張依琳，吳 凡，簡(jiǎn)紀(jì)常，蔡雙虎

海水養(yǎng)殖病原弧菌對(duì)魚(yú)類(lèi)宿主定植機(jī)制研究進(jìn)展

張依琳，吳 凡，簡(jiǎn)紀(jì)常，蔡雙虎

（廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院 // 廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524088）

定植是海水病原弧菌侵染宿主并引起弧菌病過(guò)程中最重要的環(huán)節(jié)之一，開(kāi)展弧菌定植分子機(jī)制研究對(duì)充分闡明弧菌的致病性從而制定有效防控策略極為重要。從特定結(jié)構(gòu)蛋白、生物膜、調(diào)控系統(tǒng)3個(gè)方面對(duì)海水養(yǎng)殖弧菌病原在魚(yú)類(lèi)腸道定植機(jī)制研究進(jìn)展進(jìn)行歸納總結(jié)，并提出研究展望，有助于更全面、深入認(rèn)識(shí)海洋病原弧菌對(duì)魚(yú)類(lèi)腸道的定植，對(duì)進(jìn)一步研究病原菌對(duì)魚(yú)類(lèi)腸道定植機(jī)制有重要參考價(jià)值。

弧菌；定植；生物膜；特定結(jié)構(gòu)蛋白；調(diào)控系統(tǒng)

近幾十年來(lái)，隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，有關(guān)海水養(yǎng)殖中弧菌病和弧菌性食物中毒的報(bào)道逐年增加，海水病原弧菌對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物造成的危害越來(lái)越嚴(yán)重。目前已報(bào)道的病原弧菌超120種，其中海水養(yǎng)殖動(dòng)物的病原弧菌包括霍亂弧菌（）、溶藻弧菌（）、費(fèi)氏弧菌（）、創(chuàng)傷弧菌（）、哈維弧菌（）、鰻弧菌（）和副溶血弧菌（）等[1]。這些病原可導(dǎo)致水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物大規(guī)模死亡，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。定植是海水病原弧菌侵染宿主最重要環(huán)節(jié)之一?；【谟形隔~(yú)的定植作用首先需要病原菌經(jīng)口穿越胃到達(dá)腸道，并在腸腔中抵御不良環(huán)境和腸黏膜免疫應(yīng)答[2]。穿透覆蓋在上皮細(xì)胞的黏液層并黏附于腸道上皮是弧菌在宿主腸道上定植的關(guān)鍵。在此過(guò)程中，弧菌通過(guò)增殖并開(kāi)啟毒力級(jí)聯(lián)反應(yīng)，表達(dá)特定結(jié)構(gòu)蛋白而對(duì)宿主實(shí)施有效的定植入侵：鞭毛為弧菌提供運(yùn)動(dòng)優(yōu)勢(shì)和沿胃腸道蠕動(dòng)的能力；菌毛促進(jìn)不可逆附著并形成穩(wěn)定的菌落；生物膜胞外基質(zhì)成分可抵御宿主對(duì)細(xì)菌的攻擊[3,4]。群體感應(yīng)系統(tǒng)（Quorum sensing system, QS）、雙組分系統(tǒng)（Two-component system, TCS）、環(huán)二鳥(niǎo)苷酸信號(hào)系統(tǒng)（cyclic diguanylate, c-di-GMP）等相關(guān)調(diào)控系統(tǒng)通過(guò)感應(yīng)胞外化學(xué)環(huán)境，調(diào)控弧菌特定結(jié)構(gòu)，從而使弧菌更好地適應(yīng)生存環(huán)境或促進(jìn)與宿主的共生關(guān)系[5-7]。

1 特定結(jié)構(gòu)蛋白

弧菌進(jìn)入宿主內(nèi)環(huán)境后，須穿透極黏稠的黏液層，方可到達(dá)腸上皮細(xì)胞并分泌毒素。而弧菌穩(wěn)定定植須依靠弧菌特定結(jié)構(gòu)功能的發(fā)揮。研究發(fā)現(xiàn)鞭毛可使細(xì)菌可逆地游動(dòng)到宿主細(xì)胞表面，并協(xié)同菌毛不可逆地附著在生物表面[8-9]。

