潘肖蘭 , 劉惠茹 , 許濛 , 許瀚之 , 張華 何毛賢

1. 中國科學(xué)院南海海洋研究所, 中國科學(xué)院熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣東省應(yīng)用海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 中國科學(xué)院南海生態(tài)環(huán)境工程創(chuàng)新研究院, 廣東 廣州 510301;

2. 中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049

水通道蛋白4 (Aquaporin 4, AQP4)是一類參與水運(yùn)輸?shù)哪まD(zhuǎn)運(yùn)蛋白, 通常以四聚體形式存在, 在滲透壓調(diào)節(jié)中起重要作用(Ho et al, 2009; Pannicke et al, 2010)。AQP4 與多種人類疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān), 如腦水腫(Papadopoulos et al, 2007)。血腦屏障(Blood-brain Barrier, BBB)破壞后AQP4 大量表達(dá)可致腦水腫形成和發(fā)展, 該過程伴隨著氧化應(yīng)激水平的增加(Yang et al, 2014)。研究發(fā)現(xiàn)基質(zhì)金屬蛋白分解酶(Matrix Metalloproteinase, MMP)可通過降解細(xì)胞外基質(zhì)來增加毛細(xì)血管通透性從而促進(jìn)BBB 的破壞(武檸子 等, 2016), MMP 與AQP4 的表達(dá)關(guān)系密切, 某些藥物可以通過抑制MMP 的表達(dá)從而抑制AQP4 的表達(dá)來減輕BBB 的破壞, 在小鼠中MMP敲除可直接引起AQP4 表達(dá)量下調(diào), AQP4 敲除會(huì)導(dǎo)致MMP 表達(dá)異常(Zhou et al, 2010; Cao et al, 2016; Pérez-Hernández et al, 2017)。提高超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase, SOD)活力和下調(diào)AQP4 的表達(dá)可減輕腦水腫癥狀(Belayev et al, 2012; 王晶 等, 2018)。此外, 在人自身免疫性視神經(jīng)脊髓炎(NMO)患者的血清中 AQP4 抗體(AQP4-IgG)顯著升高, AQP4 肽的刺激可使NMO 患者的T 細(xì)胞分泌白細(xì)胞介素17 (Interleukin, IL-17)等細(xì)胞因子(Nelson et al, 2010; Ulusoy et al, 2012; Wang et al, 2012)。AQP4 基因缺失可抑制或激活重要免疫轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子核因子κB (Nuclear factor kappa B, NF-κB)信號(hào)通路, 從而抑制或促進(jìn)細(xì)胞因子的釋放(Sun et al, 2016; Dai et al, 2018; Wang et al, 2019; Hua et al, 2020); 若抑制NF-κB 信號(hào)通路, 則會(huì)導(dǎo)致AQP4 基因的表達(dá)受到抑制(Sun et al, 2019)。這些研究表明AQP4 影響多種免疫相關(guān)因子的合成和分泌。目前已證實(shí)AQP4參與水產(chǎn)動(dòng)物滲透壓調(diào)節(jié)(高沿, 2016), 但關(guān)于其免疫功能還沒有報(bào)道。

馬氏珠母貝(Pinctada fucata martensii)是人工培育海水珍珠的主要母貝, 除了在自然狀態(tài)下可能會(huì)受到病原菌的入侵之外, 用其進(jìn)行人工育珠的過程中, 經(jīng)常會(huì)觀察到插核手術(shù)貝因病原菌入侵傷口而死亡的現(xiàn)象, 機(jī)體免疫顯著影響插核手術(shù)貝的成活率(Adzigbli et al, 2019, 2020)。我們前期克隆了馬氏珠母貝AQP4 (PfAQP4)并研究了其 在滲透壓調(diào)節(jié)中的功能(潘肖蘭 等, 2020), 本文擬探究 PfAQP4 是否具有免疫調(diào)節(jié)功能, 以期為馬氏珠母貝的抗性育種及病害防治等提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用約1 齡的馬氏珠母貝, 養(yǎng)殖于深圳大鵬澳海區(qū)。將試驗(yàn)貝暫養(yǎng)于室內(nèi)水池中, 水溫和鹽度等條件與海區(qū)一樣, 24h 充氣, 每天8:00 投喂餌料(亞心形扁藻) 1 次, 14:00 換水1 次。

