鄭喬木，周琰，陳錚，潘美伯，任敏潔,袁琨,董銀鳳，丁惠南

南京中醫(yī)藥大學(xué)護(hù)理學(xué)院(江蘇南京 210023)

卒中后抑郁(post-stroke depression，PSD)是腦卒中最常見(jiàn)并發(fā)癥之一，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，并增加腦卒中的病死率[1]。目前研究認(rèn)為PSD與下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸(hypothalamic-pituitary-adrenal axis，HPA)功能障礙及炎癥免疫等密切相關(guān)[2-3]。HPA軸激活后，促進(jìn)下丘腦室旁核皮質(zhì)激素釋放因子的表達(dá)增高，使腦垂體前葉分泌促腎上腺皮質(zhì)激素(adrenocorticotropic adrenocorticotropic hormone，ACTH)增多，最終使腎上腺皮質(zhì)分泌糖皮質(zhì)激素(皮質(zhì)酮或皮質(zhì)醇)增高，從而導(dǎo)致抑郁[4-5]。此外，炎癥反應(yīng)也參與其中[6]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究均發(fā)現(xiàn)，抑郁模型動(dòng)物或患者的外周血中的炎癥因子——腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor α，TNF-α)和白細(xì)胞介素-1β(interleukin 1β，IL-1β)增高[7-9]。敲除或抑制TNF-α或IL-1β可以減輕小鼠抑郁樣的行為[10-12]。近年研究發(fā)現(xiàn)，性別差異是影響PSD發(fā)生及治療預(yù)后的重要因素[13-14]，但機(jī)制不明。因此，基于前期研究發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)之上[15]，2016年12月至2018年3月，本研究應(yīng)用成年雌雄小鼠建立PSD模型。通過(guò)分析與比較雌、雄小鼠的抑郁樣行為以及血清中的激素和炎癥因子水平，揭示PSD模型小鼠的性別差異，為闡明PSD性別差異的機(jī)制及其治療干預(yù)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 100%蔗糖(國(guó)藥化工，上海)購(gòu)自南京基易生物有限公司。皮質(zhì)酮(CORT)試劑盒(貨號(hào) KGE009，R&D Systems，Minneapolis，MN，USA)、促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)試劑盒(貨號(hào)CEA836Mu，Cloud-Clone Corp，Rockville，MD，USA)、TNF-α試劑盒(貨號(hào) SEA133Mu，Cloud-Clone Corp，Rockville，MD，USA)和IL-1β試劑盒(貨號(hào) SEA563Mu，Cloud-Clone Corp，Rockville，MD，USA)均購(gòu)自南京迅貝生物有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 本研究分別應(yīng)用36只2～3月齡C57/BL6j雌、雄小鼠，均購(gòu)自南京青龍山動(dòng)物繁殖中心。小鼠適應(yīng)環(huán)境1周后，自由攝食和飲水，室溫維持在(22±2)℃，相對(duì)濕度50%～60%，光照/黑夜12 h交替。將雌、雄小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(Ctrl組)、腦缺血組(IR組)及腦缺血加孤養(yǎng)與束縛應(yīng)激組(IRS組)，其中，雄性小鼠每組各12只，雌性小鼠每組各10只。

1.3 動(dòng)物模型的制備

1.3.1 局灶性腦缺血再灌注損傷模型 術(shù)前禁食4～6 h，小鼠經(jīng)腹腔注射水合氯醛(3.5 mg/kg)麻醉。參照文獻(xiàn)[16]的方法，應(yīng)用Longa改良法，先分離并阻塞頸總動(dòng)脈，再分離小鼠的頸外動(dòng)脈，將殘端離斷并在殘端剪開，將6-0硅膠包裹的線栓(6023PK，Doccol Corp，美國(guó))從頸外動(dòng)脈的缺口插入，經(jīng)頸內(nèi)動(dòng)脈，至堵塞右側(cè)大腦中動(dòng)脈。缺血1 h后，取出線栓，結(jié)扎頸外動(dòng)脈缺口并松開頸總動(dòng)脈，進(jìn)行復(fù)灌。手術(shù)過(guò)程中小鼠的體溫均維持在36.5～37.0℃，術(shù)后自由攝食與飲水。

1.3.2 長(zhǎng)期的孤養(yǎng)與束縛應(yīng)激 參考文獻(xiàn)[17]的方法，將IRS組小鼠于手術(shù)前3 d開始孤養(yǎng)(1只/籠)，從腦缺血手術(shù)后第3天開始，將該組小鼠每天再給予2 h的束縛應(yīng)激(放置于有透氣孔的50 mL離心管中)，并持續(xù)4周。