1.1 鞭毛

1.1.1 鞭毛的結(jié)構(gòu) 弧菌鞭毛主要由出口裝置（Export apparatus）、基體（Motor）、鞭毛鉤（Hook）及鞭毛絲（Filament）組成。其中，基體（轉(zhuǎn)子和定子）和鞭毛絲對(duì)鞭毛運(yùn)動(dòng)能力有決定性影響。鞭毛基體的環(huán)結(jié)構(gòu)相互影響，大部分環(huán)結(jié)構(gòu)在鞭毛運(yùn)動(dòng)過(guò)程中不可或缺。研究表明，極性鞭毛轉(zhuǎn)子和定子組分缺失可部分或完全使弧菌失去運(yùn)動(dòng)能力[10-16]。在溶藻弧菌中，定子（PomA/B）為轉(zhuǎn)矩力發(fā)生器，對(duì)弧菌運(yùn)動(dòng)有最直接影響[11-13]。T環(huán)（MotX/Y）和C環(huán)（FliG）是定子直接的連接位點(diǎn)，缺失T環(huán)則無(wú)法形成定子[11,13-16]。H環(huán)（FlgO/P/T）則形成T環(huán)支架并參與T環(huán)組裝[17-19]。MS環(huán)（FliF/C）直接與C環(huán)連接[14,16]。上述任一環(huán)結(jié)構(gòu)缺失均可影響轉(zhuǎn)矩力產(chǎn)生，最終影響弧菌鞭毛的運(yùn)動(dòng)。有研究表明，缺失T環(huán)（Mot）的弧菌依然可形成正常的鞭毛，但因?yàn)槭ミ\(yùn)動(dòng)能力而大大降低弧菌在宿主表面的黏附能力，降低弧菌胞外多糖和生物膜形成能力[5]。

鞭毛絲是目前研究較多且可影響弧菌運(yùn)動(dòng)能力的結(jié)構(gòu)之一。海水病原弧菌鞭毛蛋白由5 ～ 6種鞭毛蛋白亞基組成，如霍亂弧菌、鰻弧菌有5種鞭毛蛋白亞基（FlaA/B/C/D/E）[20-21]，而副溶血弧菌、費(fèi)氏弧菌、創(chuàng)傷弧菌有6種（FlaA/B/C/D/E/F，其中FlaE/F是鞭毛同質(zhì)性蛋白）[22-25]。雖然所有鞭毛蛋白亞基分泌自同一裝置，但不同亞基卻行使不同功能。FlaA對(duì)弧菌形成正常形態(tài)和數(shù)量的鞭毛，發(fā)揮鞭毛運(yùn)動(dòng)、黏附等功能起重要作用[23,26-27]。缺失基因的鰻弧菌運(yùn)動(dòng)能力顯著減小，在宿主細(xì)胞表面定植延遲或無(wú)定植能力[28]?；【廾鞍讈喕鵉laE, F并不參與鞭毛絲組成，而是分泌到細(xì)胞外環(huán)境并直接啟動(dòng)胞外多糖（Exopolysaccharides, EPS）轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)生物膜胞外基質(zhì)的形成[24]。

1.1.2 鞭毛的功能 鞭毛有運(yùn)動(dòng)性、趨化性和黏附性等3個(gè)功能特性?；【倪\(yùn)動(dòng)性與趨化性可使弧菌對(duì)外界信號(hào)進(jìn)行適應(yīng)性反應(yīng)，通過(guò)改變鞭毛旋轉(zhuǎn)模式來(lái)控制運(yùn)動(dòng)。鞭毛的趨化和泳動(dòng)可促進(jìn)弧菌在宿主細(xì)胞上黏附，弧菌的黏附又是實(shí)現(xiàn)侵染的第一步[29]。溶藻弧菌FlrA和RpoN（σ54）結(jié)合，可通過(guò)激活Ⅱ類(lèi)鞭毛基因轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而激活Ⅲ、Ⅳ類(lèi)基因轉(zhuǎn)錄，后兩類(lèi)基因可促進(jìn)完整鞭毛結(jié)構(gòu)的形成[9,30]。干擾溶藻弧菌FlrA、FlrB或FlrC則導(dǎo)致其無(wú)法形成鞭毛（或形成的鞭毛短而?。诠腆w培養(yǎng)基上泳動(dòng)圈減小，對(duì)細(xì)胞的黏附數(shù)量減少[30]。但關(guān)于溶藻弧菌FlrABC是如何影響鞭毛形成相關(guān)基因的機(jī)制仍不清楚。鞭毛相關(guān)基因的表達(dá)能實(shí)現(xiàn)鞭毛的功能，最終使弧菌定植于正確位置。但從基因?qū)用鎭?lái)說(shuō)，弧菌鞭毛的合成與組裝受上游相關(guān)基因影響的分子機(jī)制仍不清晰。因此，進(jìn)一步探究弧菌鞭毛上游基因通路影響機(jī)制十分必要。

1.2 菌毛

IV型菌毛（Type Ⅳ pili, T4P）可增強(qiáng)弧菌在定植入侵過(guò)程中與宿主表面結(jié)合的能力，使弧菌從自由游動(dòng)的生存方式轉(zhuǎn)變?yōu)椴豢赡婀讨娣绞?，隨后形成微菌落，最終提高初始定植能力[4,2]。根據(jù)菌毛前體（T4P的菌毛亞基）特征和裝配系統(tǒng)的不同，分為A型和B型兩大類(lèi)[31]。