1.2 免疫刺激試驗(yàn)

根據(jù)注射物不同分為脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)組、聚肌胞[Polyinosinic-polycytidylic acid, Poly (I:C)]組和磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline, PBS)組(陰性對(duì)照) 3 個(gè)組, 每組60 只貝。將3 種注射物按試劑說明書分別配置成質(zhì)量濃度為1μg·μL–1溶液后進(jìn)行注射, 每只貝注射劑量為100μL。分別于注射后12h、24h、36h、48h 和72h, 從每個(gè)組別中隨機(jī)取9 只貝, 取消化腺和外套膜組織立即置于液氮中保存。每3 只貝的同一組織混合作為1 個(gè)生物學(xué)重復(fù), 共3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.3 RNA 干擾試驗(yàn)

用美國Promega 公司的T7 RiboMAX? Express Large Scale RNA Production System 試劑盒進(jìn)行PfAQP4 dsRNA 的合成, 合成引物見表1。將15 只馬氏珠母貝隨機(jī)分成3 組, 分別是AQP 組、綠色熒光蛋白(GFP)組和PBS-r 組。其中AQP 組為試驗(yàn)組, 注射濃度為4μg·μL–1的PfAQP4 dsRNA 溶液40μL; GFP 是水母特有的一類發(fā)光蛋白, 在其他生物體內(nèi)不存在, 因此不會(huì)出現(xiàn)假陽性結(jié)果, 故將GFP 組作為陽性對(duì)照組, 注射質(zhì)量濃度為4μg·μL–1的GFP dsRNA 溶液40μL; PBS-r 組作為陰性對(duì)照組, 注射40μL 1×PBS。7d 后分別對(duì)每只貝的外套膜組織進(jìn)行固定, 用于RNA 提取。

1.4 總RNA 提取、cDNA 模板合成和實(shí)時(shí)熒光定量PCR

用Magen 公司通用RNA 提取試劑盒提取組織的總RNA, 用UV-Vis Spectrophotometer Q5000 (QUAWELL)測(cè)定RNA 濃度, 1.5%瓊脂糖凝膠電泳 檢驗(yàn)RNA 質(zhì)量。用帶有去除基因組功能的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 ReverTra Ace?qPCR RT Master Mix With gDNA Remover (Toyobo)進(jìn)行cDNA 第一鏈合成, 用SYBR?Green Realtime PCR Master Mix (Toyobo)和Light Cycler 480 (Roche, Switzerland), 18S rRNA 為內(nèi)參基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量分析, 每個(gè)樣品3 個(gè)技術(shù)重復(fù), 所檢測(cè)基因的實(shí)時(shí)熒光定量引物見表1。反應(yīng)體系為: SYBR?Green Realtime PCR Master Mix 5μL, 雙蒸餾水3.4μL, cDNA 模板1μL, 上下游引物各0.3μL, 共10μL。反應(yīng)程序?yàn)? 95℃預(yù)變性10min; 95℃ 10s, 56℃ 15s, 72℃ 15s, 45 個(gè)循環(huán)。2–Ct△法計(jì)算相對(duì)mRNA 表達(dá)量。用SPSS19.0 軟件的單因素方差分析法(ANOVA)進(jìn)行顯著性分析, Tukey 法進(jìn)行進(jìn)行多組樣本間差異顯著性分析, 置信區(qū)間為95%。數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示, 在p<0.05 時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。用SPSSAU-在線SPSS 分析軟件(https://spssau.com/front/spssau/index.html)進(jìn)行 Pearson相關(guān)性分析。