1.4 糖水偏愛(ài)試驗(yàn) 蔗糖偏愛(ài)試驗(yàn)是基于小鼠對(duì)甜味偏好這一特點(diǎn)，評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的抑郁樣行為-即快感缺失。參照文獻(xiàn)[18]的方法，在為期3～7 d的實(shí)驗(yàn)中，將小鼠給予雙瓶飲水，其中一瓶為1%蔗糖水，另一瓶為飲用水。在整個(gè)過(guò)程中隨機(jī)調(diào)換兩個(gè)水瓶的位置，以防止小鼠的位置偏愛(ài)效應(yīng)。每天記錄小鼠飲用兩瓶液體的飲水量。通過(guò)計(jì)算小鼠對(duì)蔗糖偏愛(ài)率%=1%糖水的消耗量/(1%糖水的消耗量+純水消耗量)×100%。

1.5 曠場(chǎng)試驗(yàn) 曠場(chǎng)試驗(yàn)通常通過(guò)觀察小鼠在一定時(shí)間內(nèi)，在曠場(chǎng)中心區(qū)域及周邊區(qū)域的活動(dòng)情況，進(jìn)而評(píng)價(jià)小鼠的焦慮樣行為。參照文獻(xiàn)方法[19]，將小鼠放入50 cm×50 cm×30 cm無(wú)色不透明的箱子中，其中心區(qū)25 cm×25 cm，小鼠在中心區(qū)域自由活動(dòng)5 min，通過(guò)錄像及分析軟件Top Scan HR(Clever Sys Inc.，Reston，VA，USA)，記錄并小鼠在中心區(qū)的行走距離、停留時(shí)間和穿梭次數(shù)等。

1.6 強(qiáng)迫游泳試驗(yàn) 該實(shí)驗(yàn)是基于小鼠天生厭惡游泳的特點(diǎn)，通過(guò)分析小鼠水中游泳以尋找逃生路徑的方式，評(píng)價(jià)小鼠的“行為絕望”等抑郁樣行為。參考文獻(xiàn)方法[20]，將小鼠放置于15 cm×25 cm并盛水的圓柱桶中(水深14 cm，水溫24～26℃)6 min，應(yīng)用 Scan RH(Clever Sys Inc.)軟件分析小鼠在水中后4 min的活動(dòng)情況，比較不同組小鼠在水中的不動(dòng)時(shí)間。

1.7 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) 在孤養(yǎng)與束縛應(yīng)激處理4周后，經(jīng)腹腔注射10%水合氯醛麻醉小鼠，用1 mL注射器經(jīng)左心室抽取小鼠血液，室溫靜置2 h后，在4℃的低溫離心機(jī)(eppendoff，德國(guó))中，按3 000 r/min轉(zhuǎn)速，離心20 min，分離上層血清，并保存于-80℃冰箱。檢測(cè)外周血清中CORT、ACTH、TNF-α和IL-1β的詳細(xì)操作步驟按照各個(gè)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒說(shuō)明書的操作步驟進(jìn)行，檢測(cè)試劑盒的詳細(xì)信息見(jiàn)1.1。

2 結(jié)果

2.1 長(zhǎng)期的孤養(yǎng)與束縛應(yīng)激引起腦缺血模型小鼠體重的顯著減輕 基礎(chǔ)狀態(tài)下，雄性各組小鼠的體重差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，隨應(yīng)激處理時(shí)間的延長(zhǎng)，各組小鼠體重增加的交互效應(yīng)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F8，64=2.87，P=0.009)，并且時(shí)間的主效應(yīng)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F4，32=38.30，P=0.00)；組間兩兩比較結(jié)果顯示，與Ctrl組相比較，雄性IRS組小鼠在腦缺血后給予孤養(yǎng)與束縛應(yīng)激1周后出現(xiàn)顯著的體重減輕，而IR組無(wú)顯著變化，至應(yīng)激后3周和4周，與IR組相比，IRS組小鼠體重仍顯著減輕(圖1-A)?；A(chǔ)狀態(tài)下，雌性各組小鼠的體重差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，隨應(yīng)激處理時(shí)間的延長(zhǎng)，各組小鼠體重增加的交互效應(yīng)無(wú)顯著差異(F8，40=1.97，P=0.076)，而時(shí)間的主效應(yīng)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F4，20=6.60，P=0.001)，組間兩兩比較結(jié)果顯示，與Ctrl組相比，雌性IRS組小鼠分別在給予孤養(yǎng)與束縛應(yīng)激1周和4周后出現(xiàn)顯著的體重減輕(圖1-B)。

