李楠楠，李順成，韓玉林，鄒少奎，杜曉宇，楊光宇，王麗娜，張 倩，呂永軍

（周口市農(nóng)業(yè)科學(xué)院/河南省小麥種質(zhì)改良工程技術(shù)研究中心/河南省作物分子育種與生物反應(yīng)器重點實驗室，河南周口466001）

0 引言

小麥赤霉病(fusarium head blight，F(xiàn)HB)是廣泛發(fā)生在溫暖潮濕和半潮濕地區(qū)的一種毀滅性病害，由多種鐮刀菌引起[1-2]。中國是小麥赤霉病重發(fā)區(qū)，發(fā)生區(qū)域主要在長江中下游冬麥區(qū)和東北東部春麥區(qū)[3-4]。近年來隨著全球氣候變暖和小麥耕作制度的變化，病害逐漸向北蔓延至黃淮流域，黃淮麥區(qū)的赤霉病發(fā)生有越來越嚴(yán)重的趨勢。2001—2018年有9個年份小麥赤霉病的發(fā)生面積超過333萬hm2，2012年赤霉病發(fā)生更加嚴(yán)重，超過1000萬hm2，對小麥生產(chǎn)構(gòu)成嚴(yán)重的威脅。目前，全世界尚缺乏高抗赤霉病或免疫的小麥品種，因此，進行小麥品種抗性改良，培育抗性品種是減輕小麥赤霉病危害的根本途徑?？钩嗝共〉腝TLs的不斷發(fā)掘?qū)⒋蟠蠹涌炜剐曰蛳蜻m應(yīng)性良好的栽培品種的轉(zhuǎn)移。據(jù)報道，利用分子標(biāo)記輔助選擇育種技術(shù)，已經(jīng)在瑞士[5]、加拿大[6]、美國[7]、巴西[8]、日本[9]等選育出抗性顯著提高的小麥新品種。分子標(biāo)記輔助選擇不僅解決表型鑒定不穩(wěn)定的難題，還可提高選擇效率，縮短育種年限，具有很大的優(yōu)越性[10-11]。國內(nèi)外學(xué)者利用分子技術(shù)對小麥赤霉病抗性做了大量研究，已經(jīng)鑒定和定位了分布在小麥21條染色體上250多個與抗赤霉病相關(guān)的QTLs[12-13]，目前公認(rèn)的抗性最穩(wěn)定和效應(yīng)最大的抗性基因是Fhb1。Waldron等[14]首先報道‘蘇麥3號’3BS上的赤霉病抗性基因Fhb1。另外，在‘望水白’、‘黃方柱’、日本品種‘NyuBai’等多個抗源中也存在Fhb1基因[15]。Anderson等[16]研究認(rèn)為Fhb1能解釋41.6%和24.8%的表型變異。Cuthbert等[17]研究Sumai3*5/Thatcher群體時，將Fhb1定位在XSTS3B-80～XSTS3B-142之間，遺傳距離為1.27 cM。賈海燕等[18]采用遺傳和BAC-物理作圖的方法，通過研究來源于‘望水白’的材料，將Fhb1基因精細(xì)定位在SSR標(biāo)記Xwgrb597～Xmag9404之間，遺傳距離為0.19 cM。董晶晶等[19]利用‘黃方柱’和‘Wheaton’衍生的RIL群體對Fhb1進行精細(xì)定位，將其定位在分子標(biāo)記X2214～X2357之間。2016年Rawat等[20]報道了Fhb1基因克隆的結(jié)果。Fhb1編碼一種帶有凝集素結(jié)構(gòu)域以及類毒素成孔結(jié)構(gòu)域的嵌合凝集素(pore-forming toxin-like，PFT)，通過突變體分析、基因過表達和沉默等試驗證實了PFT就是Fhb1編碼的基因。朱展望等[21]研究認(rèn)為目前利用標(biāo)記輔助選擇Fhb1的限制因素是缺乏低成本的診斷性標(biāo)記，雖其連鎖標(biāo)記在Xgwm493、Xgwm533、UMN10和Xsnp3BS-8等在育種中有一定應(yīng)用[22-23]，但均受遺傳背景影響較大[24]。Rawat等證明Fhb1為PFT基因，對PFT鄰近基因His測序發(fā)現(xiàn)His位點的多態(tài)性，進而開發(fā)出Fhb1診斷性標(biāo)記His-InDel，該標(biāo)記擴增穩(wěn)定、片段差異大、用瓊脂糖凝膠電泳即可檢測，成本較低，是理想的育種標(biāo)記。本研究利用與抗赤霉病基因Fhb1緊密連鎖的診斷性標(biāo)記His-InDel篩選‘周麥’改良抗性材料，配合田間單花滴注接種鑒定材料抗性，旨在通過分子檢測改良抗赤霉病小麥品系，加速‘周麥’的抗赤霉病育種。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究利用本地主栽‘周麥’品種（系‘）周麥22號’、‘周麥32號’、‘周11550’等與綜合性狀良好的抗赤霉病小麥品種‘寧麥9號’‘、生選6號’‘、揚麥21’等配置一系列雜交組合，經(jīng)選擇獲得F3株系113個、F4株系188個、F5株系178個、F6株系142個，總共621個株系。

