郝小聰，王偉偉，張風廷，孫 瑞，房兆峰，柳 珊，曹志琛，朱文根，趙昌平，汪德州，唐益苗

（北京市農林科學院雜交小麥工程技術研究中心，北京100097）

0 引言

羥基苯丙酮酸還原酶(Hydroxyphenylpyruvate Reductase-HPPR)屬于D-異構體特異性2-羥基酸脫氫酶家族[1]。該家族中的酶以NADH或NADPH作為輔酶催化2-酮酸可逆地還原成D-2-羥基酸，糖酵解和檸檬酸循環(huán)是產生NADH的主要來源，NADH分子是線粒體中能量生產的控制指標[2]。研究發(fā)現(xiàn)HPPR對4-羥苯基丙酮酸(pHPP)具有最高的親和力，其中pHPP是植物光合作用的重要組成[3-4]，HPPR催化pHPP還原為4-羥苯基乳酸(pHPL)，是酪氨酸生物合成迷迭香酸Rosmarinic acid(RA)的關鍵酶[5-6]。

HPPR基因廣泛存在于植物中，擬南芥HPPR家族包含 4個HPPR基因 ，HPR1，HPPR2(AT1G79870)，HPPR3(AT1G12550)和HPPR4(AT2G45630)，其 中HPPR2和HPPR3編碼功能性羥基苯丙酮酸還原酶[7]。擬南芥中的HPR1是一種過氧化物酶體酶，參與了光呼吸循環(huán)，HPPR2、HPPR3和HPPR4負責將酪氨酸轉化為酚類化合物，并在胞質溶膠中為光呼吸循環(huán)提供支路，其中HPPR4催化活性較低可能參與其他生物學過程[8-9]。為進一步分析HPPR基因的時空表達模式，構建擬南芥過表達相應啟動子-GUS載體的轉基因植株，在幼苗中，HPPR2在植株中非特異性表達，HPPR3主要在根中表達，HPPR4主要在毛狀根和葉脈中毛狀體表達；在花序中，HPPR2再次廣泛表達，HPPR3和HPPR4在幼花的雄蕊中觀察到表達。其中HPPR4是花藥壁特異性基因，在花藥中特異性表達的，在特定階段阻斷了花藥的發(fā)育途徑，從而導致花藥發(fā)育異常[10]。丹參羥基苯丙酮酸還原酶(HPPR)基因SmHPPR在RA的生物合成中起重要作用。SmHPPR在莖和根中高度表達但在葉中弱表達，SmHPPR定位于細胞質中，SmHPPR含有特定的催化結構域與NAD(P)H結合，可能是光呼吸活性的細胞溶質NADPH依賴性羥基丙酮酸還原酶[11]。夏枯草羥基苯丙酮酸還原酶基因(PvHPPR)屬于2-羥基酸脫氫酶家族，PvHPPR基因在根中的相對表達量最高，受水楊酸和乙烯的調節(jié)，PvHPPR定位在內質網中，過表達PvHPPR基因發(fā)現(xiàn)PvHPPR蛋白參與夏枯草中迷迭香酸的生物合成，并獲得較高RA含量的毛狀根株系[12]。在紫蘇中擴增HPPR基因的啟動子序列，結果分析發(fā)現(xiàn)其啟動子序列包含多種順式作用元件，包括激素響應相關元件、逆境脅迫響應元件、光周期響應元件等[13]。但小麥HPPR基因的研究還未見報道。

小麥是中國的主要糧食作物，也是能最大限度適應惡劣環(huán)境條件的主要作物[14]，在全球范圍內也被廣泛種植[15]。逆境脅迫是導致作物減產的主要因素，其中高溫、干旱和鹽堿是限制作物產量的主要非生物脅迫因素，嚴重影響了作物生長、發(fā)育、結實，是全球減產的重要原因[16-17]。探明小麥抗逆機理對小麥育種和栽培具有重要意義。