注：A:雄性；B:雌性；與Ctrl組比較*P<0.05，**P<0.001；與IR組比較#P<0.05，##P<0.001

2.2 長(zhǎng)期的孤養(yǎng)與束縛應(yīng)激引起腦缺血模型小鼠糖水偏愛(ài)率的顯著降低 與相應(yīng)的Ctrl組(86.18±3.65)相比，雄性IR組小鼠的糖水偏愛(ài)率(82.56±0.53)無(wú)顯著改變；而與Ctrl組和IR組相比，雄性IRS組小鼠在腦缺血后給予孤養(yǎng)與束縛應(yīng)激4周后糖水偏愛(ài)率(61.0±10.22)顯著降低(F2，26=46.92，P<0.001)；雌性IR組小鼠(92.0±1.0)與Ctrl組(87.50±2.63)相比，糖水偏愛(ài)率的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而雌性IRS組小鼠的糖水偏愛(ài)率(59.67±5.40)較Ctrl組和IR組相比都顯著降低(F2，23=200.30，P<0.001)。見(jiàn)圖2。

注：A:雄性；B:雌性；*與Ctrl組比較P<0.001；#與IR組比較P<0.001

2.3 長(zhǎng)期的孤養(yǎng)與束縛應(yīng)激引起雌性腦缺血模型小鼠抑郁樣的行為表現(xiàn) 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，雄性各組小鼠在曠場(chǎng)中心區(qū)域的活動(dòng)距離(圖3-A)(F2，26=0.86，P=0.43)、運(yùn)動(dòng)速度(圖3-C)(F2，26=0.93，P=0.40)、停留時(shí)間(圖3-E)(F2，26=0.16，P=0.85)及穿梭次數(shù)(圖3-G)(F2，26=1.22，P=0.31)均無(wú)顯著改變。雌性小鼠則不然，與Ctrl組相比，IRS組小鼠在曠場(chǎng)中心區(qū)域的活動(dòng)距離(圖3-B)(F2，25=5.13，P=0.014)、運(yùn)動(dòng)速度(圖3-D)(F2，25=6.21，P=0.006)、停留時(shí)間(圖3-F)(F2，25=5.42，P=0.011)及穿梭次數(shù)(圖3-H)(F2，25=6.25，P=0.006 1)等均顯著減少。同樣，在強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中，雄性小鼠各組之間的不動(dòng)時(shí)間無(wú)顯著差異(圖4-A)(F2，26=0.91，P=0.42)；而與其Ctrl組(124.90±41.20)相比較，雌性IRS組小鼠的不動(dòng)時(shí)間(182.90±28.18)顯著延長(zhǎng)(圖4-B)(F2，25=3.89，P=0.034)。

2.4 腦缺血及長(zhǎng)期的孤養(yǎng)與束縛應(yīng)激能增強(qiáng)雄性小鼠的炎癥反應(yīng) 與Ctrl組(71.92±38.42)相比，雄性IR組(191.40±56.39)和IRS組(170.60±77.60)小鼠外周血中TNF-α顯著升高(圖5-A)(F2，24=10.31，P=0.000 6)，同樣，與Ctrl組(9.38±5.45)相比，雄性IR組(40.74±12.44)和IRS組(35.16±7.43)小鼠外周血中IL-1β也顯著升高(圖5-C)(F2，24=31.53，P<0.0001)。但是，雌性各組小鼠外周血中TNF-α(F2，24=2.61，P=0.095)和IL-1β(F2，24=0.19，P=0.83)差異均統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖5。

注：A、C、E、G:雄性；B、D、F、H:雌性；*與Ctrl組比較P<0.05

注：A:雄性；B:雌性；*與Ctrl組比較P<0.05

注：A、C：雄性；B、D：雌性；與Ctrl組比較*P<0.01，**P<0.001

2.5 長(zhǎng)期的孤養(yǎng)與束縛應(yīng)激引起腦缺血模型小鼠激素水平的改變 與Ctrl組(21.63±22.21)和IR組(24.48±19.59)相比，雄性IRS組(57.79±31.77)小鼠的外周血血清中CORT的水平顯著增高(圖6-A)(F2，24=5.79，P=0.008 9)，而ACTH無(wú)顯著變化(圖6-C)(F2，24=0.34，P=0.71)。與Ctrl組(14.47±8.08)相比，雌性IRS組(36.81±29.05)小鼠外周血血清中的CORT升高；并且與Ctrl組(187.10±50.84)和IR組(195.60±59.93)相比，IRS組(306.90±38.09)小鼠外周血中ACTH均顯著升高(F2，24=15.81，P<0.000 1)。見(jiàn)圖6。