A型菌毛前體包括幾丁質(zhì)調(diào)控菌毛（Chitin-regulated pili，ChiRP，亦稱(chēng)PilA）和甘露糖敏感的血凝素（Mannose-sensitive hemagglutinin，MSHA），二者在促進(jìn)弧菌黏附宿主細(xì)胞和穩(wěn)定增殖方面發(fā)揮重要作用[31]。ChiRP使霍亂弧菌在含有甲殼素成分的表面更有效地形成生物膜，使細(xì)菌穩(wěn)定地獲取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[31]。對(duì)于含有幾丁質(zhì)成分的表面，副溶血弧菌可將其水解為幾丁質(zhì)，隨后通過(guò)增強(qiáng)ChiRP的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)菌-細(xì)菌之間的相互作用，使弧菌穩(wěn)定地存在于物質(zhì)表面[32]。MshA可促進(jìn)霍亂弧菌形成單層細(xì)胞（生物膜發(fā)育的中間階段），對(duì)形成成熟的生物膜極為重要[6,10]。副溶血弧菌（MshA1亞基發(fā)揮主要的功能）缺失顯著減少黏附蓋玻片的能力，表明MshA加強(qiáng)了弧菌對(duì)細(xì)胞的黏附能力和生物膜形成能力，促進(jìn)了弧菌在腸上皮細(xì)胞上的有效定植[32-33]。B型菌毛前體包括毒素共調(diào)菌毛（Toxin co-regulated pili，TCP）和Tad菌毛（Tight adherence pilus，亦稱(chēng)Flp亞型）[31]。霍亂弧菌TCP可增強(qiáng)細(xì)胞-細(xì)胞間的相互關(guān)系，促進(jìn)對(duì)小腸上皮細(xì)胞的黏附能力，進(jìn)而增強(qiáng)在腸道中的定植能力[2,34]。定植因子TcpA為T(mén)CP主要成分，通過(guò)增強(qiáng)菌毛-菌毛相互作用促進(jìn)弧菌自凝集（Auto-aggregation），并形成微菌落[35]。創(chuàng)傷弧菌Tad菌毛提高了細(xì)胞自凝集能力，促進(jìn)生物膜形成和對(duì)牡蠣的生態(tài)位定植（Niche colonization）[36-37]。

總之，不同海水病原弧菌使用不同菌毛行使不同的功能，這與菌毛基因結(jié)構(gòu)功能和接觸環(huán)境有關(guān)。關(guān)于弧菌菌毛的研究雖較多，且發(fā)現(xiàn)T4P對(duì)包括微菌落和生物膜在內(nèi)的定植因子有影響，但僅局限于宏觀層面，菌毛相關(guān)基因是如何影響定植的分子機(jī)制亟待研究。筆者通過(guò)列舉代表性例子對(duì)不同菌毛類(lèi)型進(jìn)行歸納，為更廣泛研究弧菌菌毛奠定基礎(chǔ)。

2 生物膜

當(dāng)宿主細(xì)胞表面固定的細(xì)菌數(shù)量增加，細(xì)菌鞭毛形成被抑制，并刺激細(xì)菌分泌胞外多糖，最終形成微菌落和穩(wěn)定的具三維結(jié)構(gòu)的生物膜[5,10]。生物膜是微生物生存的主要形式，是一種或多種微生物通過(guò)胞外多糖組成的基質(zhì)凝集在一起形成的細(xì)胞多聚體。生物膜中的微生物細(xì)胞之間存在密切的信號(hào)通訊，且表現(xiàn)出與浮游生活時(shí)完全不同的生理代謝特征。生存于生物被膜內(nèi)的病原菌往往能分泌更多的毒素及其他致病因子，破壞寄主組織或細(xì)胞。同時(shí)能通過(guò)增加水解酶表達(dá)量、增加分子外排泵的工作效率、減少抗生素滲透等控制方式，大幅提高病原微生物的耐藥性。

2.1 胞外多糖在生物膜中的作用

EPS是覆蓋于生物膜表面的成分，可促進(jìn)細(xì)菌凝集，允許形成褶皺菌落和薄膜，對(duì)不同外界信號(hào)“微調(diào)”（Fine tune）生物膜生活方式[36]。EPS為菌落提供受保護(hù)環(huán)境并允許黏附于宿主腸上皮細(xì)胞[5-6]。目前關(guān)于弧菌胞外多糖報(bào)道較多的有弧菌多糖（Vibrio polysaccharides, VPS）、莢膜多糖（Capsular polysaccharide, CPS）和共生多糖（Symbiosis polysaccharide, Syp）。

