王曉敏 , 董璐 , 張繼福, 張云 , 胡云峰

1. 中國科學(xué)院南海海洋研究所, 中國科學(xué)院熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點實驗室, 廣東省海洋藥物重點實驗室, 廣東 廣州 510301;

2. 南方海洋科學(xué)與工程廣東省實驗室(廣州), 廣東 廣州 511458;

3. 廣東省中醫(yī)院, 廣東 廣州 510120;

4. 中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049

(R)-1-苯乙醇是一類重要的手性化合物, 不同對映體可顯示出不同的香氣特征、香氣強度和生物活性(Werkhoff et al, 2002; 劉樹文, 2009; 田紅玉, 2011)。(R)-1-苯乙醇可以被用來合成抑制膽固醇吸收的藥物(Chua et al, 2004; De Los Ríos et al, 2012), 也可應(yīng)用于化妝品生產(chǎn)、防腐劑和顏料等工業(yè)生產(chǎn)(Fan et al, 2011)。此外, 手性1-苯乙醇及相應(yīng)的手性酯作為我國規(guī)定允許使用的食用香料, 可用于調(diào)配玫瑰香型精油和各種花香型香精, 也可用作配制蜂蜜、面包、桃子和漿果類等香精。

通常, 手性化合物的合成可以通過傳統(tǒng)的化學(xué)方法合成, 但是化學(xué)合成需要有毒有機(jī)溶劑及重金屬的參與, 對環(huán)境及人類具有嚴(yán)重的危害, 同時還會破壞產(chǎn)品的品質(zhì), 并且通過化學(xué)合成得到的手性化合物的光學(xué)純度較低(Noyori et al, 1991)。此外, 手性化合物還可以通過生物催化劑的方法進(jìn)行制備(Deng et al, 2016a, 2018; Huang et al, 2018; Wang et al, 2018a, b, 2019a, b)。與傳統(tǒng)的化學(xué)合成相比, 酶法選擇性拆分消旋體化合物, 具有高立體專一性和區(qū)域選擇性、副反應(yīng)少、產(chǎn)率高、產(chǎn)物光學(xué)純度好以及反應(yīng)條件溫和的優(yōu)點(Cao et al, 2016; Deng et al, 2016b; 公顏慧 等, 2016, 2018; Huang et al, 2016), 是一種被廣泛認(rèn)可的拆分方法(曹瑩瑩 等, 2016; Liang et al, 2016a, b; Deng et al, 2016c; 黃錦龍 等, 2017, 2018)。目前, 苯乙醇基本上都是采用廉價的化工原料利用化學(xué)合成的方法生產(chǎn)。隨著生活水平的提高和對健康的關(guān)注, 人們越來越重視食品的安全性, 食品生產(chǎn)也越來越傾向使用天然添加劑。利用酶催化法制備(R)-1-苯乙醇相較于化學(xué)合成也更符合人們對食品安全的追求。

目前常見的微生物細(xì)胞破壁方式主要有: 化學(xué)法, 如利用表面活性劑和酸等; 物理法, 如反復(fù)凍融法、超聲破壁法、機(jī)械法和玻璃珠法等; 生物法, 如酶解法等(Chang et al, 2007)。孫永紅(2010)以臭曲霉為對象, 采用超聲波、研磨、溫和化學(xué)法3 種方法破碎臭曲霉菌體, 得出適合臭曲霉SH4 胞內(nèi)酶最佳的提取方案為研磨法。呂國英等(2016)利用超聲破碎刺芹側(cè)耳M1 菌獲取漆酶, 用于降解孔雀石綠效果良好。針對不同種微生物以及破碎目的的不同, 破碎方式也不盡相同。本實驗室從西太平洋深海沉積物中篩選出一株芽孢桿菌Bacillus sp. DL-2, 經(jīng)初步試驗表明其胞內(nèi)酶、胞外酶及全細(xì)胞均能水解乙酸蘇合香酯(Dong et al, 2019a, b; 董璐 等, 2020), 本文旨在探尋不同細(xì)胞破碎方法對胞內(nèi)蛋白酶拆分乙酸蘇合香酯的影響。比較常用的3 種破碎細(xì)胞方法(表面活性劑破碎、溶菌酶破碎和超聲破碎), 并優(yōu)化了表面活性劑破碎和溶菌酶破碎的條件。在最優(yōu)條件下, (R)-1-苯乙醇的對映體過量值達(dá)到96%, 轉(zhuǎn)化率為23%, 為利用芽孢桿菌胞內(nèi)蛋白酶生產(chǎn)手性(R)-1-苯乙醇提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料

