杜 娟,文大林,唐 昊,張華才,陸紅祥,蔣建新

(陸軍軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院戰(zhàn)創(chuàng)傷醫(yī)學中心，創(chuàng)傷、燒傷與復合傷國家重點實驗室，重慶 400042)

膿毒癥是感染、燒/創(chuàng)傷、休克等危重患者常見的嚴重并發(fā)癥之一，進一步可發(fā)展為膿毒癥休克、多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)。膿毒癥具有高發(fā)生率和高病死率的特點，是當今嚴重戰(zhàn)創(chuàng)傷和危重病患者的主要死因[1-4]。膿毒癥的發(fā)病機制是病原微生物入侵，引發(fā)天然免疫細胞釋放免疫化學物質，從而觸發(fā)促炎或抗炎反應，引起器官功能的障礙，甚至死亡。因此，利用藥物抑制的方法，調控膿毒癥中主要免疫反應的關鍵炎癥調節(jié)因子，可能成為一種有效的治療膿毒癥的手段。

有研究報道，某些抗腫瘤的藥物對膿毒癥的治療有較好的效果。2017年，Zeng等[5]通過多種人、鼠的細胞研究結果，發(fā)現(xiàn)間變性淋巴瘤激酶(ALK)可直接結合表皮生長因子受體(epithelial growth factor receptor，EGFR)，進而通過蛋白激酶B(AKT)活化干擾素基因刺激蛋白(stimulator of interferon genes,STING)通路，而ALK的特異性抑制劑—色瑞替尼，可以抑制由STING通路產(chǎn)生的干擾素(interferons,IFNs)介導的免疫應答，從而降低膿毒癥小鼠的病死率，提示色瑞替尼是一種潛在的有效治療膿毒癥的藥物。

本研究擬采用的X-396，又名恩薩替尼(Ensartinib)，是新開發(fā)的一種間變性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase,ALK)、細胞間質-上皮細胞轉化因子(cellular-mesenchymal to epithelial transition factor,c-Met)等的多靶點二代抑制劑，它是一種于氨基吡啶嗪的小分子，對ALK具有潛在抑制能力[6-8]。因此，本文擬探討X-396對膿毒癥小鼠的保護作用，為臨床治療膿毒癥提供新的治療思路，并奠定研究基礎。

材料與方法

1 主要試劑與儀器

X-396(Ensartinib，恩薩替尼，貝達藥業(yè)股份有限公司)； 腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELISA試劑盒(DTA00D，美國R&D公司)； 干擾素-β(INF-β)ELISA試劑盒(DIFNB0，美國R&D公司)； 白介素-7(IL-7)ELISA試劑盒； 小動物氣體麻醉機(VMR，美國Matrx公司)； 獨立通氣籠(IVC)動物飼養(yǎng)系統(tǒng)(上海天煥科技發(fā)展有限公司)。

2 動物模型建立與分組

SPF級C57小鼠157只，體重20～25g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司[動物許可證：SCXK(京)2014-0004]。在超凈臺中進行模型的建立，術中嚴格無菌操作。切開腹部，找出盲腸端，盡量使糞便分布均勻，盲腸充盈度為厚度0.35～0.4cm，結扎盲腸端1cm長度，結扎后用16G針垂直穿透盲腸1孔，隨后將盲腸放回腹腔。縫合腹部切口。之后將模型動物放回IVC動物飼養(yǎng)系統(tǒng)，2只/籠，給予充分食物及飲水，相對濕度40%～70%，光照12h明暗交替，室溫20～23℃。按照隨機數(shù)字法分為對照組和治療組。治療組按照給藥方式和給藥劑量分為：口服組1(10mg/kg)、口服組2(20mg/kg)、腹腔組(10mg/kg)、靜脈組(10mg/kg)。實驗前禁食12h，不禁水。治療組于傷后2、24、48、72h，4、5、6、7d根據(jù)不同的分組方式每天給予X-396藥物1次，對照組以灌胃的方式口服等量對照溶劑。