本研究根據(jù)擬南芥中RA生物合成相關基因HPPR4(AT2G45630)的序列信息，通過同源克隆獲得HPPR4直系同源基因TaHPPR，并對該基因進行生物信息學分析及組織表達特異性分析。通過非生物脅迫處理，在鹽脅迫下該基因表達的抑制效果最顯著。以小麥抗鹽品種‘京冬8’、較敏感品種‘京411’和敏感品種‘小白麥’為研究對象[18]，進行小麥抗鹽性表達特性分析，為研究其對逆境脅迫應答的反應及對小麥抗鹽性的影響提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及其處理

本實驗室保存的‘太原806’、‘小白麥’、‘京冬8’及‘京411’為供試材料[19]。將‘太原806’種子在25℃的培養(yǎng)室中進行16 h/d的光照水培培養(yǎng)。幼苗水培生長2周（14天）后，進行干旱（濾紙吸干水，空氣中晾干）、脫落酸(200 mol/L ABA)、高 鹽(250 mmol/L NaCl)、低溫(4℃)的脅迫處理，然后取各種幼苗處理0、2、5、8、12、24 h后的葉片[20]。以同樣的條件對‘京冬8’、‘京411’、‘小白麥’種子進行高鹽(200 mmol/L NaCl)[21]脅迫處理，然后取各幼苗葉片，液氮冷凍，置于-80℃冰箱備用，便于進行接下來的目的基因脅迫表達分析。

取北京海淀種植的開花15天后‘太原806’的不同組織：根、莖、葉、小花（除雄蕊）、穎殼、葉鞘，液氮冷凍[22]，置于-80℃冰箱備用，便于進行接下來的目的基因組織特異性表達分析。

取均勻一致的‘京冬8’、‘京411’及‘小白麥’的種子，用0.1% HgCl2消毒5 min，清水沖洗干凈。發(fā)芽前未進行鹽脅迫處理，在25℃的培養(yǎng)室中進行每天16 h的光照水培培養(yǎng)，種子萌發(fā)3天后，選取萌發(fā)一致的小麥種子放入96孔水培盒中。將水培盒置于15℃的光照培養(yǎng)箱中，每天12 h光照，12 h黑暗，3個品種都進行0、200 mmol/L的2個濃度梯度水平的鹽脅迫處理，培養(yǎng)8天，然后統(tǒng)計根長、株高、干重、鮮重和根數(shù)的數(shù)據(jù)，用于分析小麥不同品種在鹽脅迫下幼苗生長狀況[23]。

1.2 提取RNA及合成cDNA

小麥不同組織器官和幼苗總RNA提取的主要試劑是Trizol、氯仿、異丙醇、無RNase的水[24]，在提取過程中，要盡量減少RNA的降解。提取完成的RNA測定OD260/280值，同時通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性，置于-80℃冰箱備用。用PrimeScriptRT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)試劑盒進行反轉錄反應，在PCR儀上進行變性、退火反應。合成后的cDNA置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 小麥HPPR蛋白TaHPPR編碼基因克隆

利用NCBI網站下載小麥基因TraesCS2B02G048000的序列。根據(jù)下載的序列設計引物TaHPPR-F/TaHPPR-R（表1），使用‘太原 806’的cDNA作為模板進行PCR擴增。擴增體系50 μL，包括2×Phanta Max Master Mix（Vazyme，南京）25 μL、上下游引物(10 μmol/L)各 2 μL、模板DNA(100 ng/L)2 μL、ddH2O 19 μL。擴增程序：95℃預變性3 min；95℃變性15 s，60℃退火15 s，72℃延伸1 min，35個循環(huán)；72℃延伸5 min，4℃保存。擴增產物為平末端，為了保證擴增產物的完整性，進行瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物的質量，目的片段經膠回收純化，并克隆到pEASY?-Blunt Cloning Ki（tTransGen，北京）載體上，加連接產物于Trans1-T1感受態(tài)細胞，涂板過夜，PCR鑒定陽性克隆，正確后每個樣品選取3個獨立克隆進行測序（北京六合華大基因公司）。

