劉玉潔，胡海洋

（中國藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京211100）

2005年，羅氏推出了第一個(gè)商業(yè)化的二代測(cè)序平臺(tái)——454測(cè)序平臺(tái)[1]，結(jié)束了以Sanger測(cè)序?yàn)橹鲗?dǎo)的第一代測(cè)序時(shí)代[2]。2008年，Solexa/Ⅰllumina測(cè)序平臺(tái)和Applied Biosystems SOLiD測(cè)序平臺(tái)緊隨其后進(jìn)入市場(chǎng)[3-4]。與Sanger測(cè)序相比，二代測(cè)序（second-generation sequencing，SGS）技術(shù)可以在保證低成本的情況下，幾天之內(nèi)生成數(shù)十萬至數(shù)十億個(gè)25～800 bp的測(cè)序序列數(shù)據(jù)。憑借高通量的優(yōu)勢(shì)，SGS已經(jīng)占據(jù)了大部分的測(cè)序市場(chǎng)。但SGS無法實(shí)現(xiàn)對(duì)DNA準(zhǔn)確、全面的直接測(cè)序，對(duì)天然DNA測(cè)序前處理的每一個(gè)步驟都可能增加偏好和誤差，進(jìn)而導(dǎo)致測(cè)序結(jié)果出現(xiàn)錯(cuò)誤的風(fēng)險(xiǎn)；樣本前期需要經(jīng)過PCR進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增，這一過程中GC含量較高的區(qū)域無法利用PCR實(shí)現(xiàn)高效擴(kuò)增，加之測(cè)序序列讀長仍較短，這一系列不足導(dǎo)致其無法實(shí)現(xiàn)全基因組覆蓋。此外，雖然短讀長（short reads）可以較為準(zhǔn)確地檢測(cè)單核苷酸變異（single-nucleotide variations，SNVs），但難以檢測(cè)和表征結(jié)構(gòu)變異（structural variations，SVs）[5]。

為了解決一代和二代測(cè)序技術(shù)的局限性，高通量、長讀長且能實(shí)現(xiàn)無擴(kuò)增DNA直接測(cè)序的第三代測(cè)序（thirdgeneration sequencing，TGS）技術(shù)逐漸在測(cè)序領(lǐng)域嶄露頭角。TGS能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)DNA或RNA的直接測(cè)序，減少前期樣本的逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增步驟，克服讀長限制，實(shí)現(xiàn)全長測(cè)序。同時(shí)，TGS可以檢測(cè)例如DNA的甲基化等基因組修飾。測(cè)序技術(shù)發(fā)展到現(xiàn)在，市場(chǎng)上應(yīng)用的第三代測(cè)序技術(shù)主要是太平洋生物科學(xué)公司（Pacific Biosciences，PacBio）的單分子實(shí)時(shí)（single-molecule real-time，SMRT）測(cè)序技術(shù)和牛津納米孔技術(shù)公司（Oxford Nanopore Technologies，ONT）的單分子納米孔測(cè)序技術(shù)。本文將以TGS技術(shù)的發(fā)展和原理為出發(fā)點(diǎn)，闡述目前擁有諸多優(yōu)勢(shì)的TGS在生物學(xué)領(lǐng)域的革新。