芽孢桿菌Bacillus sp. DL-2 由本實驗室篩選自西太平洋深海沉積物中, 菌落呈圓形凸起, 表面光滑, 邊緣整齊, 呈淡黃色。乙酸蘇合香酯購自上海阿達(dá)瑪斯試劑有限公司, 表面活性劑購自廣州東巨公司, 溶菌酶購自生工生物工程上海股份有限公司, 其他試劑皆為分析純, 購自廣州東巨公司。

1.2 方法

1.2.1 Bacillus sp. DL-2 胞內(nèi)蛋白酶拆分乙酸蘇合香酯反應(yīng)

將破碎細(xì)胞后獲取的胞內(nèi)蛋白酶液500μL 與10mmol·L–1乙酸蘇合香酯充分振蕩反應(yīng)。反應(yīng)條件為: 35℃, 200r·min–1, 搖床振蕩反應(yīng)8h。反應(yīng)完畢立即加入與拆分體系等量的乙酸乙酯, 2000r·min–1振蕩萃取2min, 離心后取上層有機(jī)相進(jìn)氣相檢測。氣相檢測條件為: 注射器溫度210℃, 檢測器溫度210℃, 載氣為N2, 流速1.2mL·min–1, 采用梯度升溫進(jìn)行分析: 80℃保持1min, 10℃·min–1升溫到120℃, 120℃保持1min, 15℃·min–1升溫到210℃, 保持1min。

產(chǎn)物(R)-1-苯乙醇的對映體過量值(e.e.)及轉(zhuǎn)化率(C)按如下公式計算(Chen et al, 1982):

式中: e.e.表示(R)-1-苯乙醇的對映體過量值(單位: %); Rnol和Snol分別表示反應(yīng)后(R)-1-苯乙醇和(S)-1-苯乙醇的峰面積(單位: μV·s)。C 為轉(zhuǎn)化率(單位: %); R0、S0分別表示反應(yīng)前對應(yīng)構(gòu)型的乙酸蘇合香酯的濃度(單位: mmol·L–1); R、S 分別代表反應(yīng)后對應(yīng)構(gòu)型的乙酸蘇合香酯的濃度(單位: mmol·L–1)。

1.2.2 表面活性劑的初篩

磷酸鹽(PB)緩沖液的配制: 6g NaH2PO4溶于1000mL 蒸餾水中配制成A 液, 7.1g Na2HPO4溶于1000mL 蒸餾水中配制成B 液, 以不同比例混合A液和B 液, 得到0.05mol·L–1的不同pH 的磷酸鹽緩沖液。

檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液的配制: 19.2g 檸檬酸溶于1000mL 蒸餾水中充分溶解, 29.4g 檸檬酸鈉溶于1000mL 蒸餾水中充分溶解, 按不同比例混合兩母液, 即得不同pH 的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。

Tris-HCl 緩沖液的配制: 稱量12.1g Tris 溶于1000mL蒸餾水中充分溶解, 取500mL加入0.1mol·L–1的稀鹽酸調(diào)制相應(yīng)pH, 加水定容至1000mL, 即得不同pH 的Tris-HCl 緩沖液。

表面活性劑溶液的配制: 量取或稱量表面活性劑, 分別配制體積分?jǐn)?shù)0.5%或質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%的表面活性劑溶液, 溶劑為pH7.0 的磷酸鹽緩沖液。