表1 本研究所用的引物序列 Tab. 1 Primers used in this study

2 結(jié)果

2.1 免疫刺激后PfAQP4 在外套膜和消化腺組織的表達(dá)情況

免疫刺激后PfAQP4 在外套膜中的相對(duì)表達(dá)情況如圖1a。在注射LPS 后12h, PfAQP4 mRNA 相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組(PBS 組)間無顯著性差異; 注射LPS 后24h, PfAQP4 mRNA 相對(duì)表達(dá)量為0.0103, 與PBS 組相比顯著升高(p<0.05), 是PBS 組的2.2倍; 注射后36h, PfAQP4 轉(zhuǎn)錄表達(dá)量降至PBS 組水平。注射Poly(I:C)后12h 和24h, PfAQP4 mRNA 相對(duì)表達(dá)量與相應(yīng)時(shí)刻PBS 組相比均無顯著性差異; 注射后36h 和48h, PfAQP4 mRNA 相對(duì)表達(dá)量分別為0.0063 和0.0093, 與相應(yīng)時(shí)刻PBS 組相比均顯著升高(p<0.05), 分別是PBS 組的2.2 和1.5 倍; 注射后72h, PfAQP4 轉(zhuǎn)錄表達(dá)量已降至PBS 組水平。

免疫刺激后PfAQP4 在消化腺中的相對(duì)表達(dá)情況如圖1b。注射LPS 后12h, PfAQP4 mRNA 的相對(duì) 表達(dá)量為0.0009, 與PBS 組相比顯著降低(p<0.05), 為PBS 組的0.5 倍; 注射后24h、36h 和48h, PfAQP4的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量與相應(yīng)時(shí)刻PBS 組相比均顯著升高(p<0.05), 基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量分別為0.0041、0.0021 和0.0028, 分別是PBS 組的2.9、2.3 和2.2 倍; 注射后72h, PfAQP4 轉(zhuǎn)錄表達(dá)量與PBS 組相比已無顯著性差異。注射Poly(I:C)后12h、24h 和36h, PfAQP4 mRNA 相對(duì)表達(dá)量與相應(yīng)時(shí)刻PBS 組相比均無顯著性差異; 注射后48h, PfAQP4 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量為0.0027, 與PBS 組相比顯著上升(p<0.05), 是PBS組的2.1 倍; 注射后72h 時(shí)PfAQP4 轉(zhuǎn)錄表達(dá)量恢復(fù)至PBS 組水平。

圖1 3 種免疫刺激引起PfAQP4 mRNA 相對(duì)表達(dá)量在外套膜(a)和消化腺(b)中的隨時(shí)間變化情況 *表示同一時(shí)刻試驗(yàn)組與對(duì)照組有顯著差異(p<0.05) Fig. 1 Relative mRNA expression of PfAQP4 in the mantle (a) and digestive gland (b) after immune stimulation. * indicates that the experimental group and control group are significantly different at the same time (p < 0.05)

2.2 RNA 干擾后免疫相關(guān)基因在外套膜的表達(dá)情況

PfAQP4 RNA 干擾效果及干擾后免疫相關(guān)基因的表達(dá)情況如圖2。AQP 組、PBS-r 組和GFP 組中PfAQP4 mRNA 相對(duì)表達(dá)量分別為0.003、0.011 和0.015, PfAQP4 轉(zhuǎn)錄表達(dá)量在試驗(yàn)組與兩個(gè)對(duì)照組間均具有顯著性(p<0.05、p<0.01), 基因干擾效率為77%。溶酶體膜相關(guān)糖蛋白LAMP 基因在AQP 組、PBS-r 組和GFP 組的mRNA 相對(duì)表達(dá)量分別為0.01、0.04 和0.18, 其中AQP 組LAMP 轉(zhuǎn)錄表達(dá)量與GFP組相比顯著下降(p<0.05), 與PBS-r 組相比無顯著性差異; 核因子κBNF-κB 基因在AQP 組、PBS-r 組和GFP 組的mRNA 相對(duì)表達(dá)量分別為0.01、0.02 和0.04, AQP 組NF-κB 轉(zhuǎn)錄表達(dá)量與GFP 組相比顯著下降(p<0.01), 與PBS-r 組相比無顯著性差異; 銅鋅超氧化物歧化酶CuZn-SOD 基因在AQP 組、PBS-r組和GFP 組的mRNA 相對(duì)表達(dá)量分別為0.02、0.07和0.10, 與兩個(gè)對(duì)照組相比, CuZn-SOD 表達(dá)顯著下降(p<0.05、p<0.001); 基質(zhì)金屬蛋白分解酶MMP和白細(xì)胞介素IL-17 基因的mRNA 相對(duì)表達(dá)量各組間均無顯著性差異。