田間接種鑒定中，將黃淮麥區(qū)的中感赤霉病品種‘淮麥20’作為對照材料，當(dāng)單花滴注后‘淮麥20’發(fā)病達到3級以上，抗赤霉病鑒定視為有效[25]。

1.2 田間試驗設(shè)計

2011—2017年在周口市農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗基地進行雜交和后代單株選擇。2017年秋播同時將F3～F6后代種植于抗赤霉病鑒定圃，每個株系種植2行，寬窄行(20 cm+40 cm)，行長3 m，穴播。

1.3 抗赤霉病鑒定方法

將河南省農(nóng)科院宋玉立研究員提供的5個赤霉菌菌 株（14F3-8、10YY1-3、14LY9-2-4、14ZK1-4 和14AY1-2）和江蘇省農(nóng)科院張旭研究員提供的3個赤霉菌菌株（HG-1、J15和F0609）分別制備為分生孢子混合液（5×105孢子/mL）。在2018年小麥開花初期（10%麥穗揚花），采用單花滴注的方法[26]，將孢子懸浮液20 μL注入第5個小穗內(nèi)（方向為由上而下），并對接種穗進行剪芒標(biāo)記，每份材料接種10穗。接種后套袋保濕72 h，隨后定期利用迷霧裝置（自走式平移噴灌機，艾瑞德Irritech農(nóng)業(yè)機械有限公司，中國安徽）噴霧保證田間濕度利于病害的發(fā)生。

1.4 統(tǒng)計分析

接種后第21天調(diào)查所有接種材料的發(fā)病情況，根據(jù)病害癥狀描述（0級，接種小穗無可見發(fā)病癥狀；1級，僅接種小穗發(fā)病，或相鄰的個別小穗發(fā)病，但病斑不擴展到穗軸；2級，穗軸發(fā)病，發(fā)病小穗占總小穗的1/4以下；3級，穗軸發(fā)病，發(fā)病小穗占總小穗的1/4～1/2；4級，穗軸發(fā)病，發(fā)病小穗占總小穗的1/2以上），逐份統(tǒng)計10個接種穗的發(fā)病情況，并依據(jù)病害輕重確定每個接種穗的嚴(yán)重度分級。分別計算河南和江蘇菌株病害嚴(yán)重度的平均值，依據(jù)平均嚴(yán)重度標(biāo)準(zhǔn)（高抗R，0＜平均嚴(yán)重度＜2.0；中抗MR，2.0≤平均嚴(yán)重度＜3.0；中感MS，3.0≤平均嚴(yán)重度＜3.5）確定材料對赤霉病的抗性水平[25]。