Bacillus sp.DL-2 經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后用pH 7.0 的磷酸鹽緩沖液清洗兩次, 去上清, 取濕重細(xì)胞0.5g 分別加入體積分?jǐn)?shù) 0.5%的吐溫 20 (Tween20, 分析純)、吐溫40 (Tween40, 分析純)、吐溫60 (Tween60, 分析純)、吐溫80 (Tween80, 分析純)、曲拉通X-100 (TritonX-100, 分析純, >99%)或質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%的羧甲基纖維素鈉(CMCNa, 分析純)、三聚磷酸鈉(STPP, 分析純, 98%)、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB, 99%)、脫氧膽酸鈉(NaDC, 98%)、十二烷基硫酸鈉(SDS, 分析純)、十二烷基苯磺酸鈉(SDBS, 95%)、司盤65 (Span65, 分析純)等表面活性劑溶液20mL中, 置于35℃, 200r·min–1搖床中振蕩破碎2h 后, 10000r·min–1離心10min, 取上清, 即得胞內(nèi)蛋白酶液。使用胞內(nèi)蛋白酶液按照上述拆分方法對乙酸蘇合香酯進(jìn)行水解拆分制備(R)-1-苯乙醇。綜合比較e.e.值、轉(zhuǎn)化率、配制表面活性劑溶液復(fù)雜程度及經(jīng)濟(jì)適用性, 選出最適表面活性劑。

1.2.3 表面活性劑的破碎條件優(yōu)化

采用單因素試驗, 優(yōu)化表面活性劑破碎條件。選出最佳表面活性劑之后, 將發(fā)酵清洗好的濕重0.5g 細(xì)菌細(xì)胞加入20mL 表面活性劑溶液中, 在不同的試驗條件下進(jìn)行破碎, 破碎后10000r·min–1離心 10min, 獲取胞內(nèi)酶液用于拆分乙酸蘇合香酯, 所有試驗均重復(fù)3 次, 取平均值。

優(yōu)化破碎溫度。取濕重0.5g 細(xì)菌細(xì)胞加入用pH 7.0 的磷酸鹽緩沖液配制的0.5%表面活性劑溶液20mL, 試驗溫度分別設(shè)置為20℃～55℃ (5℃間隔), 置于200r·min–1搖床中振蕩破碎2h。

優(yōu)化破碎時pH。取濕重0.5g 細(xì)菌細(xì)胞, 分別加入20mL 用不同pH 緩沖液(5.0～10.0, 0.5 間隔, 其中5.0～6.5 為檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液, 7.0～7.5 為PB 緩沖液, 8.0～10.0 為Tris-HCl 緩沖液)配制的表面活性劑溶液, 置于35℃、200r·min–1搖床中振蕩破碎2h。

優(yōu)化破碎時間。取濕重0.5g 細(xì)菌細(xì)胞加入用pH 7.0 的PB 緩沖液配制的0.5%表面活性劑溶液20mL, 置于 35℃、200r·min–1搖床中振蕩破碎不同時間(0～5h, 0.5h 間隔)。

優(yōu)化表面活性劑濃度。取濕重0.5g 細(xì)菌細(xì)胞, 分別加入20mL 不同體積分?jǐn)?shù)或質(zhì)量分?jǐn)?shù)(0.1%～1%, 0.1%間隔)的表面活性劑(用pH 7.0 磷酸鹽緩沖液配制), 置于35℃、200r·min–1搖床中振蕩破碎2h。

1.2.4 溶菌酶的破碎條件優(yōu)化

10mg·mL–1溶菌酶溶液的配制: 稱量1g 溶菌酶溶于100mL pH 7.0 的磷酸鹽緩沖液中。

優(yōu)化破碎溫度。取濕重0.5g 細(xì)菌細(xì)胞, 加入20mL 10mg·mL–1的溶菌酶溶液, 分別置于不同溫度(20～50℃, 5℃間隔) 200r·min–1搖床中振蕩破碎2h。

優(yōu)化破碎pH。取濕重0.5g 細(xì)菌細(xì)胞, 分別加入20mL 用不同pH 緩沖液(5.5～9.0, 0.5 間隔, 其中5.5～6.5 為檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液, 7.0～7.5 為PB 緩沖液, 8.0～9.0 為Tris-HCl 緩沖液)配制的10mg·mL–1的溶菌酶溶液, 置于35℃、200r·min–1搖床中振蕩破碎2h。