1 第三代測(cè)序技術(shù)的原理

1.1 單分子實(shí)時(shí)測(cè)序

如圖1所示，SMRT測(cè)序技術(shù)需要使用雙鏈DNA（double-strand DNA，dsDNA）制備文庫[6]：將發(fā)夾結(jié)構(gòu)的銜接子連接到DNA分子的兩端，形成SMRTbell的環(huán)化測(cè)序模板[7]。將測(cè)序文庫加載到SMRT測(cè)序單元中，該單元包含納米級(jí)觀察室——零模式波導(dǎo)（Zero Mode Waveguides，ZMW）[8]。每個(gè)ZMW中的聚合酶引導(dǎo)熒光標(biāo)記的核苷酸合成待測(cè)DNA的互補(bǔ)鏈，ZMW底部的熒光監(jiān)測(cè)裝置實(shí)時(shí)記錄合成時(shí)的熒光信號(hào)，這些信號(hào)生成的測(cè)序數(shù)據(jù)稱為連續(xù)長讀（continuous long reads，CLR）[8]。在測(cè)序過程中可以實(shí)時(shí)檢測(cè)核苷酸的摻入率，核苷酸摻入之間的時(shí)間稱為脈沖間持續(xù)時(shí)間（interpulse duration，ⅠPD），這段時(shí)間的長短隨DNA表觀遺傳修飾的出現(xiàn)發(fā)生變化[9]。在測(cè)序過程中，聚合酶每次持有大約十二個(gè)核苷酸，因此單個(gè)核苷酸表觀遺傳水平的變化會(huì)影響周圍核苷酸的摻入率，這種變化會(huì)形成“指紋”[10]。不同的“指紋”對(duì)應(yīng)不同的表觀遺傳修飾，比如，m6A、m4C和m5C。2011年初，PacBio發(fā)布了利用SMRT技術(shù)發(fā)明的PacBio RS測(cè)序儀，該系統(tǒng)得益于天然高聚合酶的持續(xù)合成能力，起初的平均讀長相對(duì)較短（1.5 kb），平均錯(cuò)誤率較高（13%）[11]。隨著技術(shù)的發(fā)展，新測(cè)序儀Sequel的平均讀長增加了10倍以上，通量增加了100倍；得益于環(huán)狀模版的構(gòu)建和聚合酶合成能力的增強(qiáng)，現(xiàn)在可以實(shí)現(xiàn)對(duì)1～2 kb分子的多次測(cè)序，提高了測(cè)序準(zhǔn)確度。Sequel運(yùn)行時(shí)間短且讀長沒有受到過多限制，在基因組較短的病原體分子檢測(cè)方面具備優(yōu)勢(shì)[12-13]。該系統(tǒng)還可用于直接鑒定甲基化的堿基，研究核糖體轉(zhuǎn)移RNA動(dòng)力學(xué)，以及進(jìn)行RNA的直接測(cè)序[9，14]。

圖1 第三代測(cè)序技術(shù)原理

1.2 納米孔測(cè)序技術(shù)

利用納米孔對(duì)單鏈DNA或RNA分子進(jìn)行測(cè)序的概念起源于20世紀(jì)80年代末[14]。將測(cè)序銜接子和運(yùn)動(dòng)蛋白附著到待測(cè)DNA鏈上，在人工電阻膜上構(gòu)建生物納米孔并在膜上施加電壓，運(yùn)動(dòng)蛋白牽動(dòng)DNA單鏈的單個(gè)堿基依次通過納米孔。不同的堿基穿過孔時(shí)發(fā)生的電流偏轉(zhuǎn)不同，連續(xù)相同的堿基會(huì)使整個(gè)孔的電流變化持續(xù)時(shí)間變長，以圖1所示的檢測(cè)待測(cè)序列的堿基排列。理論上，納米孔測(cè)序技術(shù)無需進(jìn)行任何前期樣本處理即可分析極少細(xì)胞樣本的核酸分子并獲得長讀數(shù)據(jù)。除此之外，納米孔測(cè)序還可以直接從RNA甚至是被修飾的核苷酸中獲得序列信息。2014年，ONT發(fā)布了首款納米孔測(cè)序儀MinⅠON[15]，其具備便攜、測(cè)序快以及可實(shí)現(xiàn)樣本全長測(cè)序等優(yōu)點(diǎn)。與SMRT測(cè)序相比，納米孔檢測(cè)的序列長度不受技術(shù)本身的限制，測(cè)序的長度主要取決于DNA分子的長度，最大讀長可達(dá)1 Mb；每條DNA或RNA在納米孔測(cè)序平臺(tái)中只會(huì)被檢測(cè)一次，該特點(diǎn)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)測(cè)序樣本的定量；對(duì)DNA或RNA的直接測(cè)序減少了前期逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增步驟，不僅縮短了測(cè)序周期，還可實(shí)現(xiàn)核苷酸修飾的直接檢測(cè)。但納米孔測(cè)序無法像SMRT測(cè)序一樣對(duì)同一條鏈進(jìn)行多次測(cè)序，這造成了其相對(duì)較高的測(cè)序錯(cuò)誤率。據(jù)估計(jì)，R9.4芯片的納米孔測(cè)序數(shù)據(jù)錯(cuò)誤率在15%左右[16]。為了獲得更高的測(cè)序準(zhǔn)確性，ONT開發(fā)了一種針對(duì)dsDNA分子進(jìn)行測(cè)序的方法。在dsDNA單端使用發(fā)夾銜接子，確保第二條鏈在第一條鏈之后進(jìn)行測(cè)序，該系統(tǒng)稱為雙向（two-directional，2D）測(cè)序。該系統(tǒng)目前已經(jīng)被“1D2”系統(tǒng)取代，“1D2”使用特定序列的銜接子，該銜接子可以提高第一條鏈測(cè)序結(jié)束后第二條鏈繼續(xù)進(jìn)入測(cè)序孔的概率，這樣的改進(jìn)可以讓錯(cuò)誤率降低到3%。但因?yàn)槊總€(gè)分子的兩條鏈都進(jìn)行了測(cè)序，因此測(cè)序通量受到了影響，測(cè)序時(shí)間也延長了一倍。