1.5 DNA提取

在大田剪取各株系的新鮮嫩葉片1～2 g，裝入自封袋中并編號，放入-20℃冰箱備用。參照Saghai-Maroof等[27]報道的CTAB法提取葉片基因組DNA。

1.6 SSR分析

按照朱展望[21]開發(fā)引物His-InDel的PCR反應(yīng)體系，總體積 20 μL，含 2× PCR Mix（0.1 U/μLTaq酶、500 μmol/L dNTPs、20 mmol/L Tri-HCl、10 mmol/L KCl、3 mmol/L MgCl2）10 μL，DNA 模板(50 ng/μL)2 μL，上下游引物(10 μmol/L)各 0.5 μL，ddH2O 7 μL。擴增程序為：95℃預(yù)變性 3 min；94℃變性30 s，65℃退火30 s，68℃延伸2.5 min,，共33個循環(huán)；最后68℃延伸7 min，4℃保存。PCR反應(yīng)在PCR儀（S1000，Bio-Rad，美國）上進行。PCR擴增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.7 數(shù)據(jù)分析

用DPS 9.5數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（中國）和Excel 2007軟件（美國）對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試材料的抗赤霉病鑒定

來源于河南省和江蘇省的赤霉菌菌株接種供試材料，每份材料分別接種10穗?？共⌒澡b定結(jié)果（表1）顯示，對河南赤霉菌表現(xiàn)高抗的材料占總數(shù)的7.9%、中抗占27.2%，比對江蘇赤霉菌表現(xiàn)高抗和中抗的材料多4和7.2個百分點；對河南赤霉菌表現(xiàn)中感和高感的材料占總數(shù)的38.6%和26.3%，比對江蘇赤霉菌表現(xiàn)抗性的材料少6.9和4.3個百分點，表明供試材料對江蘇赤霉菌的抗性比河南赤霉菌弱。

表1 2018年供試材料田間接種抗性鑒定結(jié)果

圖1表明，抗病親本‘寧麥9號’、‘生選6號’、‘揚麥21號’田間鑒定為中抗以上水平，而感病親本‘周麥22號’、‘周麥32號’田間鑒定為高感，‘淮麥20號’是黃淮麥區(qū)的中感對照，田間鑒定為中感，說明人工接種鑒定的發(fā)病情況比較充分。

按世代和赤霉菌來源分別對后代材料進行赤霉病抗性對比分析。江蘇赤霉菌侵染鑒定結(jié)果顯示，鑒定為中感的材料在每個世代的比例都是最高的（F3為 50.4%，F(xiàn)4為 45.7%，F(xiàn)5為 42.7%，F(xiàn)6為 45.1%）。而河南赤霉菌田間侵染結(jié)果表明，F(xiàn)3植株表現(xiàn)最多的抗性級別為中感，有53個株系，占F3材料的46.9%；同時F4最多的是高感(42.0%)，F(xiàn)5最多的是中感(39.9%)，F(xiàn)6最多的是中抗(47.9%)，高世代的抗性較低世代穩(wěn)定提高，表明每年通過田間鑒定選擇農(nóng)藝性狀和抗性兼?zhèn)涞牟牧线M入下一代能夠顯著提高材料的群體抗性，單花滴注接種鑒定能有效改良小麥的赤霉病抗性。

2.2 抗赤霉病基因分子標(biāo)記檢測供試材料

利用在3BS上Fhb1基因的診斷性標(biāo)記His-InDel對雜交親本‘周麥22’、‘周麥32’、‘周11550’和‘寧麥9號’、‘生選6號’、‘揚麥21號’進行分子檢測。結(jié)果表明，‘寧麥9號’、‘生選6號’、‘揚麥21號’擴增片段為1309 bp，含有Fhb1基因；‘周麥22號’、‘周麥32號’、‘周11550’等不含F(xiàn)hb1基因的擴增片段在2000 bp左右，與‘寧麥9號’等含F(xiàn)hb1的品種差異明顯（圖2）。同時，利用該標(biāo)記對621個后代材料進行基因型分析，檢測出210個株系攜帶Fhb1基因，其中田間鑒定表現(xiàn)高抗的材料有48個、中抗的有119個、中感的有34個、高感的有9個，中抗以上材料占比79.5%；不攜帶Fhb1基因的株系有411個，只有1個株系表現(xiàn)高抗，中抗的50個，中感、高感的分別是206、154個，感病材料占比87.6%（表2）。圖1中GD1(+)、GD2(+)、GD3(+)為3個攜帶Fhb1基因的高代材料，田間鑒定為中抗—高抗；GD4(-)、GD5(-)、GD6(-)為3個不攜帶Fhb1基因的高代材料，田間鑒定為高感。這說明分子標(biāo)記檢測與人工接種鑒定結(jié)果的趨勢一致，通過分子標(biāo)記檢測Fhb1基因結(jié)合田間抗性鑒定選擇效率很高。