研究表明，VPS是霍亂弧菌EPS生物合成的重要組成成分，缺失株在小鼠腸道定植能力明顯下降[38-40]。創(chuàng)傷弧菌c-di-GMP依賴(lài)的生物膜和褶皺多糖（for biofilm and rugose polysaccharide,）與霍亂弧菌VPS位點(diǎn)具有同源序列，基因編碼的EPS能促進(jìn)細(xì)菌的不可逆表面黏附，并形成生物膜和褶皺菌落，從而抵御不良環(huán)境[36, 41-42]。

CPS雖在不同弧菌中對(duì)生物膜有不同調(diào)控作用，但其均是為了幫助弧菌避開(kāi)不良環(huán)境，使弧菌更好地生存。副溶血弧菌CPS對(duì)生物膜形成有促進(jìn)作用，并使菌落形態(tài)從半透明變成不透明[43-44]。與此相反，創(chuàng)傷弧菌CPS通過(guò)降低胞外聚合物基質(zhì)（EPM）疏水性，使成熟的生物膜分離或擴(kuò)散，從而使細(xì)菌避開(kāi)不良化學(xué)環(huán)境[36,44-46]。因此，創(chuàng)傷弧菌缺失（CPS-生物合成集群編碼的18個(gè)基因之一）后，CPS合成缺失，生物膜合成能力提高[45]。

Syp可顯著提高弧菌的定植能力。費(fèi)式弧菌Syp位點(diǎn)18個(gè)基因中的14個(gè)基因敲除后，除和外，其他12個(gè)基因缺失均可顯著減少褶皺菌落和薄膜（pellicle）的形成，嚴(yán)重?fù)p害其在幼年夏威夷烏賊（）腸道中的定植能力[47]。創(chuàng)傷弧菌與Syp同源的生物膜調(diào)控的第二多糖位點(diǎn)（Regulation of biofilm development of second polysaccharide locus,）的表達(dá)可促進(jìn)生物膜形成，但偏向于自凝集表型(Auto-aggregation phenotype)[48]。促進(jìn)細(xì)胞-細(xì)胞自凝集，形成的凝集體也增強(qiáng)了對(duì)牡蠣的生態(tài)位定植[48]。

胞外多糖對(duì)細(xì)菌形態(tài)的形成和抵御外界不良環(huán)境有重要意義。不同弧菌定植宿主所分泌的胞外多糖也略有不同，卻均有使弧菌更好地在宿主細(xì)胞內(nèi)定植和增殖的功能。

2.2 生物膜形成及功能

生物膜在定植過(guò)程中發(fā)揮極為重要的作用，是弧菌成功入侵宿主并進(jìn)入早期感染階段的關(guān)鍵樞紐，也是聯(lián)系各定植影響因子的中心樞紐。生物膜形成經(jīng)過(guò)可逆黏附階段、不可逆黏附階段、分泌胞外基質(zhì)成分的早期階段、有三維結(jié)構(gòu)的成熟生物膜階段、分散-釋放階段等五大階段[8]。生物膜形成第一階段由鞭毛運(yùn)動(dòng)發(fā)起?；【廾够【竭_(dá)宿主腸上皮細(xì)胞并啟動(dòng)可逆性接觸，在化學(xué)環(huán)境適宜時(shí)轉(zhuǎn)變?yōu)椴豢赡娓街?，進(jìn)入生物膜早期發(fā)展階段[28,49]。當(dāng)弧菌生物膜趨于成熟，鞭毛編碼基因逐漸被抑制，菌毛基因逐漸被激活，這一過(guò)程部分由c-di-GMP信號(hào)系統(tǒng)調(diào)控[6]。隨著弧菌密度增高，生物膜生存環(huán)境和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)受到限制，此時(shí)弧菌啟動(dòng)群體感應(yīng)系統(tǒng)，鞭毛基因再次被表達(dá)并激活，運(yùn)動(dòng)能力上升，允許弧菌從生物膜中分離并游動(dòng)附著到新的化學(xué)環(huán)境，促進(jìn)生存與傳播增殖。生物膜的功能主要為細(xì)菌提供保護(hù)，使其免受各種壓力，如營(yíng)養(yǎng)限制和干燥，以及在感染期間抗菌劑和宿主免疫防御[50]。雙組分系統(tǒng)可促進(jìn)生物膜形成，進(jìn)而起抵御不良外界環(huán)境影響的作用[51-52]。

3 定植調(diào)控

定植調(diào)控系統(tǒng)既能通過(guò)調(diào)控DNA、RNA或蛋白表達(dá)，影響弧菌鞭毛、菌毛、胞外基質(zhì)和生物膜等結(jié)構(gòu)，也能通過(guò)系統(tǒng)間相互調(diào)控，共同影響海水病原弧菌的腸道定植能力。近年來(lái)，調(diào)控系統(tǒng)相關(guān)研究趨于成熟，為研究潛在藥物靶點(diǎn)提供基礎(chǔ)。

