張 爽，張巍巍，李 穎，馬紅梅，馮寶立，張茂俊，陳 倩，王麗麗

產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens，C.perfringene)是一種條件致病菌，能引起人類氣性壞疽和食物中毒等疾病。該菌可產(chǎn)生至少16種毒力因子，包括α-ν 12種毒素、腸毒素、溶血素和神經(jīng)氨酸酶[1]，其中腸毒素(CPE)和β2腸毒素與胃腸道疾病密切相關(guān)[2-3]。腸聚集性大腸埃希菌(EnteroaggregativeEscherichiacoli，EAEC)是5種致瀉性大腸埃希菌中的一種，曾在世界各發(fā)達(dá)和發(fā)展中國家引起散發(fā)或暴發(fā)流行[4-7]，易感染營養(yǎng)不良兒童和免疫力低下的人群[8]。EAEC在本地區(qū)散發(fā)病例中廣泛流行[9]。

本研究對2018年北京市一起腹瀉暴發(fā)事件中分離到的C.perfringens和EAEC進(jìn)行病原特征分析，為此類混合感染暴發(fā)事件的實驗室應(yīng)對提供經(jīng)驗。

1 材料與方法

1.1材 料

1.1.1樣本采集與流行病學(xué)調(diào)查 2018年5月7日北京市某醫(yī)院腸道門診接診9例以腹痛、腹瀉為主要癥狀，有共同就餐史的學(xué)生患者。所有病例均來自一個學(xué)生團(tuán)，該團(tuán)共15人，其中學(xué)生14人，生活老師1人，共有9名學(xué)生發(fā)病。該團(tuán)成員均于5月6日晚18點在新疆烏魯木齊就餐，晚20點乘飛機至北京。首發(fā)病例發(fā)病時間為5月7日早3點，末例病例發(fā)病時間為早8點，流行曲線為單峰曲線，呈點源傳播特征。我們采集全部9名病例糞便樣本送至疾病預(yù)防控制中心實驗室檢測。

1.1.2試劑與儀器 麥康凱瓊脂(MAC)、胰胨亞硫酸鹽環(huán)絲氨酸瓊脂(TSC)、哥倫比亞血瓊脂(北京陸橋)；細(xì)菌 DNA 提取試劑盒(德國Qiagen)；細(xì)菌、病毒實時熒光 PCR 檢測試劑盒(北京卓成惠生及青島中創(chuàng))；普通PCR反應(yīng)液體系液(日本TaKaRa)；限制性內(nèi)切酶XbaI、SmaI(美國NEB)；革蘭陰性需氧菌藥敏檢測板(上海星佰)；脈沖場凝膠電泳儀(美國Bio-Rad)；細(xì)菌鑒定儀Vitek2 Compact 3.0(法國梅里埃)。

1.2方 法

1.2.1病原體分子篩查 應(yīng)用北京卓成惠生公司的五種致瀉大腸(貨號A211L)、沙門氏菌(貨號A2060)、志賀菌(貨號A2070)、空腸彎曲菌與結(jié)腸彎曲菌(貨號A2242)、副溶血性弧菌(A2050)、輪狀病毒和諾如病毒(貨號A2593)、札如病毒/腺病毒/星狀病毒(貨號A2723)以及青島中創(chuàng)公司的產(chǎn)氣莢膜梭菌(產(chǎn)品編號ZC-RT-PCR-046)熒光定量PCR檢測試劑盒對9份病例糞便核酸進(jìn)行常見的腸道病原篩查。

1.2.2細(xì)菌分離培養(yǎng)和毒力基因檢測 糞便樣本接種MAC瓊脂，37 ℃培養(yǎng)24 h，從平板挑選10個可疑菌落進(jìn)行5種致瀉性大腸埃希菌毒力基因鑒定[10]，通過熒光定量PCR檢測escV、eae、bfpB、stx1、stx2、lt、st、invE、ipaH、aggR、uidA、astA、pic等基因判定所挑菌落是否為EPEC、STEC/EHEC、EIEC、ETEC、EAEC中的一種；采用傾注法將糞便接種TSC瓊脂，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，挑取10個黑色菌落進(jìn)行牛奶發(fā)酵等C.perfringens確證實驗[11]，采用普通PCR方法對鑒定為C.perfringens菌株進(jìn)行6種毒力基因檢測[12]。