表2 2018年周麥后代材料中Fhb1的檢測結(jié)果

圖1 單花滴注鑒定雜交親本、攜帶和不攜帶Fhb1基因的后代材料的田間抗性表現(xiàn)

圖2 His-InDel標(biāo)記對親本和部分后代的擴增結(jié)果

2.3 田間鑒定材料在攜帶Fhb1基因和不攜帶之間的差異性分析

用Fhb1的分子標(biāo)記His-InDel在后代中共篩選出210份材料，沒有篩選出抗性條帶的材料有411份。把含有Fhb1基因和不含F(xiàn)hb1基因的材料分為2組，田間調(diào)查每份材料的平均嚴(yán)重度。利用DPS軟件統(tǒng)計這2組之間田間鑒定的差異是否顯著。F＞F0.01，表明2組材料的抗性差異達極顯著水平，含有Fhb1基因的抗赤霉性明顯高于不含F(xiàn)hb1基因的材料（表3～4），表明通過Fhb1基因連鎖的分子標(biāo)記輔助選擇育種提高赤霉病抗性是有效的。

表3 含F(xiàn)hb1與不含F(xiàn)hb1材料之間平均嚴(yán)重度方差分析

表4 攜帶Fhb1與不攜帶Fhb1的材料之間抗赤霉性的差異顯著性（LSD法）

3 討論

3.1 不同來源赤霉菌的抗性接種鑒定

小麥赤霉病抗性田間接種鑒定與評價方法有很多種，抗侵染一般采用土表撒病麥粒和穗部噴孢子懸浮液進行接種鑒定，評價方法一般采用病情指數(shù)和平均嚴(yán)重度。而單花滴注接種被廣泛應(yīng)用于抗擴展的鑒定，調(diào)查接種穗的平均嚴(yán)重度作為抗性分級的評價標(biāo)準(zhǔn)[25]。本研究所使用的病原菌孢子分別來源于江蘇省和河南省2類不同的生態(tài)區(qū)環(huán)境，在孢子濃度、接種套袋保濕、溫度濕度、土壤和評價標(biāo)準(zhǔn)均一致的條件下，調(diào)查不同地域環(huán)境的病原菌孢子之間的抗性差異，試驗結(jié)果誤差小，可信度較高。結(jié)果表明后代材料對來源于江蘇省的赤霉菌比來源于河南省的抗性弱，這可能與長江中下游地區(qū)長期受赤霉病菌危害，而河南省所在的黃淮麥區(qū)歷史上一直不是赤霉病的高發(fā)區(qū)域，而兩地的生態(tài)環(huán)境不同導(dǎo)致赤霉病菌種的致病力也不同。

本研究以本地主栽半冬性、感赤霉病‘周麥’品種（系）‘周麥22號’、‘周麥32號’、‘周11550’為母本，長江中下游抗赤霉病品種‘寧麥9號’、‘生選6號’、‘揚麥21號’為父本配置雜交組合，通過田間單花滴注接種鑒定獲得F3～F6代材料。結(jié)果顯示，這些材料比高感親本‘周麥22號’等赤霉病抗性有顯著提升。不過，黃淮麥區(qū)不是赤霉病表型鑒定的理想環(huán)境，穩(wěn)定的表型鑒定環(huán)境一直是本地區(qū)小麥抗赤霉病育種的難題，所以完善赤霉病抗性鑒定技術(shù)，是篩選抗性品種的重要研究工作。