3.1 群體感應(yīng)系統(tǒng)

QS為細(xì)菌間通訊系統(tǒng)，通過(guò)感應(yīng)種群密度分泌相應(yīng)胞外化學(xué)信號(hào)，進(jìn)而控制下游基因的表達(dá)，以適應(yīng)環(huán)境變化[7]?；【ㄟ^(guò)QS主要調(diào)節(jié)子（Quorum sensing master regulator, QMR）調(diào)控胞外多糖、生物膜、鞭毛、菌毛等的表達(dá)。ValR/OpaR（溶藻弧菌/副溶血弧菌）可通過(guò)抑制aphA表達(dá)，促進(jìn)胞外多糖（CPS）和生物膜合成，并抑制鞭毛運(yùn)動(dòng)[53-59]。相反，霍亂弧菌可負(fù)調(diào)控VPS、生物膜表達(dá)，運(yùn)動(dòng)能力[60]。此外，QMR能調(diào)控菌毛的表達(dá)。研究證明，霍亂弧菌可負(fù)調(diào)控毒力蛋白霍亂毒素（Cholera toxin, CT）和菌毛TCP的表達(dá)[3]。不同弧菌雖共享一套QS，但對(duì)下游基因的調(diào)控卻千差萬(wàn)別，說(shuō)明不同弧菌通過(guò)促進(jìn)或抑制相關(guān)基因表達(dá)對(duì)自然環(huán)境或宿主進(jìn)行適應(yīng)性響應(yīng)，以維持生存和傳播。

自誘導(dǎo)物為QS起始通訊分子信號(hào)，依賴(lài)QS對(duì)弧菌定植影響因子產(chǎn)生間接調(diào)控作用。哈維弧菌有三套經(jīng)典的群體感應(yīng)系統(tǒng)：LuxM/N系統(tǒng)、LuxS/PQ系統(tǒng)和CqsS/A系統(tǒng)，分別調(diào)控HAI-1、AI-2和CAI-1，這些系統(tǒng)依賴(lài)于細(xì)胞密度調(diào)控生物發(fā)光、生物膜、胞外多糖和金屬蛋白酶等。此外，在哈維弧菌中還發(fā)現(xiàn)，第4套QS系統(tǒng)H-NOX/HqsK，以NO作為自誘導(dǎo)物，促進(jìn)鞭毛的產(chǎn)生和生物膜的形成[61]。而同一種弧菌QS之間有相互調(diào)控關(guān)系。霍亂弧菌為CAI-1的調(diào)控因子，其缺失株卻是AI-2超級(jí)生產(chǎn)菌株，AI-2使細(xì)菌從包裹厚厚胞外基質(zhì)的休眠狀態(tài)中復(fù)蘇，以促進(jìn)生物膜分散傳播[62]。目前研究發(fā)現(xiàn)一些自誘導(dǎo)物在理論QS的調(diào)控狀態(tài)下還有溫度依賴(lài)性和濃度依賴(lài)性。溶藻弧菌11種乙酰高絲氨酸內(nèi)酯中的-(3-氧代癸酰基)-高絲氨酸內(nèi)酯在高濃度（40 ～ 100 μmol/L）情況下抑制生物膜形成，在低濃度下促進(jìn)生物膜形成，且在16℃時(shí)促進(jìn)效果最佳[63]。關(guān)于弧菌自誘導(dǎo)物對(duì)定植因子的影響仍需更多研究。除溶藻弧菌，其他弧菌誘導(dǎo)物是否有濃度、溫度依賴(lài)性，不同弧菌QS之間是否存在相互影響關(guān)系，還需進(jìn)一步探索。

近年來(lái)，在弧菌QS逐漸成熟的基礎(chǔ)下，學(xué)者們開(kāi)始把QS作為潛在藥物靶點(diǎn)研究抑菌作用。4-氟類(lèi)似物-5-五亞甲基二醇-2,3-二酮作為哈維弧菌AI-2抑制劑，能抑制細(xì)菌發(fā)光、生物膜合成和生長(zhǎng)[64]。而十一酸與生長(zhǎng)素吲哚乙酸或吲哚丁酸組成的復(fù)合物能下調(diào)QS相關(guān)基因，最終抑制生物膜形成[65]。肉桂醛衍生物（cinnamaldehyde derivatives）也被證明能抑制哈維弧菌運(yùn)動(dòng)與生物膜形成[66]。

海水養(yǎng)殖病原弧菌群體感應(yīng)的研究逐漸成熟，近幾年也逐漸應(yīng)用于潛在新型藥物靶點(diǎn)研究。但大部分弧菌QS對(duì)菌毛的影響少有報(bào)道，QMR與定植相關(guān)結(jié)構(gòu)（如鞭毛和菌毛之間的級(jí)聯(lián)反應(yīng)）仍存在較多未知因子，有必要進(jìn)行更多研究，為研發(fā)新型靶基因藥物提供參考。

