驗中,CUMS 造模導(dǎo)致模型組大鼠求生欲下降,強迫游泳實驗中不動時間延長,而百合雞子湯組、氟西汀組大鼠抑郁行為得到顯著改善,表明CUMS 抑郁模型復(fù)制成功,而百合雞子湯具有較佳的抗抑郁作用。

中醫(yī)藥復(fù)方對人體多靶點、多環(huán)節(jié)、多層次的作用機制在抑郁癥治療方面具有較大的潛力［19］。BDNF/TrkB 以及其下游的PI3K/Akt/mTOR 的信號通路,近年來在抑郁癥的發(fā)生及中藥干預(yù)的作用機制研究中引起了越來越多研究人員的關(guān)注［20］。袁麗等研究百合知母湯對抑郁癥大鼠行為學及海馬組織中BDNF、TrkB 表達變化的影響,試驗發(fā)現(xiàn)百合知母湯能通過BDNF/TrkB 蛋白的表達來改善抑郁癥［21］。另有研究顯示,甘草素 (liquiritigenin) 可以通過調(diào)節(jié)CUMS 小鼠海馬BDNF/TrKB 介導(dǎo)PI3K/Akt/mTOR 通路發(fā)揮抗抑郁作用［22］。在本實驗研究中,CUMS 降低了大鼠海馬組織的BDNF、p-TrkB、p-PI3 K、p-Akt、p-mTOR 的水平,而百合雞子湯干預(yù)能夠上調(diào)這些蛋白的表達水平。這個結(jié)果表明,BDNF/TrkB 及其下游的PI3K/Akt/mTOR 信號通路可能參與了百合雞子湯的抗抑郁作用,但是PI3K/Akt 下游信號分子環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP-response element binding protein,CREB)、FoxO3a 對百合雞子湯的抗抑郁作用需要做進一步深入的研究。