2 第三代測(cè)序在生物學(xué)領(lǐng)域的革新

2.1 致病病原體的檢測(cè)

2.1.1 病毒的檢測(cè)

人類一直在尋找可以徹底消滅致病病毒以及及時(shí)應(yīng)對(duì)病毒突變的方法。2019年，在湖北武漢發(fā)現(xiàn)多起病毒性肺炎病例，該肺炎由嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合癥冠狀病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）引起，世界衛(wèi)生組織將其命名為COVⅠD-19。首個(gè)造成全人類疾病大流行的冠狀病毒SARS-CoV-2屬于RNA病毒，具備極高的變異速度。早期SARS-CoV-2的研究主要依賴于實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（real-time reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR），任何一個(gè)病毒檢測(cè)靶標(biāo)的突變都會(huì)降低現(xiàn)有檢測(cè)方法的靈敏度。

為確定更穩(wěn)定的SARS-CoV-2分子檢測(cè)靶點(diǎn)，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)SARS-CoV-2的突變，KELVⅠN等利用MinⅠON測(cè)序鑒定臨床樣本中SARS-CoV-2基因組的高表達(dá)區(qū)域。鑒定后發(fā)現(xiàn)位于SARS-CoV-2基因5’端的非結(jié)構(gòu)蛋白1（non-structural protein 1，nsp1）為高表達(dá)基因，并以此設(shè)計(jì)nsp1 RT-PCR驗(yàn)證其在臨床檢測(cè)中的高敏感性和特異性。