3.2 雙組分調(diào)控系統(tǒng)

TCS是弧菌監(jiān)控胞外環(huán)境的信號(hào)系統(tǒng)，在弧菌菌應(yīng)對(duì)不良環(huán)境時(shí)通過(guò)啟動(dòng)該機(jī)制，進(jìn)行適應(yīng)性自我保護(hù)反應(yīng)[5,60]。當(dāng)弧菌感應(yīng)到胞外環(huán)境變化時(shí)，TCS通過(guò)一系列磷酸化事件將胞外信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞信號(hào)，最終激活/抑制下游基因或蛋白質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，TCS廣泛參與調(diào)控弧菌的多種生物學(xué)功能，包括細(xì)菌生長(zhǎng)、宿主識(shí)別、毒力因子表達(dá)、致病性和耐藥性等[67]。本節(jié)主要圍繞常見(jiàn)的影響定植相關(guān)因子的弧菌TCS進(jìn)行綜述。

EPS受TCS的調(diào)控?；魜y弧菌VpsR/T為傳感器組氨酸激酶（Sensor histidine kinase, HK），直接結(jié)合上的vps-Ⅱ位點(diǎn)，以促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄[68]。轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白VpsR/VpsT能促進(jìn)VPS和生物膜形成，但對(duì)于其相應(yīng)的反應(yīng)調(diào)節(jié)子（Response regulator, RR）仍有待研究。副溶血弧菌有同源的。促進(jìn)表達(dá)，直接結(jié)合位點(diǎn)并啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄[69-70]。然而、是否是規(guī)范的RR還有待研究。費(fèi)氏弧菌與其他弧菌不同，的表達(dá)受到復(fù)雜的TCS調(diào)控。第1感應(yīng)激酶RscS激活第2感應(yīng)激酶SypF，SypF能分別激活兩個(gè)RR SypG和VpsR，兩個(gè)RR共同激活的轉(zhuǎn)錄[71-72]。此外，費(fèi)氏弧菌Syp還有自我調(diào)節(jié)機(jī)制：Syp促進(jìn)和轉(zhuǎn)錄表達(dá)，促進(jìn)Syp轉(zhuǎn)錄表達(dá)和弧菌定植[73]。然而，又與（RR）相互拮抗：磷酸化時(shí)促進(jìn)形成，去磷酸化時(shí)使磷酸化，只有去磷酸化的方可促進(jìn)Syp合成[73-75]。創(chuàng)傷弧菌有類(lèi)似于SypG的RR RbdG[47]。然而，關(guān)于是否行使與相似的功能，創(chuàng)傷弧菌是否有與費(fèi)式弧菌相似的通路仍有待進(jìn)一步研究。

QS中的LuxU-LuxO為經(jīng)典的TCS，已在多種弧菌中報(bào)道[76-77]。在低弧菌密度下，HK啟動(dòng)LuxU轉(zhuǎn)移磷酸基團(tuán)至LuxO，通過(guò)負(fù)調(diào)控QMR調(diào)節(jié)下游相關(guān)毒力因子的表達(dá)。以霍亂弧菌為例，CqsS、LuxQ、VpsV和VpsS（HKs）通過(guò)LuxU-LuxO正調(diào)控VpsR/T，進(jìn)而促進(jìn)生物膜形成和弧菌定植[60]。QS本身的TCS又受VarS/VarA的調(diào)控。研究表明，VarS/VarA可調(diào)控弧菌毒力、生物膜形成和共生能力?；魜y弧菌VarS/VarA激活轉(zhuǎn)錄小RNAs（small RNAs, sRNAs），sRNAs與CsrA結(jié)合并抑制其活性，而CsrA可通過(guò)LuxO正調(diào)控表達(dá)水平，最終影響下游毒力因子[20,78]。與霍亂弧菌VarS/VarA同源的費(fèi)氏弧菌GacS/GacA，有與霍亂弧菌相似的GacA-CsrB-CsrA級(jí)聯(lián)調(diào)控，能調(diào)控費(fèi)氏弧菌對(duì)多種烏賊發(fā)光器官的早期定植[79]。創(chuàng)傷弧菌GacS/GacA同樣有類(lèi)似于霍亂弧菌Csr調(diào)節(jié)通路，但是否調(diào)控QS仍未可知[80]。溶藻弧菌VarS/VarA可調(diào)節(jié)（膠原蛋白酶，collagenase）的表達(dá)，進(jìn)而負(fù)調(diào)控生物膜形成[30]。然而目前仍不清楚溶藻弧菌是否也有Csr的反應(yīng)過(guò)程。對(duì)于VarS/VarA調(diào)控途徑，需進(jìn)一步厘清不同弧菌的信號(hào)、目標(biāo)和替代途徑。