優(yōu)化破碎時間。取濕重0.5g 細(xì)菌細(xì)胞加入20mL 10mg·mL–1的溶菌酶溶液, 置于35℃、200r·min–1搖床中振蕩破碎不同時間(0～4h, 0.5h 間隔)。

溶菌酶濃度的優(yōu)化。濕重0.5g 細(xì)菌細(xì)胞加入20mL 不同濃度(1～10mg·mL–1, 1mg·mL–1間隔)的溶菌酶溶液, 置于35℃、200r·min–1搖床中振蕩破碎2h。

1.2.5 超聲破碎對胞內(nèi)酶拆分乙酸蘇合香酯的影響

超聲體系: 取發(fā)酵好的濕重0.5g 細(xì)菌細(xì)胞加入20mL 磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)。

超聲破碎條件: 功率285W, 破碎30min (工作2s, 間歇3s)。10000r·min–1離心10min, 取上清, 即得超聲破碎胞內(nèi)酶液。

2 結(jié)果

2.1 表面活性劑的初篩

由圖1 可知, 篩選檢測的12 種表面活性劑破碎細(xì)胞后拆分的效果差別較大。非離子型表面活性劑(Tween20、Tween40、Tween60、Tween80、TritonX-100、Span65)對 Bacillus sp. DL-2 細(xì)胞的破碎效果整體要優(yōu)于離子型表面活性劑(CMCNa、NaDC、SDS、SDBS、CTAB)及無機(jī)物表面活性劑(STPP)。推測可能是因為離子型表面活性劑在破碎細(xì)胞的過程中對細(xì)胞胞內(nèi)蛋白酶的活性有較大的損傷, 導(dǎo)致Bacillus sp. DL-2胞內(nèi)蛋白酶的拆分效果較差。使用Tween40、Tween60及TritonX-100 等非離子型表面活性劑破碎細(xì)胞后所得的胞內(nèi)蛋白酶拆分(±)-乙酸蘇合香酯制備的(R)-1-苯乙醇的e.e.值可達(dá)90%以上。綜合考慮選擇底物轉(zhuǎn)化率最高的非離子型表面活性劑TritonX-100 作為最佳表面活性劑用于細(xì)胞破碎。

2.2 表面活性劑破碎細(xì)胞的優(yōu)化

2.2.1 破碎溫度對胞內(nèi)蛋白酶拆分乙酸蘇合香酯的影響

圖1 不同表面活性劑破碎細(xì)胞對Bacillus sp. DL-2 胞內(nèi)蛋白酶拆分乙酸蘇合香酯的影響 Fig. 1 The effect of different surfactants breaking cells on asymmetrical hydrolysis of (±)-1-phenylethyl acetate using the intracellular proteases of Bacillus sp. DL-2

圖2 表面活性劑破碎細(xì)胞的條件優(yōu)化 a. 溫度; b. pH; c. 破碎時間; d. 表面活性劑濃度 Fig. 2 The optimization of the conditions of breaking cells by surfactant. (a) Effect of broken temperature, (b) effect of broken pH, (c) effect of broken time, and (d) effect of surfactant concentration

篩選出最適表面活性劑TritonX-100 之后, 探究破碎溫度對Bacillus sp. DL-2 胞內(nèi)蛋白酶拆分乙酸 蘇合香酯的影響。試驗結(jié)果如圖2a 所示, 在20～45℃破碎溫度下所制備的(R)-1-苯乙醇的e.e.值基本一致, 破碎溫度高于45℃時所制備的(R)-1-苯乙醇的e.e.值開始急劇下降。底物轉(zhuǎn)化率在 3 5 ℃時達(dá)到 最大值; 在35℃之后, 隨著溫度的升高轉(zhuǎn)化率逐步降低, 超過45℃后轉(zhuǎn)化率幾乎為0, 表明拆分乙酸蘇合香酯的胞內(nèi)酶最高耐受溫度在35～40℃之間。雖然在40℃時產(chǎn)物e.e.值達(dá)到最大, 但考慮較高溫度會對酶活性造成一定影響, 綜合考慮選用35℃為最佳破碎溫度。