在SARS-CoV-2感染人類之前，VⅠEHWEGER等[17]就嘗試?yán)眉{米孔測(cè)序?qū)θ祟惙窝撞《荆℉CoV-229E）的全長RNA進(jìn)行直接的檢測(cè)，觀察其結(jié)構(gòu)變體并進(jìn)行修飾分析。TGS在病毒檢測(cè)中的應(yīng)用不只局限于基因組，KⅠM等[18]利用納米孔測(cè)序技術(shù)直接對(duì)病毒RNA進(jìn)行測(cè)序，在病毒轉(zhuǎn)錄本上找到了至少41個(gè)RNA修飾位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)修飾的RNA其poly（A）尾更短，表明RNA修飾與3’ploy（A）尾之間存在聯(lián)系。在轉(zhuǎn)錄組層面，研究發(fā)現(xiàn)的未知轉(zhuǎn)錄本和RNA修飾的功能可以為理解SARS-CoV-2的生命周期和致病性開辟新的方向。臨床應(yīng)用是實(shí)驗(yàn)研究的主要目的，公共衛(wèi)生緊急事件需要通過實(shí)驗(yàn)建立快速的測(cè)序報(bào)告和詳細(xì)的流行病學(xué)分析。MEREDⅠTH等[19]通過收集5 613例COVⅠD-19患者的臨床數(shù)據(jù)和樣本，建立SARS-CoV-2的納米孔測(cè)序診斷技術(shù)。通過基因組學(xué)分析，在159例患者數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)35個(gè)相同的病毒簇；經(jīng)流行病學(xué)分析，其中92名患者具有較強(qiáng)流行病學(xué)關(guān)聯(lián)。臨床、感染控制和醫(yī)院管理團(tuán)隊(duì)通過該診斷技術(shù)的反饋結(jié)果，可以盡快建立感染控制措施并告知患者安全報(bào)告。傳統(tǒng)的COVⅠD-19臨床診斷方法往往呈現(xiàn)較高的假陰性結(jié)果，MⅠNG等利用納米孔測(cè)序技術(shù)結(jié)合靶向擴(kuò)增開發(fā)了納米孔靶向測(cè)序（nanopore targeted sequencing，NTS），在6～10 h內(nèi)同時(shí)檢測(cè)SARS-CoV-2和其他呼吸道病毒，檢測(cè)結(jié)果顯示NTS對(duì)SARS-CoV-2的特異性達(dá)到100%。在疑似COVⅠD-19病例的61個(gè)核酸樣本檢測(cè)結(jié)果中，NTS可以靈敏地檢測(cè)到其中的22個(gè)陽性樣本；同時(shí)NTS可以有效監(jiān)測(cè)突變的核酸序列，對(duì)SARA-CoV-2進(jìn)行分類并檢測(cè)樣本中其他的呼吸道病毒。此外NTS可以進(jìn)一步擴(kuò)展，應(yīng)用到其他病原微生物的診斷當(dāng)中。綜上所述，TGS可以實(shí)現(xiàn)對(duì)病毒感染樣本的全基因組和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，確定高表達(dá)基因區(qū)域和結(jié)構(gòu)變體，及時(shí)發(fā)現(xiàn)高變異病毒的新監(jiān)測(cè)靶點(diǎn)，以便快速阻斷高突變病毒的傳播。

TGS在病毒檢測(cè)方面的應(yīng)用不僅僅局限于檢測(cè)靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)上，而且可以實(shí)現(xiàn)病毒全基因組測(cè)序，有助于病毒進(jìn)化的研究。2014年，MinⅠON首次應(yīng)用于西非埃博拉疫情的基因組檢測(cè)。在資源條件不足的西非，多個(gè)團(tuán)隊(duì)利用納米孔測(cè)序技術(shù)完成了疫情的應(yīng)急檢測(cè)和未知病原體的鑒定。2020年，JAN等將PCR、Ⅰllumina和MinⅠON測(cè)序相結(jié)合，在原有技術(shù)上進(jìn)行改進(jìn)。無論埃博拉病毒變異與否，該方法均可實(shí)現(xiàn)基因組快速精確的檢測(cè)。結(jié)合PCR和TGS，簡化后的病毒檢測(cè)可以從臨床樣本中成功檢測(cè)低豐度寨卡病毒基因，進(jìn)而建立病毒進(jìn)化樹，解析該病毒在感染地的傳播途徑，為干預(yù)病毒傳播提供關(guān)鍵數(shù)據(jù)支撐[20]。同年，STUBBS等[21]利用ONT MinⅠON測(cè)序設(shè)備對(duì)登革熱病毒基因的PCR擴(kuò)增序列進(jìn)行測(cè)序，可以實(shí)現(xiàn)近乎完整的編碼區(qū)覆蓋率。TGS技術(shù)在烈性病毒鑒定與進(jìn)化研究中的應(yīng)用，極大地解決了以往病毒檢測(cè)面臨的培養(yǎng)周期長、無法定性分析和不能確定未知病原體的問題，對(duì)未知病原體及時(shí)有效的診斷十分重要。

2.1.2 寄生蟲的檢測(cè)