3 主要檢測指標

3.1病死率：模型制作后，傷后0～48h，每2h觀察一次動物死亡情況并記錄； 傷后48～96h，每3h觀察一次動物死亡情況并記錄;傷后5～7d，每12h觀察1次動物死亡情況并記錄。

3.2肺、腎、肝組織HE染色：傷后第3天，分別取對照組和口服組1(X-396 10mg/kg)的小鼠左肺、左腎、肝右葉，依次進行4%多聚甲醛固定，脫水包埋，切片進行HE染色后，光鏡下觀察各組織病理變化情況。

3.3細胞因子檢測：靜脈采集30例健康人外周血2mL。將每例血標本分成2組，分別為脂多糖(LPS)刺激組(1mL)、LPS刺激+X-396組(1mL)。刺激濃度LPS 為100ng/mL,X-396 為10μM，37°C，刺激16h。刺激結束后經(jīng)1 000rpm，離心10min。吸取上層血漿，分裝為60μL/管保存于-80°C。應用二喹啉甲酸(BCA)法測定外周血總蛋白含量(具體步驟參照試劑盒說明書)，應用雙抗體夾心ELISA試劑盒檢測TNF-α、INF-β、IL-7濃度。

4 統(tǒng)計學分析

結 果

1 口服10mg/kg的X-396對膿毒癥有明顯保護作用

口服藥物X-396對小鼠CLP模型病死率具有顯著保護效果(P<0.01)。兩組在12h內均無動物死亡，口服組1病死率在24h～7d的各個時間點均顯著低于對照組，說明X-396能夠顯著降低膿毒癥小鼠的病死率。兩組的死亡高峰均集中在24～48h。見表1、圖1。

表1 對照組和X-396組病死率比較

圖1 對照組和口服組Kaplan-Meier生存曲線

口服X-396的給藥途徑，對小鼠病死率的保護效果最佳。在CLP模型的基礎上，筆者進行了3種給藥途徑的比較，結果表明：口服組1的病死率在24h～7d的各個時間點均顯著低于對照組； 腹腔組的死亡高峰集中在24h和48h兩個時間點，各時間點的病死率與對照組差異不明顯； 靜脈組在24h就出現(xiàn)死亡高峰，且4d的病死率達到100%。結果表明，口服X-396是降低小鼠膿毒癥病死率的最佳途徑。見表2、圖2。

表2 10mg/kg劑量下不同給藥途徑病死率比較

*P<0.05； #P<0.05； &P<0.05

10mg/kg和20mg/kg的給藥劑量相比，二者差異不明顯。在前期的研究基礎之上，筆者分別對兩組CLP小鼠模型進行10mg/kg和20mg/kg的口服X-396治療，實驗結果表明，兩種劑量對CLP小鼠的病死率均有保護效應，在24h～7d的各個時間點均顯著低于對照組。但兩組之間的保護效果差異并不明顯，提示口服X-396的較佳計量為10mg/kg。見表3、圖3。

表3 不同給藥劑量病死率比較

*P<0.05,#P<0.05

2 X-396處理對各組織病理變化的影響

肺組織病理切片顯示，對照組為中度炎癥及彌漫性肺水腫，肺間隔明顯增寬，X-396組為輕度炎癥及輕度肺水腫。腎臟病理切片顯示：與對照組比較，X-396組炎癥反應和腎小管水腫有所減輕； 肝臟病理切片顯示：對照組肝小葉、肝竇結構消失，肝細胞腫脹，伴有肝細胞變性壞死，X-396組肝組織結構正常，部分干細胞輕度腫脹，肝小葉結構可見。見圖4。

圖4 治療組與對照組肺、腎、肝病理切片比較(HE×200)。a.X-396口服組1第3天的肺輕度炎癥和水腫； b.對照組第3天的肺間隔明顯增寬，水腫增加； c.X-396口服組1第3天的腎臟腎小管輕度水腫； d.對照組第3天的腎臟腎小管明顯水腫； e.X-396口服組1第3天的肝臟肝組織結構正常； f.對照組第3天的肝臟肝竇結構消失，肝細胞腫脹