2.2.2 破碎時的pH 對胞內(nèi)蛋白酶拆分乙酸蘇合香酯的影響

破碎時的pH 對胞內(nèi)蛋白酶拆分乙酸蘇合香脂的影響如圖2b, 不同pH 的緩沖液對胞內(nèi)蛋白酶拆分乙酸蘇合香酯的影響較大, 在低pH 緩沖液(檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液)條件下破碎細(xì)胞制備的胞內(nèi)蛋白酶用于拆分反應(yīng)中其底物轉(zhuǎn)化率較高。用pH 超過8.0 的Tris-HCl 緩沖液配制的表面活性劑破碎細(xì)胞時, 其胞內(nèi)酶拆分反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率急劇下降。雖然當(dāng)破碎時的pH 為5.0 和6.5 時, 拆分反應(yīng)中底物的轉(zhuǎn)化率較高, 但產(chǎn)物e.e.值較低。綜合考慮轉(zhuǎn)化率與產(chǎn)物e.e.值, 我們發(fā)現(xiàn)在pH 為7.0 時拆分效果最佳。因此, 選擇pH 7.0 的磷酸鹽緩沖液配制表面活性劑TritonX-100 用于破碎Bacillus sp. DL-2。

2.2.3 破碎時間對胞內(nèi)蛋白酶拆分乙酸蘇合香酯的影響

不同破碎時間也會對胞內(nèi)蛋白酶拆分乙酸蘇合香酯產(chǎn)生較大的影響。試驗結(jié)果如圖2c 所示, 隨著破碎時間延長, 底物轉(zhuǎn)化率逐步上升。產(chǎn)物e.e.值在破碎2h 時達(dá)到最大, 并且隨著破碎時間的延長逐漸降低, 猜測表面活性劑的長時間作用會對胞內(nèi)蛋白酶產(chǎn)生破壞, 影響胞內(nèi)蛋白酶的拆分活性, 因此選擇2h 為最佳破碎時間。

2.2.4 表面活性劑的體積分?jǐn)?shù)對胞內(nèi)蛋白酶拆分乙酸蘇合香酯的影響

試驗結(jié)果如圖2d, TritonX-100 的體積分?jǐn)?shù)不同對胞內(nèi)蛋白酶拆分乙酸蘇合香酯的影響較小。在高體積分?jǐn)?shù)TritonX-100 溶液作用下, 底物轉(zhuǎn)化率會稍微降低; 色譜圖表明, 在體積分?jǐn)?shù)0.5% TritonX-100破碎條件下, 制備的(R)-1-苯乙醇的e.e.值可以達(dá)到96%, 底物轉(zhuǎn)化率可達(dá)23% (圖3b), 因此選擇體積分?jǐn)?shù)為0.5%的TritonX-100 對細(xì)胞進(jìn)行破碎。

2.3 溶菌酶破碎細(xì)胞的優(yōu)化

2.3.1 破碎溫度對胞內(nèi)蛋白酶拆分乙酸蘇合香酯的影響

溶菌酶在不同溫度下破碎Bacillus sp. DL-2 細(xì)胞對拆分乙酸蘇合香酯的影響較大。由圖4a 所知, 底物轉(zhuǎn)化率隨溫度升高逐步增大并在25℃時達(dá)到最大, 之后隨著溫度繼續(xù)升高逐步降低。但在25℃時產(chǎn)物e.e.值較低, 并未達(dá)到最佳值; 在30℃、35℃和40℃條件下, 底物轉(zhuǎn)化率及e.e.值相差不大, 但是在30℃條件下拆分結(jié)果均一性較差; 在35℃和40℃條件下破碎細(xì)胞達(dá)到的效果基本一致, 考慮到能耗問題及較高溫度可能對胞內(nèi)酶產(chǎn)生影響, 因此選擇35℃為最佳破碎溫度。