鞭毛合成數(shù)量與運(yùn)動(dòng)受自身TCS的調(diào)控?；魜y弧菌極性鞭毛轉(zhuǎn)錄需形成MS環(huán)、C環(huán)和Ⅲ型分泌系統(tǒng)的核心蛋白，TCS方可直接激活桿（Rod）和鉤（Hook）的轉(zhuǎn)錄[81]。FlhF/FlhG鞭毛生物合成調(diào)節(jié)系統(tǒng)在極性鞭毛中形成特定的鞭毛模式。鞭毛調(diào)控檢查點(diǎn)形成后，即使FlhF/FlhG改變（如FlhG缺失），也能維持一定的鞭毛活性和適度運(yùn)動(dòng)[81]。溶藻弧菌的FlhF和FlhG分別正和負(fù)調(diào)控了極性鞭毛的數(shù)量，然而目前未被證實(shí)為T(mén)CS[82-83]。

TCS對(duì)毒力因子的級(jí)聯(lián)調(diào)控存在多種未知因子，值得進(jìn)行更多探索。目前對(duì)弧菌TCS的研究還處在發(fā)現(xiàn)階段，需發(fā)現(xiàn)更多雙組分調(diào)控途徑以補(bǔ)充TCS網(wǎng)絡(luò)構(gòu)架。

3.3 c-di-GMP信號(hào)系統(tǒng)

c-di-GMP是機(jī)體廣泛存在的第二信使，在弧菌生長(zhǎng)和機(jī)體行為發(fā)揮重要的協(xié)調(diào)作用?；【鷱母∮蔚淖杂捎蝿?dòng)生活方式切換到生物膜生活方式主要?dú)w因于c-di-GMP水平的增加[6,84]。c-di-GMP在細(xì)胞內(nèi)的合成和降解分別由鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶（DGC）和磷酸二酯酶（PDE）完成。鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶能催化兩分子的GTP反應(yīng)成c-di-GMP，而磷酸二酯酶的EAL結(jié)構(gòu)域能將c-di-GMP水解為pGpG，磷酸二酯酶的HD-GYP結(jié)構(gòu)域能將c-di-GMP水解為2分子GMP。c-di-GMP主要參與弧菌運(yùn)動(dòng)、生物膜形成等進(jìn)程。

c-di-GMP促進(jìn)弧菌胞外多糖、生物膜合成。霍亂弧菌c-di-GMP依賴(lài)性vpsR可通過(guò)σ70/RNAP激活啟動(dòng)子[85]。而作為c-di-GMP受體，需有c-di-GMP方可進(jìn)行亞細(xì)胞定位和具備活性，并,直接結(jié)合啟動(dòng)子啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄[86]。在副溶血弧菌中，和有GGDEF-EAL基序，當(dāng)高度表達(dá)時(shí)，主要發(fā)揮PDE功能，降解c-di-GMP，從而促進(jìn)側(cè)生鞭毛基因的表達(dá)，減少基因的表達(dá)和生物膜形成；而ScrGΔEAL逆轉(zhuǎn)了ScrG的活性，此時(shí)作為c-di-GMP抑制集群運(yùn)動(dòng)并促進(jìn)表達(dá)[43-44]。

c-di-GMP可促進(jìn)弧菌鞭毛、菌毛合成。其可直接結(jié)合MshE ATPase（促進(jìn)近表面運(yùn)動(dòng)行為和初始表面黏附）而正調(diào)控MshA（甘露糖敏感血凝素）組裝和功能的發(fā)揮[87]。c-di-GMP對(duì)菌毛MshA的促進(jìn)作用反過(guò)來(lái)抑制了極性鞭毛運(yùn)動(dòng)[87-88]。而c-di-GMP和菌毛基因?qū)Ρ廾斑\(yùn)動(dòng)的具體影響機(jī)制仍不清楚，c-di-GMP對(duì)生物膜具體調(diào)控路徑仍有待研究。

4 總結(jié)與展望

弧菌病在海水養(yǎng)殖過(guò)程中逐漸呈暴發(fā)性流行趨勢(shì)，因此，深入闡明弧菌侵染宿主每個(gè)環(huán)節(jié)的分子機(jī)制對(duì)開(kāi)發(fā)防控弧菌藥物和制定防控弧菌病策略尤為重要?；【谒a(chǎn)動(dòng)物腸道定植為病原侵染的重要環(huán)節(jié)，目前已成為研究熱點(diǎn)。隨著研究的深入，人們逐漸認(rèn)識(shí)到，盡管弧菌屬病原在定植過(guò)程使用類(lèi)似的調(diào)節(jié)蛋白和信號(hào)調(diào)控系統(tǒng)，但每種弧菌由于自身特異的基因結(jié)構(gòu)以及所接觸宿主和環(huán)境條件的不同而不斷進(jìn)化，使弧菌更好地與宿主形成共生體關(guān)系，從而導(dǎo)致不同弧菌的定植機(jī)制差異較大。雖然目前對(duì)弧菌定植影響因子研究有較多報(bào)道，但主要集中于人魚(yú)共患的霍亂弧菌和副溶血弧菌等，而對(duì)溶藻弧菌和哈維弧菌等水生動(dòng)物病原的研究明顯不足，不利于揭示海水養(yǎng)殖弧菌病大規(guī)模流行的內(nèi)在原因和流行規(guī)律，因此，有必要加強(qiáng)水生動(dòng)物病原弧菌定植機(jī)制的研究。