表1 引物名稱及序列

1.4 TaHPPR蛋白的生物信息學分析

從NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)網站下載該基因的蛋白序列；利用Pfam(http://pfam.xfam.org/)網站預測TaHPPR蛋白結構。以TaHPPR的蛋白序列為目標序列，在Gramene(WWW.gramene.org/)網站搜索，下載粗山羊草(Aegilops tauschii)、二粒小麥(Triticum dicoccoides)、短柄草(Brachypodium distachyon)、擬南芥 (Arabidopsis thaliana)、水 稻 (Oryza sativa)、大 豆(Glycine max)的同源蛋白序列，并在Pfam(http://pfam.xfam.org/)網站中對上述蛋白序列進行保守結構域分析，使用DNAMAN8軟件輸出序列比對結果。對于系統(tǒng)發(fā)育分析，使用MUSCLE(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/)進行多序列比對分析（參數(shù)使用網站默認參數(shù)），Alignment導出比對結果，在MEGA6.0軟件中創(chuàng)建系統(tǒng)進化樹，使用鄰接法和泊松校正模型，其中檢驗建樹質量的Bootstrap method（步長檢驗）值設置為1000次重復。

1.5 TaHPPR基因的表達分析

利用WheatExp(https://wheat.pw.usda.gov/Wheat Exp/)網站對小麥TaHPPR基因的表達進行預測分析，根據(jù)TaHPPR基因cDNA序列，避開保守結構域設計表達分析所用引物TaHPPR-qPCR-F/TaHPPR-qPCR-R（表1）。使用Actin作為內參基因，將之前提取的cDNA作為模板進行實時熒光定量PCR(qRT-PCR)分析。PCR反應體系為 25 μL，包括 TB Green PremixExTaqTMII(2×)(TliRNaseH Plus)，Bulk 12.5 μL、上下游引物(10 μmol/L)各 1 μL、cDNA 模板 2 μL(100 ng)，ddH2O 8.5 μL，輕彈管底將溶液混勻，短暫離心。PCR擴增于CFX96 Real-Time PCR Detection System儀（Bio-Rad，美國）上進行，反應程序為：95℃預變性30s；95℃變性5 s，60℃退火30 s，進行40個循環(huán)后增加熔解曲線環(huán)節(jié)，95℃變性5 s，60℃退火30 s，95℃變性15 s，用擴增曲線和熔解曲線鑒定引物特異性。每次反應作3次生物學重復，并采用2-△△CT法[25]計算基因相對表達量，同時計算其標準差。

1.6 小麥TaHPPR亞細胞定位分析

瞬時表達載體構建：利用同源克隆技術將小麥的TaHPPR基因CDS序列構建到p16318hGFP載體上，引物為TaHPPR-GFP-F/TaHPPR-GFP-R（表1），終載體為p16318hGFP-TaHPPR(35S::TaHPPR::GFP)。

1.7 小麥原生質體制備與轉化

酶解液溶液配方(10 mL)：15%纖維素酶(CellulaseR10)1 mL，4%離析酶(MacerozymeR10)1 mL，0.8 mol/L甘露醇5 mL，2 mol/L KCl 0.1 mL，0.2 mol/L 2-嗎啉乙磺酸(MES，KOH調pH至5.7)1 mL，55℃溶解10 min后再加入1 mol/L CaCl20.1 mL，1.5% BSA 1 mL，H2O 0.8 mL。40%(v/v)PEG solution(10mL)：PEG40004g，0.8mol/Lmannitol2.5 mL，1 mol/L CaCl21 mL，H2O 3 mL。W5(500 mL)：NaCl 9.0 g，CaCl218.4 g，2 mol/L KCl 1.25 mL，0.2 mol/L MES 5 mL。MMG solution(50 mL)：MgCl20.152 g，0.2 mol/L MES 1 mL，0.8 mol/L mannitol 25 mL。