注：A、C：雄性；B、D：雌性；與Ctrl組比較*P<0.05，**P<0.001；與IR組比較#P<0.05，##P<0.001

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，與Ctrl組和IR組相比，IRS組雌、雄小鼠均出現(xiàn)顯著的體重減輕和糖水偏愛(ài)率的降低；通過(guò)曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)等行為學(xué)測(cè)試，雌性IRS組小鼠表現(xiàn)更為顯著的焦慮與抑郁樣的行為，并且外周血中CORT和ACTH的水平也顯著增高；而雄性IRS組小鼠外周血清中炎癥因子TNF-α和IL-1β以及CORT均顯著增高，其他變化不顯著。因此，研究結(jié)果表明長(zhǎng)期的孤養(yǎng)和束縛應(yīng)激引起腦缺血小鼠抑郁樣行為，并且雌性小鼠更加易感，性別反應(yīng)差異的機(jī)制可能與炎癥及下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA軸)有關(guān)。

炎癥是腦卒中和抑郁的重要病理機(jī)制。腦缺血后數(shù)小時(shí)即可誘發(fā)腦內(nèi)的炎癥反應(yīng)，并且可持續(xù)數(shù)周[21]。炎癥反應(yīng)不僅加重腦缺血和抑郁的癥狀，并且對(duì)疾病的發(fā)生及預(yù)后也產(chǎn)生重要的影響[22]?；A(chǔ)和臨床研究均發(fā)現(xiàn)，抑郁后的炎癥與免疫反應(yīng)具有性別差異，炎癥在抑郁中的作用在雄性表現(xiàn)更加明顯，炎癥反應(yīng)的程度與抑郁的癥狀呈正相關(guān)[23-24]。本研究發(fā)現(xiàn)，在腦缺血后給予長(zhǎng)期的孤養(yǎng)和束縛應(yīng)激促進(jìn)雄性小鼠外周血中致炎因子TNF-α和IL-1β顯著增高，而降低糖水偏愛(ài)率。但I(xiàn)RS組雌性小鼠外周血中TNF-α和IL-1β并無(wú)顯著差異，此差異的形成可能與性激素的作用有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)雌激素減輕應(yīng)激誘導(dǎo)雌性小鼠體內(nèi)的炎癥反應(yīng)[25]。此外，也與應(yīng)激引起HPA軸的激活導(dǎo)致皮質(zhì)酮的增高有關(guān)。CORT是調(diào)節(jié)體內(nèi)炎癥反應(yīng)的重要激素之一，能夠減輕炎癥反應(yīng)[26]。本研究結(jié)果顯示雌性IRS組小鼠外周血中CORT和ACTH水平顯著增高，提示長(zhǎng)期的孤養(yǎng)與束縛應(yīng)激顯著激活雌性腦缺血小鼠的HPA軸。

研究發(fā)現(xiàn)HPA軸的反應(yīng)具有性別差異[27]。CORT/皮質(zhì)醇增高是HPA軸激活的重要參考指標(biāo)。CORT調(diào)節(jié)機(jī)體對(duì)應(yīng)激的反應(yīng)，包括情緒反應(yīng)和生理反應(yīng)。皮質(zhì)酮的含量與應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)，CORT輕度增高增強(qiáng)機(jī)體對(duì)應(yīng)激反應(yīng)的適應(yīng)性行為，而CORT的大量增高與抑郁的形成有關(guān)[28]。本研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期的孤養(yǎng)和束縛應(yīng)激能促進(jìn)雌、雄腦缺血小鼠外周血中CORT的增高，但雌性小鼠外周血中的ACTH也增高。以往研究也表明，雌性小鼠在慢性應(yīng)激反應(yīng)后，外周血中CORT和ACTH水平較雄鼠更高[13]，并且腦內(nèi)激素相關(guān)的受體表達(dá)也上調(diào)[29]。因此，研究表明長(zhǎng)期的孤養(yǎng)和束縛應(yīng)激促進(jìn)雌性腦缺血小鼠HPA軸的持續(xù)激活。一方面，與女性的生理特性，如激素水平有關(guān)。另一方面，與女性的性格等心理因素也有一定的關(guān)系，女性天生敏感、細(xì)膩，易焦慮等[30]。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期的孤養(yǎng)和束縛應(yīng)激引起2～3月齡小鼠卒中后抑郁的形成具有性別差異，與炎癥反應(yīng)及HPA軸的激活有關(guān)。此研究結(jié)果為闡明卒中后抑郁的性別差異性的機(jī)制及治療提供理論基礎(chǔ)。后續(xù)將繼續(xù)深入闡明其作用機(jī)制并尋找適宜的治療干預(yù)措施。