弧菌定植的調(diào)控因子及調(diào)控系統(tǒng)研究尚不全面。從調(diào)控因子層面來(lái)說(shuō)，目前僅知鞭毛、菌毛通過(guò)影響弧菌運(yùn)動(dòng)性，胞外多糖通過(guò)影響生物膜形成來(lái)調(diào)控弧菌定植，但是可能還有其他的調(diào)控因子參與其中，這些調(diào)控因子的具體功能是什么、各因子對(duì)弧菌定植過(guò)程是獨(dú)立調(diào)控還是協(xié)同調(diào)控及其相互作用的機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。在調(diào)控系統(tǒng)方面，群體感應(yīng)系統(tǒng)研究已較為成熟，但依然存在一些問(wèn)題：弧菌平行系統(tǒng)之間的相互關(guān)系及其對(duì)QS的調(diào)控方向和能力產(chǎn)生的影響、單因素細(xì)菌密度對(duì)QS的影響還不知曉。對(duì)于雙組分調(diào)控系統(tǒng)和c-di-GMP信號(hào)系統(tǒng)，研究較多的也僅集中在霍亂弧菌、副溶血弧菌和費(fèi)氏弧菌等人魚(yú)共患弧菌，研究重點(diǎn)僅集中于調(diào)控系統(tǒng)感應(yīng)細(xì)胞外環(huán)境變化引起調(diào)控系統(tǒng)磷酸化或c-di-GMP濃度變化，引起下游調(diào)控基因表達(dá)發(fā)生變化，從而調(diào)控弧菌定植能力。但上述調(diào)控系統(tǒng)具體調(diào)控哪些基因，調(diào)控的基因是轉(zhuǎn)錄因子還是調(diào)控因子，轉(zhuǎn)錄因子或調(diào)控因子間如何形成網(wǎng)絡(luò)協(xié)同調(diào)控等問(wèn)題需要進(jìn)一步深入研究。

此外，需從單個(gè)基因、基因組、宏基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組和代謝組等層面研究與弧菌、宿主相互作用相關(guān)的大分子物質(zhì)的結(jié)構(gòu)、功能和調(diào)控機(jī)制，從而更深入解析弧菌定植、生存和增殖之間的相互關(guān)系和影響，從微觀層面上尋求防控弧菌更有效的方法和手段。

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Review on Host-invaded Colonization and Regulatory Mechanism by Pathogenicin Mariculture

ZHANG Yi-lin, WU Fan, JIAN Ji-chang, CAI Shuang-hu

（,//,524088,）

Colonization is one of the most important link in the process ofinfecting the host and causing vibriosis in mari-culture. Therefore, it is very important to study the molecular mechanism ofcolonization in order to fully clarify the pathogenicity ofand develop effective prevention and control strategies. This review summarized the research progress of the molecular mechanism ofcolonization on fish intestine from three aspects of specific structural protein, biofilm and regulatory system, and conclusion can lay a foundation for revealing the internal causes ofoutbreak in mari-culture.This review is conducive to a more comprehensive and in-depth understanding of the colonization of fish intestinal tract by marine pathogenic, which has important reference value for further research on the mechanism of the colonization of fish intestine by pathogenic bacteria.

; colonization; biofilm; specific protein; regulatory system

S941

A

1673-9159（2021）06-0138-09

10.3969/j.issn.1673-9159.2021.06.017

張依琳，吳凡，簡(jiǎn)紀(jì)常，等. 海水養(yǎng)殖病原弧菌對(duì)魚(yú)類(lèi)宿主定植機(jī)制研究進(jìn)展[J]. 廣東海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2021，41（6）：138-146.

2021-04-28

廣東省自然科學(xué)基金（2017A030307033）；國(guó)家自然科學(xué)基金（31572656）

張依琳（1996―），女，碩士研究生，研究方向?yàn)樗a(chǎn)動(dòng)物免疫與病害防控。E-mail：412651248@qq.com

蔡雙虎（1979―），男，博士，教授，研究方向?yàn)樗a(chǎn)動(dòng)物免疫與病害防控。E-mail：caish@gdou.edu.cn

（責(zé)任編輯：劉慶穎）