致病病原體的概念不僅僅局限在微生物層面，緊急公共衛(wèi)生事件的始作俑者有時(shí)也可能是寄生蟲。TGS全長測(cè)序的特性可以實(shí)現(xiàn)特定致病生物的全基因組測(cè)序，進(jìn)而建立致病病原體耐藥性研究體系。寄生蟲自身基因組的可變性可以對(duì)人類機(jī)體的免疫應(yīng)答迅速做出反應(yīng)并產(chǎn)生耐藥性。比如，瘧原蟲的耐藥性主要是由細(xì)胞色素B、PfCRt、PfMDR1和K13基因的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）和不同突變點(diǎn)之間的組合造成的。為縮短藥物研發(fā)時(shí)間，提高尋找耐藥基因的準(zhǔn)確度，RUNTUWENE等[22]利用便攜的MinⅠON在野外首次成功鑒定惡性瘧原蟲的基因分型，利用MinⅠON鑒定的SNP信息以及K13突變基因，推斷出臨床瘧原蟲中的耐藥性狀態(tài)，及時(shí)調(diào)整藥物治療方案。研究寄生蟲的耐藥性只是TGS應(yīng)用的一個(gè)方面，TGS也可應(yīng)用于寄生蟲致病機(jī)理研究。LⅠECHTⅠ等[23]利用MinⅠON對(duì)萘氏飛虱的基因組進(jìn)行測(cè)序，通過長讀序列的組裝和基因修飾得到高質(zhì)量的基因組，預(yù)測(cè)可能會(huì)在萘氏飛虱發(fā)病機(jī)理中發(fā)揮重要作用的分泌蛋白。經(jīng)濟(jì)不發(fā)達(dá)的國家和地區(qū)是寄生蟲感染的高發(fā)地，由于醫(yī)療衛(wèi)生水平和測(cè)序水平較落后，在致病病原體感染暴發(fā)初期不能得到有效的控制。以MinⅠON為代表的TGS測(cè)序技術(shù)平臺(tái)具備良好的便攜性以及樣本處理簡易等特點(diǎn)，對(duì)于應(yīng)對(duì)需要緊急援助的公共衛(wèi)生事件至關(guān)重要，同時(shí)也使野外鑒定病原體基因型成為可能。

2.2 精準(zhǔn)醫(yī)療

TGS可以更好地為精準(zhǔn)醫(yī)療領(lǐng)域提供服務(wù)。2001年，人類基因組測(cè)序的第一稿完成。在二代測(cè)序技術(shù)的推動(dòng)下，經(jīng)過近二十年改進(jìn)得到的人類參考基因組（GRCh38）是目前最準(zhǔn)確、最完整的脊椎動(dòng)物基因組[24]，但其并未實(shí)現(xiàn)端粒到端粒的完整染色體測(cè)序。同時(shí)，一代和二代測(cè)序方法的局限性使人工拼接的染色體存在成百上千的缺口。隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，高通量、長讀長及低成本的TGS可以克服先前測(cè)序技術(shù)的缺點(diǎn)，使測(cè)序數(shù)據(jù)得以完整地覆蓋基因組。利用TGS，加州大學(xué)圣克魯斯分校聯(lián)合美國國家人類基因研究所（National Human Genome ResearchⅠnstitute，NHGRⅠ）首次合成人類X染色體完整序列,為血友病、慢性肉芽腫病和杜興式肌肉萎縮癥等多種X染色體關(guān)聯(lián)性疾病提供了研究基礎(chǔ)[25]。由此可見，基于TGS基因組測(cè)序的應(yīng)用進(jìn)一步推動(dòng)了精準(zhǔn)醫(yī)療的發(fā)展。