2.3.2 破碎時的pH 對胞內(nèi)蛋白酶拆分乙酸蘇合香酯的影響

溶菌酶在不同pH 時破碎Bacillus sp. DL-2 細(xì)胞對拆分乙酸蘇合香酯有較大影響。試驗結(jié)果如圖4b所示, 用pH 6.0 的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配制的溶菌酶破碎細(xì)胞后, 產(chǎn)生的胞內(nèi)酶在拆分反應(yīng)中制備的(R)-1-苯乙醇的e.e.值及底物轉(zhuǎn)化率均比使用PB 緩沖液和Tris-HCl 緩沖液高。因此選擇pH 6.0檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配制溶菌酶用以破碎Bacillus sp. DL-2 細(xì)胞, 并進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。

2.3.3 破碎時間對胞內(nèi)蛋白酶拆分乙酸蘇合香酯的影響

探究0～4h 不同破碎時間對胞內(nèi)蛋白酶拆分乙酸蘇合香酯的影響, 試驗結(jié)果如圖4c 所示。隨著細(xì)胞破碎時間增長, 底物轉(zhuǎn)化率呈先上升后下降的趨勢, 并在1.5h 達(dá)到最高值, 但此時產(chǎn)物e.e.值較低; 破碎時間超過3h 后, 產(chǎn)物e.e.值較好, 但是底物轉(zhuǎn)化率較低, 且破碎時間過長會使工業(yè)生產(chǎn)過程更加繁瑣。此外, 在破碎時間為1h 和1.5h 時, 制備的手性產(chǎn)品的光學(xué)純度和轉(zhuǎn)化率的均一性不佳。綜合考慮, 選擇破碎時間0.5h 為最適破碎時間。

2.3.4 溶菌酶質(zhì)量濃度對胞內(nèi)酶拆分乙酸蘇合香酯的影響

試驗結(jié)果如圖4d 所示, 不同濃度的溶菌酶對產(chǎn)物e.e.值影響不大, 底物轉(zhuǎn)化率呈不規(guī)則變化。從經(jīng)濟(jì)適用性方面考慮, 選取濃度為1mg·mL–1的溶菌酶為最佳破碎濃度。最優(yōu)條件下, 拆分乙酸蘇合香酯色譜圖效果良好(圖3c), (R)-1-苯乙醇的e.e.值達(dá)到95%, 底物轉(zhuǎn)化率達(dá)到22%。

2.4 超聲破碎Bacillus sp. DL-2 細(xì)胞獲取胞內(nèi)酶拆分乙酸蘇合香酯

采取實驗室常用參數(shù)條件(功率285W, 工作2s, 間歇3s, 破碎30min)進(jìn)行破碎, 根據(jù)胞內(nèi)蛋白酶拆分乙酸蘇合香酯色譜圖(圖3d)計算, 底物轉(zhuǎn)化率為11.2%, 產(chǎn)物e.e.值為95%。

圖3 胞內(nèi)蛋白酶拆分乙酸蘇合香酯色譜圖 a. 標(biāo)準(zhǔn)品; b. 優(yōu)化后的表面活性劑TritonX-100 破碎細(xì)胞獲取胞內(nèi)酶拆分色譜圖; c. 優(yōu)化后的溶菌酶破碎細(xì)胞獲取胞內(nèi)酶拆分色譜圖; d. 超聲破碎獲取胞內(nèi)酶拆分色譜圖。紅色代表S 型乙酸蘇合香酯及相應(yīng)的醇, 藍(lán)色代表R-乙酸蘇合香酯及相應(yīng)的醇 Fig. 3 The gas chromatogram of asymmetric hydrolysis of (±)-1-phenylethyl acetate by intracellular proteases. (a) Standards of (±)-1-phenylethyl acetate and (±)-1-phenylethanol, (b) surfactant TritonX-100, (c) lysozyme, and (d) ultrasonication. The red color represents (S)-phenylethyl acetate and (S)-1-phenylethanol, and the blue color represents (R)-phenylethyl acetate and (R)-1-phenylethanol

圖4 溶菌酶破碎細(xì)胞條件的優(yōu)化 a. 溫度; b. pH; c. 破碎時間; d. 溶菌酶質(zhì)量濃度 Fig. 4 The optimization of the conditions of breaking cells by lysozyme. (a) Effect of broken temperature, (b) effect of broken pH, (c) effect of broken time, and (d) effect of lysozyme concentration