新鮮配制酶解液，用0.45 μm的濾頭過濾除菌。幼苗水培1周（7天）后，取葉片制備原生質體。剪取中部生長良好的葉片用刀片切成0.5～1 mm寬的葉條，將切好葉條放入酶解液中，并用鑷子讓葉子完全浸入酶解液。用真空泵于黑暗中抽30 min。在室溫中50 r/min 28℃搖動，酶解5 h，酶解液變綠時輕輕搖晃培養(yǎng)皿。用等體積的W5溶液稀釋含有原生質體的酶液，過濾除去未溶解的葉片。用2.0 mL的離心管，4℃離心1～2 min沉淀原生質體，去上清，然后用1000 μL冰上預冷的W5溶液輕柔重懸原生質體。在冰上靜置30 min。離心去上清，然后用適量MMG溶液，重懸原生質體，加入10～20μL的質粒DNA，用移液器輕柔混勻后加入110μL PEG溶液，輕柔拍打離心管完全混合，誘導轉化混合物20～30 min。室溫下用400～440 μL W5溶液稀釋轉化混合液，然后輕柔上下顛倒離心管使之混合完全以終止轉化反應。室溫下離心2分鐘然后去除上清。再加入1 mL W5溶液懸浮清洗一次，離心2 min去上清。加入200 μL W5溶液25℃過夜避光培養(yǎng)。激光共聚焦顯微鏡下觀察GFP標簽表達。黃化苗原生質體的制備，參照上述方法。

2 結果與分析

2.1 TaHPPR基因的克隆及其編碼蛋白的結構分析

以‘太原806’的cDNA為模板，利用引物TaHPPRF/TaHPPR-R（表1）進行PCR擴增，擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，得到大小為1000 bp左右的單一條帶（如圖1）。將目的片段純化、克隆并測序后，得到長度為975 bp的序列。通過BLAST比對測序結果確定目的基因結構。TaHPPR轉錄本長度為975 bp，編碼324個氨基酸。利用NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）的 Conserved Domain Search Service(CD Search)，通過分析TaHPPR基因編碼的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)其含有NADB-Rossmann superfamily，TaHPPR屬于HPPR蛋白家族（如圖2）。

圖1 TaHPPR凝膠電泳擴增產物

圖2 TaHPPR保守結構域

2.2 TaHPPR同源蛋白序列的比對及進化分析

對TaHPPR及其同源蛋白序列比對結果發(fā)現(xiàn)，其與來源于二粒小麥(TRIDC2BG004220)、粗山羊草(AET2Gv20055400)、短柄草(BRADI_3g19270v3)、水稻(Os04g0107300)、大豆(GLYMA_07G082000)、擬南芥(AT2G45630)的NAD-binding domain蛋白序列相似性分別為100%、84%等。不同物種來源的HPPR蛋白均包含NAD-binding domain結構域，且保守性較高（圖3）。利用鄰接法構建進化樹，系統(tǒng)進化分析結果表明，單子葉和雙子葉植物中HPPR蛋白可分為兩類，其中小麥與二粒小麥親緣關系最近（圖4）。

圖3 TaHPPR與其他6種植物HPPR序列比對

圖4 TaHPPR與其他6種植物HPPR系統(tǒng)進化分析

2.3 TaHPPR基因的組織特異性表達分析

利用WheatExp(https://wheat.pw.usda.gov/Wheat Exp/)網站下載轉錄組數(shù)據(jù)，對小麥TaHPPR基因不同組織的表達分析表明：該基因在籽粒、葉、根、穗、莖中均有表達，而在根中表達量最高（圖5）。將1.1中保存的‘太原806’供試材料反轉錄cDNA進行熒光定量PCR，結果表明：TaHPPR基因在根中高度表達，在其他組織中相對表達量較低，此結果與小麥轉錄組數(shù)據(jù)庫結果基本吻合，TaHPPR基因可能在小麥根器官發(fā)育發(fā)揮作用。