圖2 PfAQP4 表達(dá)抑制后5 個(gè)免疫相關(guān)基因在外套膜中的隨時(shí)間變化情況 a. PfAQP4 mRNA; b. LAMP mRNA; c. CuZn-SOD mRNA; d. MMP mRNA; e. NF-κB mRNA; f. IL-17 mRNA。*表示對(duì)照組與AQP 組差異顯著(p<0.05), **表示p<0.01, ***表示p<0.001 Fig. 2 Relative mRNA expression of 5 immune-related genes in the mantle after inhibition of PfAQP4 expression. * Indicates significant difference between the control group and AQP group (p < 0.05), ** indicates p < 0.01, and *** indicates p < 0.001

將AQP 組、PBS-r 組和GFP 組的PfAQP4 基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量與LAMP、NF-κB、CuZn-SOD、MMP 和IL-17 基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量進(jìn)行Pearson 相關(guān)性分析(表2)。結(jié)果發(fā)現(xiàn): 在5 個(gè)免疫相關(guān)基因中, CuZn-SOD、LAMP 和NF-κB 基因與PfAQP4 基因的相關(guān)系數(shù)分別為 0.818 (p<0.001)、0.674 (p<0.01)和 0.655 (p<0.05), 這3 個(gè)基因與PfAQP4 基因表現(xiàn)出顯著正相關(guān)性; IL-17 基因與PfAQP4 基因的相關(guān)系數(shù)為0.515, 無顯著相關(guān)性; MMP 基因與PfAQP4 基因的相關(guān)系數(shù)僅為0.356, 兩者也無顯著相關(guān)性。

表2 RNA 干擾后PfAQP4 與免疫相關(guān)基因mRNA 表達(dá)量的相關(guān)性分析 Tab. 2 Correlation analysis of mRNA expression between PfAQP4 and immune-related genes in the mantle after RNA interference