3 討論

(R)-1-苯乙醇及其衍生物的制備在工業(yè)生產(chǎn)中非常重要, 因為光學(xué)純的單體分子是合成許多藥物和化學(xué)制品的關(guān)鍵中間體。此外, (R)-1-苯乙醇由于具有獨特的香氣特征也可用于香料及化妝品的制備。傳統(tǒng)的化學(xué)合成法需要有毒有機(jī)溶劑及重金屬的參與, 而生物催化劑方法由于其對環(huán)境友好及產(chǎn)物光學(xué)純度高等特點, 應(yīng)用更加廣泛(Wang et al, 2016a, b; Gong et al, 2018)。本研究通過破碎Bacillus sp. DL-2 細(xì)胞獲取得到胞內(nèi)蛋白酶, 選擇及優(yōu)化破碎方式和反應(yīng)條件, 使其能有效拆分乙酸蘇合香酯, 制備高光學(xué)純的(R)-1-苯乙醇。

微生物破碎方式有很多種, 根據(jù)不同種微生物以及破碎目的的不同, 破碎方式也各不相同。表面活性劑可與生物膜蛋白質(zhì)產(chǎn)生強烈相互作用使之變性或失去功能, 進(jìn)而達(dá)到破碎細(xì)胞的目的。李清(2004)在獲取膽固醇氧化胞內(nèi)酶(COD)時比較了表 面活性劑TritonX-100 和Tween80 對COD 胞內(nèi)酶的提取效果, 結(jié)果表明TritonX-100 效果最優(yōu)。溶菌酶主要通過水解細(xì)菌細(xì)胞壁的肽聚糖導(dǎo)致細(xì)胞壁破裂而使細(xì)菌溶解。李琦等(2011)通過超聲波破壁法、溶菌酶破壁法、反復(fù)凍融法和機(jī)械破壁法4 種不同破壁方式對嗜熱鏈球菌SP1.1 進(jìn)行破壁處理, 確定了溶菌酶方法提取胞內(nèi)乳糖代謝關(guān)鍵酶效果最優(yōu)。超聲破碎在實驗室規(guī)模應(yīng)用較普遍, 處理少量樣品時操作簡便, 液量損失少; 但大容量裝置聲能傳遞和散熱均有困難, 不適用于工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)。

通過優(yōu)化破碎條件發(fā)現(xiàn), 破碎溫度、pH 及破碎時間對破碎效果均有影響, 表面活性劑體積分?jǐn)?shù)和溶菌酶質(zhì)量濃度對破碎效果的影響較小。經(jīng)條件優(yōu)化后的表面活性劑破碎效果優(yōu)于溶菌酶及超聲破碎(圖5), 且表面活性劑性價比要遠(yuǎn)高于溶菌酶, 在貯藏條件要求上也低于溶菌酶; 超聲破碎細(xì)胞在工業(yè)生產(chǎn)上具有技術(shù)性限制。

圖5 表面活性劑破碎、溶菌酶破碎和超聲破碎的Bacillus sp. DL-2 胞內(nèi)蛋白酶拆分(±)-乙酸蘇合香酯的比較 Fig. 5 Comparison of resolution of (±)-1-phenylethyl acetate using the intracellular proteases of Bacillus sp. DL-2 through surfactant, lysozyme and ultrasonication

4 結(jié)論

本試驗對從西太平洋深海沉積物中篩選出來的Bacillus sp. DL-2 進(jìn)行了表面活性劑破碎細(xì)胞、溶菌酶破碎細(xì)胞、超聲破碎細(xì)胞3 種不同的破碎方法比較, 發(fā)現(xiàn)使用非離子型表面活性劑TritonX-100 破碎 細(xì)胞后獲取的胞內(nèi)蛋白酶拆分乙酸蘇合香酯效果最優(yōu), 并確定了最優(yōu)破碎條件為: 破碎溫度35℃, pH 7.0, 破碎時間2h, 表面活性劑體積分?jǐn)?shù)0.5%。在最優(yōu)破碎條件下, 所制備的(R)-1-苯乙醇的 e.e.值為96%, 轉(zhuǎn)化率為23%。