圖5 小麥TaHPPR基因在不同組織器官中的相對表達量

2.4 TaHPPR基因在非生物脅迫下的表達分析

為進一步了解TaHPPR基因對逆境脅迫的響應，以提取的‘太原806’不同脅迫處理材料的cDNA作為模板，采用熒光定量PCR技術對高鹽、干旱、低溫和脫落酸(ABA)處理下的小麥幼苗中該基因的表達情況進行分析（圖6）。結果發(fā)現(xiàn)：在高鹽脅迫處理下，TaHPPR表達量隨處理時間延長持續(xù)下降，說明該基因表達受高鹽脅迫抑制；在干旱脅迫處理下，該基因表達量在2 h下降，在5 h上升，然后又持續(xù)下降，但表達量均低于未處理；在低溫處理下該基因表達量均有所下降，8 h達到最低值；在ABA處理下該基因表達量持續(xù)下降，24 h基本回復正常水平。以上結果表明，TaHPPR基因在高鹽、干旱、低溫、ABA誘導下表達均受到不同程度抑制，其中鹽脅迫下該基因表達的抑制效果最顯著。

圖6 小麥TaHPPR基因在不同脅迫處理下的相對表達量

2.5 小麥不同抗鹽性品種中TaHPPR基因的表達分析

小麥不同品種間抗鹽性存在明顯差異，為進一步研究該基因的鹽脅迫調控模式，選用了已報道過的抗鹽品種‘京冬8’、較敏感品種‘京411’和敏感品種‘小白麥’[18]進行鹽脅迫處理。為驗證‘京冬8’、‘京411’、‘小白麥’的抗鹽性，本研究對其進行了高鹽脅迫的鑒定試驗。所用的3個品種在受到相同濃度(200 mmol/L)的NaCl高鹽脅迫后，根長和株高、根數(shù)、干重、鮮重均低于對照組。其中3個品種處理后的株高，都與對照組存在極顯著差異；‘京411’處理后的根長存在極顯著差異；‘京411’與‘小白麥’處理后的鮮重存在極顯著差異，‘小白麥’干重實驗組與對照組存在極顯著差異。3個品種根數(shù)的處理組與對照組差異不顯著。綜上所述可以判斷‘京冬8’的抗鹽性明顯高于‘京411’和‘小白麥’（如圖7）。

圖7 小麥不同品種的抗鹽性鑒定

為了進一步了解高鹽脅迫條件下TaHPPR基因的表達情況，對抗鹽性不同的3個品種的鹽脅迫材料進行了實時熒光定量試驗。結果顯示該基因在‘京411’和‘小白麥’的鹽脅迫處理后的表達量均低于未處理，而在抗鹽性更強的‘京冬8’中，表達量高于對照組，且在24 h達到最高值，說明該基因可能參與抗鹽的調節(jié)（如圖8）。

圖8 小麥TaHPPR基因在不同品種鹽脅迫處理下的相對表達量

2.6 TaHPPR的亞細胞定位

通過瞬時表達系統(tǒng)，利用PEG介導轉化的方法轉化小麥原生質體，使用激光共聚焦顯微鏡觀察葉片原生質體細胞的GFP熒光位置，確定TaHPPR蛋白在植物細胞內的定位。結果（圖9）表明：明場下觀察所有細胞具有完整、規(guī)則的細胞形態(tài)，mCherry通道下，細胞內葉綠體自發(fā)熒光清楚，葉綠體形態(tài)良好，表明細胞生長發(fā)育正常。在488 nm激發(fā)光下，TaHPPR-GFP融合蛋白的綠色熒光清晰的聚集在細胞質中有點狀分布，而在只含GFP的對照細胞35S::GFP中，綠色熒光信號沒有明確的細胞器定位，綠色熒光在全細胞范圍彌散。將所有通道圖片整合后的Merged圖片顯示，初步判斷TaHPPR-GFP融合蛋白定位于線粒體中。