3 討論

自1994 年AQP4 在人腦中被發(fā)現(xiàn)以來, 其在高等脊椎動(dòng)物中的免疫調(diào)節(jié)功能已被廣泛認(rèn)知, 該基因的表達(dá)變化涉及免疫相關(guān)通路的激活和抑制, 與多種免疫相關(guān)因子的表達(dá)變化有關(guān)。本研究分析了免疫刺激后PfAQP4 mRNA 相對(duì)表達(dá)量的改變以及PfAQP4 RNA 干擾后免疫相關(guān)基因的表達(dá)變化, 研究結(jié)果表明PfAQP4 參與馬氏珠母貝免疫應(yīng)答。LPS是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁外壁的組成成分, 通常被用來模擬細(xì)菌感染, Poly(I:C)是一種人工合成的雙鏈RNA 類似物, 通常被用來模擬病毒感染(孫樂 等, 2016; Liu et al, 2018)。在馬氏珠母貝中, 消化腺和外套膜都是重要的免疫器官(Zhang et al, 2018)。本試驗(yàn)結(jié)果顯示注射LPS 和Poly(I:C)后, PfAQP4 基因的表達(dá)在外套膜和消化腺中均出現(xiàn)顯著變化, 說明該基因參與馬氏珠母貝因LPS 和Poly(I:C)刺激引起的免疫應(yīng)答。在消化腺中, LPS 注射后24h 開始出現(xiàn)PfAQP4 mRNA 表達(dá)量的顯著上調(diào), 而Poly(I:C)注射后出現(xiàn)PfAQP4 mRNA 表達(dá)量顯著上調(diào)的時(shí)間為48h, 說明在消化腺中PfAQP4 響應(yīng)LPS 刺激比響應(yīng)Poly(I:C)刺激早。同樣, 在外套膜中, LPS 注射后24h 開始出現(xiàn)PfAQP4 mRNA 表達(dá)量的顯著上調(diào), 而Poly(I:C)注射后PfAQP4 mRNA 表達(dá)量的顯著上調(diào)在36h 才觀察到, 也說明了PfAQP4 對(duì)LPS 誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)更為敏感。在本試驗(yàn)中, PfAQP4 在消化腺中的表達(dá)在LPS 刺激后12h 顯著下降, 該現(xiàn)象在外套膜中沒有觀察到, 這可能是由于不同組織的功能特異性, 對(duì)免疫刺激信號(hào)做出的響應(yīng)存在差異。消化腺是海洋軟體動(dòng)物的主要免疫組織已得到了廣泛的認(rèn)知。最近研究報(bào)道, 外套膜也作為重要的免疫器官參與馬氏珠母貝的免疫防御(Zhang et al, 2018)。馬氏珠母貝作為海水珍珠培育的主要母貝, 在進(jìn)行插核手術(shù)后外套膜小片增生形成珍珠囊, 此過程歷經(jīng)免疫識(shí)別、珍珠囊細(xì)胞分泌珍珠質(zhì)包裹珠核形成珍珠。因此, 對(duì)于馬氏珠母貝來說, 外套膜免疫顯得尤為重要(Zhao et al, 2012)。本試驗(yàn)分析了PfAQP4 RNA 干擾后外套膜免疫相關(guān)基因的表達(dá)變化, 以此來說明PfAQP4 與免疫相關(guān)基因之間的關(guān)系。PfAQP4 RNA 抑制后外套膜免疫相關(guān)基因(LAMP、CuZn-SOD、NF-κB、MMP 和IL-17)中除CuZn-SOD 基因在PfAQP4 注射組出現(xiàn)顯著下降外, 其他4 個(gè)基因(MMP、NF-κB、IL-17、LAMP)與對(duì)照組相比無顯著變化, 說明在馬氏珠母貝中, PfAQP4對(duì)這4 個(gè)免疫相關(guān)基因的調(diào)節(jié)作用較小。Pearson 相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)PfAQP4 和CuZn-SOD 相關(guān)系數(shù)為0.818 (p<0.001), 抑制PfAQP4 的表達(dá)可顯著抑制CuZn-SOD 的表達(dá), 說明PfAQP4 和CuZn-SOD 位于同一條信號(hào)通路中。鑒于CuZn-SOD 最主要的功能是參與機(jī)體氧化應(yīng)激, 是重要的免疫相關(guān)基因(袁牧 等, 2016), 說明PfAQP4 可能與CuZn-SOD 共同在免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮重要作用。在水產(chǎn)動(dòng)物中, CuZn-SOD 在文蛤(Meretrix meretrix)(朱丹 等, 2010)、菲律賓蛤仔(Venerupis philippinarum)(Li et al, 2010)、鋸緣青蟹(Scylla serrata)(Lin et al, 2008)、皺紋盤鮑(Haliotis discus discus)(Kim et al, 2007)、櫛孔扇貝(Chlamys farreri)(Ni et al, 2007)、海灣扇貝(Argopecten irradians)(Bao et al, 2009)等中均被發(fā)現(xiàn)與所研究物種的免疫應(yīng)答有關(guān), 該基因可在短時(shí)間內(nèi)誘導(dǎo)免疫系統(tǒng), 是一種急性期蛋白。本研究結(jié)果表明, 在馬氏珠母貝中PfAQP4 可調(diào)節(jié)CuZn-SOD 參與免疫應(yīng)答。

本研究首次發(fā)現(xiàn) PfAQP4 基因響應(yīng) LPS 和Poly(I:C)的免疫刺激。干擾PfAQP4 基因表達(dá)可導(dǎo)致CuZn-SOD 基因表達(dá)量出現(xiàn)顯著下降, 兩者具有較高的正相關(guān)性, 說明PfAQP4 可調(diào)節(jié)CuZn-SOD 基因的表達(dá)。鑒于CuZn-SOD 是一個(gè)公認(rèn)的免疫調(diào)節(jié)因子, 故推測(cè)PfAQP4 可能通過調(diào)節(jié)CuZn-SOD 從而參與馬氏珠母貝的免疫應(yīng)答。但 PfAQP4 如何調(diào)節(jié)CuZn-SOD 還需更深入的試驗(yàn)研究。