2.2.1 生物標(biāo)志物的探索

精準(zhǔn)醫(yī)療的應(yīng)用方向主要集中在癌癥治療研究領(lǐng)域，TGS可應(yīng)用于預(yù)測(cè)臨床上癌癥發(fā)生發(fā)展的相關(guān)生物標(biāo)志物。急性髓細(xì)胞性白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）是一種分子異質(zhì)性血液系統(tǒng)惡性腫瘤，基因的反復(fù)突變是患者治療和預(yù)后反應(yīng)異質(zhì)性的原因之一[26-27]。在AML臨床研究中，確定具有疾病預(yù)測(cè)性的生物標(biāo)志物是開展靶向治療或進(jìn)行預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)臨床試驗(yàn)的必要條件。CUMBO等基于納米孔測(cè)序技術(shù)建立了更為高效的檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)了AML中反復(fù)突變的六個(gè)基因（NPM1、FLT3、CEBPA、TP53、ⅠDH1和ⅠDH2）的快速測(cè)序。同樣是血液癌癥，慢性粒細(xì)胞白血?。╟hronic myrloid leukemia，CML）則是由9號(hào)染色體和22號(hào)染色體之間的易位產(chǎn)生BCR-ABL1融合蛋白引起的病變。臨床中，CML患者通常通過酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitors，TKⅠs）進(jìn)行治療，但該療法可誘導(dǎo)靶基因點(diǎn)突變導(dǎo)致耐藥性。CAVELⅠER等[28]構(gòu)建了一個(gè)約1.5 kb的BCRABL1 cDNA擴(kuò)增子，并利用SMRT進(jìn)行測(cè)序檢測(cè)TKⅠ的抗性突變，檢測(cè)閾值遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于Sanger測(cè)序。以癌癥為例，罹患同類癌癥的不同病人致病基因具有異質(zhì)性。TGS能夠?qū)崿F(xiàn)病患生物標(biāo)志物的個(gè)性化研究，推進(jìn)了個(gè)性化精準(zhǔn)醫(yī)療的應(yīng)用和發(fā)展。

2.2.2 人類表觀遺傳機(jī)制的探索

癌癥的發(fā)生通常伴隨著基因組表觀遺傳學(xué)修飾的改變。TGS利用電信號(hào)進(jìn)行測(cè)序的原理賦予其直接檢測(cè)堿基修飾的能力，為探索表觀遺傳學(xué)機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。表觀遺傳學(xué)機(jī)制雖不涉及基因組核苷酸的改變，但可通過表觀遺傳修飾介導(dǎo)下游基因表達(dá)模式發(fā)生改變，此現(xiàn)象可跨代遺傳。與單純研究遺傳因素相比，探索表觀遺傳學(xué)機(jī)制是解析疾病致病機(jī)理的又一重要研究方向。在1型糖尿病（diabetes mellitus type 1，T1D）中，表觀遺傳修飾異常（DNA甲基化、組蛋白修飾和microRNA失調(diào)）與致病基因表達(dá)的改變息息相關(guān)[29]。目前T1D主要的易感基因是HLAⅠⅠ類等位基因，具有50%的遺傳風(fēng)險(xiǎn)。已有研究表明，TGS與靶向捕獲技術(shù)聯(lián)用可實(shí)現(xiàn)人類白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）的高分辨基因分型及主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex,MHC）區(qū)域單倍體類型的精確鑒定[30]。SUZUKⅠ等[31]利用SGS和TGS進(jìn)行全長HLA等位基因測(cè)序，通過對(duì)46名健康受試者的基因組進(jìn)行測(cè)序，檢測(cè)到253個(gè)不同的等位基因，其中137個(gè)是新穎等位基因?；蚪M等位基因分辨率的提高增加了基因多態(tài)性，為精準(zhǔn)醫(yī)療和HLA相關(guān)疾病的研究提供理論依據(jù)。TGS節(jié)省了樣本前期的PCR過程，將原始基因組的表觀遺傳修飾完整地保留了下來，并利用電信號(hào)測(cè)序或熒光脈沖間時(shí)間的長短實(shí)現(xiàn)基因組修飾的檢測(cè)，這一點(diǎn)是SGS無法企及的。因此，TGS實(shí)現(xiàn)未擴(kuò)增樣本的測(cè)序不僅可以減少偏差，同時(shí)為表觀遺傳修飾的研究提供了可能。