圖9 小麥TaHPPR蛋白的亞細胞定位

3 討論與結論

HPPR基因在植物中普遍存在，并且已經在擬南芥、丹參和紫蘇等植物中被報道[13]。然而作為世界最重要的糧食作物之一的小麥，目前HPPR相關基因尚未被報道。本研究基于擬南芥基因HPPR4基因序列，在小麥中同源克隆了該基因，序列比對結果表明，所有HPPR蛋白均包含NAD-binding domain結構域，且位置完全相同，進一步分析發(fā)現(xiàn)TaHPPR屬于HPPR蛋白家族。

TaHPPR基因在根、莖、葉、花、籽粒中均有表達，在根中高度表達，在其他組織中相對表達量較低，此結果與小麥轉錄組數(shù)據(jù)庫結果基本吻合，同時與擬南芥HPPR3主要在根中表達、HPPR4主要在毛狀根和葉脈中毛狀體表達、丹參SmHPPR在莖和根中高度表達但在葉中弱表達、夏枯草PvHPPR在根中的相對表達量最高的結果一致。該基因在小麥根器官表達量最高，原因可能是小麥等植物的耐鹽性與根尖細胞質膜上ATPase活性之間存在著非常顯著的正相關，一定范圍內的鹽脅迫，引起植物體內Na+的積累，導致根尖細胞質膜上的ATPase活化，因此增加了根細胞對Na+的清除并減少了Na+積累引起的破壞[26]；另一方面，小麥的根中基本不含有葉綠體，主要充斥著線粒體細胞器，進一步的亞細胞定位結果顯示TaHPPR蛋白定位于線粒體中，這一結果預示著其功能與線粒體有關，該基因可能通過線粒體影響活性氧的變化參與逆境脅迫調控過程。亞細胞定位結果與擬南芥HPPR1定位于過氧化物酶體、HPPR2和HPPR3、HPPR4定位于細胞質中，丹參SmHPPR定位于細胞質中，夏枯草PvHPPR定位在內質網中的結果存在差異，小麥作為六倍體植物基因家族成員眾多，可能功能調控更加細致多元化，具體原因還需進一步研究。

前人研究表明‘京冬8’品種在抗鹽方面表現(xiàn)為高抗、‘京411’表現(xiàn)為較敏感和‘小白麥’表現(xiàn)為中度敏感，本研究的結果與前人研究結果相一致，TaHPPR基因在不同耐鹽品種中的差異性表達變化說明TaHPPR基因的表達可作為耐鹽性檢測的參考指標，對雜交育種具有現(xiàn)實意義。TaHPPR基因在高鹽、干旱、低溫、ABA誘導下表達均受到不同程度抑制，其中鹽脅迫下該基因表達的抑制效果最顯著。在此基礎上，對抗鹽性不同的品種進行鹽脅迫處理，結果顯示：在‘京411’和‘小白麥’的鹽脅迫處理后的表達量均低于未處理組，而在耐鹽品種‘京冬8’中，鹽脅迫下TaHPPR基因表達上調，脅迫處理約24 h后表達量達到最高，說明該基因參與鹽脅迫應答，但TaHPPR基因通過何種途徑調控小麥抗鹽性，還需進一步研究。本研究推測，TaHPPR基因的精準表達調控是小麥鹽脅迫應答的重要指標，上述推論為小麥逆境脅迫應答反應及小麥抗鹽性研究提供了新的思路和方法。

小結：本文研究了小麥的羥基苯丙酮酸還原酶基因，其編碼324個氨基酸且含有NAD-binding domain結構域。系統(tǒng)進化分析發(fā)現(xiàn)了TaHPPR基因在不同植物物種間的進化保守性和變異性。組織表達分析發(fā)現(xiàn)TaHPPR基因主要在小麥根中表達；TaHPPR基因在低溫、干旱、高鹽和ABA脅迫處理下表達均有所下降；在抗鹽品種中，TaHPPR基因表達升高，而在敏感品種中，TaHPPR基因表達受到抑制。TaHPPR蛋白主要在線粒體中表達，過表達TaHPPR基因可能增加小麥的抗鹽性，其反應機制還需進一步研究。