3.2 抗赤霉病分子標(biāo)記輔助選擇及其應(yīng)用前景

分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)具有準(zhǔn)確、快速、實用和不受外界環(huán)境影響等特點，比表型鑒定更有優(yōu)勢。目前有許多利用這種技術(shù)實現(xiàn)抗病改良的報道。Fhb1已被證明是抗性最強且穩(wěn)定的抗赤霉病基因，周淼平等[28]研究‘蘇麥3號’與感病材料重組自交系群體中，發(fā)現(xiàn)位于3B上的抗赤霉病Fhb1基因兩側(cè)的分子標(biāo)記Xgwm533和Xgwm493。此后，許多學(xué)者在不同遺傳背景下研究利用這2個標(biāo)記進行抗性選擇具有較高的效率[10-11,29]。Liu等[22]開發(fā)出共顯性標(biāo)記UMN-10，與Fhb1基因連鎖更加緊密，比SSR標(biāo)記選擇效率更高。本研究選擇朱展望等開發(fā)的診斷性標(biāo)記His-InDel，利用該標(biāo)記鑒定材料穩(wěn)定準(zhǔn)確，是理想的育種標(biāo)記。結(jié)果表明，抗赤霉病親本‘寧麥9號’、‘生選6號’、‘揚麥21號’均含有Fhb1基因，而感病親本‘周麥22號’、‘周麥32號’均不含F(xiàn)hb1基因，說明Fhb1基因能有效地鑒定小麥赤霉病的抗性。后代中不含F(xiàn)hb1基因的411份材料中，也有51份中抗以上的材料，又表明除Fhb1基因外還可能攜帶其他抗赤霉病基因發(fā)揮作用。

為進一步利用Fhb1基因提高分子標(biāo)記輔助選擇效率，采用標(biāo)記單體型輔助選擇和標(biāo)記組輔助選擇，能夠很好地彌補單一分子標(biāo)記的不足。多個SSR位點可以明顯在抗感品種中形成不同的單體型。Yu等[30]研究認(rèn)為在抗赤霉病QTL區(qū)域和抗病品種‘蘇麥3號’相同的SSR標(biāo)記有利等位數(shù)目，會影響抗性的強弱，在3BS上的QTL位點，1個SSR和‘蘇麥3號’等位，沒有2～3個SSR和‘蘇麥3號’等位的抗性強。說明針對‘蘇麥3號’有利等位的SSR標(biāo)記組或者組成的單體型全部有利等位位點的選擇要明顯優(yōu)于針對單個SSR的選擇。Arruda等[31]利用GWAS分析，與Fhb1基因關(guān)聯(lián)的4個SNP位點中，同時存在4個SNP位點其赤霉病抗性明顯高于只有1個或者2個SNP位點，這為下一步的工作指明了研究方向。另外，最新研究表明，通過生物工程方法控制TaHRC序列來提高小麥對FHB的抗性是一條新途徑。Su等[32]認(rèn)為TaHRC基因是Fhb1介導(dǎo)的FHB耐藥的關(guān)鍵決定因素，該基因編碼一個假定的富含組氨酸的鈣結(jié)合蛋白。證明了TaHRC編碼了一個具有FHB易感性的核蛋白，并且該基因起始密碼子的缺失導(dǎo)致了FHB的抗性，開發(fā)了TaHRCGSM分子標(biāo)記用于診斷缺失突變。

小麥赤霉病抗性屬于典型的多基因控制的數(shù)量性狀[33]，主要有抗侵入、抗擴展、抗DON毒素積累等類型[34]。育種上要把多個抗赤霉病基因聚合在一起難度很大，‘周麥’系列抗赤霉病育種可以采取循序漸進的方法，通過分子標(biāo)記輔助選擇，把主效Fhb1基因轉(zhuǎn)育到主栽品種（系）中，快速改良育成品種的赤霉病抗性水平，再進行多個抗赤霉病基因的聚合，達到進一步提高小麥赤霉病抗性的目的。可以預(yù)期的是，小麥大面積豐產(chǎn)性與抗赤霉病性結(jié)合的育種目標(biāo)是可以實現(xiàn)的?！茺湣屈S淮南片最重要的系列品種之一，提升‘周麥’品種整體的抗赤霉病水平對增加本地小麥的產(chǎn)量和品質(zhì)、提高社會經(jīng)濟效益具有十分重要的意義。