3 展望

TGS克服了Sanger測(cè)序和SGS在樣本處理、測(cè)序通量和測(cè)序讀長上的限制。讀長的增加減少了基因組拼接的成本和時(shí)間，避免了PCR擴(kuò)增時(shí)可能引入的錯(cuò)誤，同時(shí)能夠?qū)崿F(xiàn)表觀遺傳中DNA的修飾和基因結(jié)構(gòu)變異方面的研究。此外，TGS也可以完成藥用植物的全基因組拼接，解析和健全藥用植物的分子作用機(jī)制。單萜吲哚生物堿（monoterpene indole alkaloid，MⅠA）包含3 000多種不同化學(xué)骨架的化合物，是中草藥中重要的有效成分，主要通過化學(xué)方法從長春花、夾竹桃和喜樹中提取。鑒于MⅠA復(fù)雜的化學(xué)性質(zhì)及其在藥用上的價(jià)值，需要研究MⅠA的基因簇在不同植物中是否一致，以及在不同的植物中是否存在加速M(fèi)ⅠA生物合成的分子。鉤吻是產(chǎn)生MⅠA的代表性植物之一，LⅠU等[32]借鑒棉花和人類基因組組裝的成功經(jīng)驗(yàn)，使用納米孔測(cè)序技術(shù)和高通量染色體構(gòu)象捕獲技術(shù)（high-throughput chromosome conformation capture techniques，Hi-C）組裝鉤吻基因組，研究合成MⅠA的基因序列，拓展中藥在臨床治療中的用途。

TGS的檢測(cè)速度和檢測(cè)長度的優(yōu)勢(shì)可以在緊急疫情爆發(fā)時(shí)發(fā)揮關(guān)鍵作用，符合國家衛(wèi)健委在《關(guān)于全面推進(jìn)社區(qū)醫(yī)院建設(shè)的通知》中將強(qiáng)化傳染病早發(fā)現(xiàn)、早報(bào)告能力作為社區(qū)醫(yī)院的主要建設(shè)任務(wù)之一的宏觀指導(dǎo)。花最少的時(shí)間獲得最多的候選病原體信息是快速應(yīng)對(duì)公共突發(fā)疫情的前提。中國疾病預(yù)防控制中心分別以Ⅰon Torrent PGM、PacBio SMRT Sequal和ONT MinⅠON這三個(gè)測(cè)序平臺(tái)為基礎(chǔ)建立病毒檢測(cè)工作流程（virus identification pipeline，VⅠP）[33]。該方案解決了TGS應(yīng)用到病毒檢測(cè)領(lǐng)域時(shí)所面臨的兩個(gè)重要問題：①是否可以從復(fù)雜的臨床樣本中準(zhǔn)確地識(shí)別出病毒；②能否完整覆蓋病毒全基因組。同時(shí)，通過比較不同的測(cè)序平臺(tái)數(shù)據(jù)得出結(jié)論：Sequal能夠準(zhǔn)確覆蓋病毒基因組，MinⅠON可以使用最低的成本實(shí)現(xiàn)最快的測(cè)序速度，盡管準(zhǔn)確度相對(duì)較低，但能夠完成病毒分類鑒定。這類流程的建立，推動(dòng)TGS快速準(zhǔn)確地應(yīng)對(duì)致病病原體的傳播。綜上所述，TGS不僅可以在傳染性疾病的及時(shí)診斷、精準(zhǔn)醫(yī)療、藥物研發(fā)等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，而且在中草藥有效成分的合成生物學(xué)領(lǐng)域具有重要的指導(dǎo)意義。第三代測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用如圖2所示。

目前的TGS技術(shù)同樣存在不足：①在實(shí)現(xiàn)DNA或RNA的全長測(cè)序時(shí)，對(duì)樣本本身的核酸質(zhì)量有很高的要求，測(cè)序前樣本的抽提必須盡可能減少人為造成的誤差；②TGS的測(cè)序錯(cuò)誤率仍然相對(duì)較高，這也是目前的TGS技術(shù)無法真正替代SGS的原因。但值得慶幸的是，測(cè)序技術(shù)的不斷改進(jìn)和算法的助力正在嘗試解決TGS面臨的瓶頸，幫助進(jìn)一步拓展其在生物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。

圖2 第三代測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用