3 X-396處理后人外周血腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、干擾素-β(INF-β)、白介素-7(IL-7)水平檢測

(1)TNF-α水平：經(jīng)X-396處理后，外周血TNF-α的表達水平較單純LPS處理組明顯降低[(1091.6±240.2)pg/mLvs. (1590.0±638.5)pg/mL，P<0.01，圖5a]。(2)INF-β水平：X-396處理后，外周血INF-β的表達較單純LPS處理組明顯降低[(29.0±8.2)pg/mLvs. (41.8±12.8)pg/mL，P<0.05，圖5b]。(3)IL-7水平：經(jīng)X-396處理后，外周血IL-7的表達水平較單純LPS處理組明顯降低[(5.04±1.11)pg/mLvs. (6.72±1.79)pg/mL，P<0.05，圖5c]。提示X-396可以顯著降低炎癥反應水平，從而對膿毒癥起保護作用。

*P<0.05

討 論

膿毒癥的發(fā)病機制主要是由于微生物——特別是革蘭氏陰性菌入侵機體，刺激機體產(chǎn)生一系列模式識別受體(spattern recognition receptors，PRR)，從而激活了自身的天然免疫系統(tǒng)。不同的天然免疫細胞釋放多種化學物質如細胞因子、炎癥趨化因子、生長因子，這些物質進一步觸發(fā)促炎和抗炎的免疫反應，而促炎和抗炎的失衡又會導致器官功能障礙、器官損害，甚至死亡[9]。因此，尋找調控膿毒癥中主要免疫反應的關鍵炎癥調節(jié)因子，探尋維持天然免疫反應平衡的途徑，對膿毒癥的治療至關重要。

前期研究發(fā)現(xiàn)ALK是天然免疫蛋白STING的上游調節(jié)因子，利用ALK的抑制劑色瑞替尼可以抑制ALK-STING通路的活化，從而抑制宿主對炎癥的過度反應，提高對膿毒癥的抗性[5，10]。本研究在體實驗結果提示，X-396可以降低膿毒癥小鼠模型的病死率，故推測X-396可能通過抑制ALK-STING通路的活化，糾正了宿主對感染的過度反應，使小鼠對膿毒癥和感染性休克具有更強的抵抗力，提示ALK抑制劑有望成為治療人類膿毒癥的有效手段。

IFN-β、TNF-α以及IL-7均是膿毒癥感染的下游炎癥因子，IL-7是一種具有免疫效應的淋巴因子，能促進干擾素、腫瘤壞死因子等促炎細胞因子的分泌[11]。TNF-α由包括巨噬細胞在內的多種細胞產(chǎn)生，是一個重要多效細胞因子，在調節(jié)免疫反應中可作為促炎因子，啟動一系列促炎反應，系統(tǒng)內高水平的TNF-α可導致膿毒癥休克[12]。INF-β是一種由天然免疫細胞產(chǎn)生的細胞因子，屬于I型干擾素蛋白家族成員，在細菌感染和LPS刺激模型中，I型干擾素蛋白可促進膿毒癥休克的發(fā)展進程。有研究報道，TNF-β的表達可以增強促炎反應，并擴大LPS引起的內毒素休克[13]。在膿毒癥體外實驗中，筆者發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過ALK的抑制劑處理之后，各促炎因子表達水平明顯降低，提示過度的免疫反應得到調節(jié)。各組織的病理結果也顯示，經(jīng)過X-396處理后，膿毒癥小鼠的肺臟、腎臟、肝臟組織的炎癥情況得到明顯改善，因此，利用藥物阻斷ALK-STING信號通路，可能調節(jié)了膿毒癥的過度炎癥反應。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)抑制ALK的活化可以抑制STING通路及其下游促炎因子的過度表達，控制炎癥瀑布放大效應，從而降低膿毒癥的病死率。但ALK是否直接作用于STING，以及ALK下游的關鍵調節(jié)網(wǎng)絡尚未闡明，本研究僅為進一步研究ALK的調控機制及臨床應用奠定一定的研究基礎。