1.2.3EAEC菌株的耐藥性檢測 采用微量肉湯稀釋法進(jìn)行抗生素敏感試驗，依據(jù)CLSI M100-S28判定耐藥、中介、敏感。抗生素包括青霉素類：氨芐西林(Ampicillin, AMP)、芐西林/舒巴坦(Ampicillin/Sulbactam, AM)；一代頭孢：頭孢唑林(Cefazoin, CFZ)；二代頭孢：頭孢西丁(Cefoxitin, CFX)；三代頭孢：頭孢他啶(Ceftazidime, CAZ)、頭孢噻肟(Cefotaxime, CTX)；碳青霉烯類：亞胺培南(Imipenem, IMI)；大環(huán)內(nèi)酯類：紅霉素(Erythromycin, ERY)、阿奇霉素(Azithromycin, AZM)；四環(huán)素類：四環(huán)素(Tetracycline，TET)；喹諾酮/氟喹諾酮類：萘啶酸(Nudic Acid, NAL)、環(huán)丙沙星(Ciprofloxacin, CIP)；氯霉素類：氯霉素(Chloramphenicol, CHL)；氨基糖苷類：慶大霉素(Gentamicin, GEN)；磺胺類：復(fù)方磺胺(Trimeth-sulfame, SXT)；測試抗生素共計包括7大類15種(青霉素類、頭孢類和碳青霉烯類均歸為β內(nèi)酰胺類)。

1.2.4菌株分子分型檢測 菌株分子分型使用脈沖場凝膠電泳方法(PFGE)，其中EAEC使用XbaI限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，電泳條件：6.76～35.38 s，19 h；C.perfringens使用SmaI限制性內(nèi)切酶，0.5～40 s，19 h；兩種方案均以沙門菌H9812使用XbaI酶切后的片段作為分子量參考標(biāo)準(zhǔn)。PFGE圖譜應(yīng)用BioNumerics 7.6軟件進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié) 果

2.1病原初篩、菌株分離及毒力基因檢測結(jié)果 9份病例糞便核酸中，6份樣本astA+(EAEC)，8份樣本cpa+(C.perfringens)，5份樣本混合陽性。6份astA+樣本中分離到6株EAEC，且astA+；8份cpa+的樣本中分離到8株C.perfringens，其中2株cpa+/cpe+，6株cpa+/β2+，且8份樣本C.perfringens平板計數(shù)值均>106cfu/g，見表1。

表1 細(xì)菌分離培養(yǎng)、毒力基因和PFGE檢測結(jié)果

2.2分子分型結(jié)果和抗生素敏感性檢測結(jié)果 如圖1所示：6株EAEC被分成2種帶型，其中1株為E1帶型，另外5株為E2帶型，E1與E2帶型相似度為70.7%。如圖2所示：8株C.perfringens被分為3種帶型，其中6株(所有cpa+/β2+菌株)為相同帶型C1，2株cpa+/cpe+菌株為2種不同帶型(C2和C3)，C2、C3與C1不成簇，位于另一分支，C2、C3相似度為81.8%。6株EAEC呈現(xiàn)2種耐藥表型，與PFGE帶型分布特征一致，其中5株E2帶型菌為AMP+CAZ耐藥；1株E1帶型菌為AMP+AMS+NAL+SXT多重耐藥。

(注：如圖所示，本事件中分離到的6株EAEC菌株中有5株同源性高達(dá)100%，另有1株與其他菌株同源性為70.7%)

(注：如圖所示，本事件中分離到的8株CP菌株中，6株β2毒力基因陽性的菌株聚為1支，同源性為100%；另2株cpe毒力基因陽性的菌株聚為1支，同源性81.8%；2支基因分支間的同源性為54.5%)

3 討 論

C.perfringens在美國作為排在第2位的食源性致病菌[13]，卻多年在國內(nèi)零報告[14-15]，這可能是腹瀉暴發(fā)疫情中未將C.perfringens納入檢測范圍所導(dǎo)致。本事件對病例糞便進(jìn)行了多種常見病原的實時熒光PCR檢測，與分離培養(yǎng)起到互相驗證作用。該方法值得在暴發(fā)事件中廣泛應(yīng)用。9名病例有共同就餐史，發(fā)病潛伏期為8～14 h，既符合致瀉大腸埃希菌導(dǎo)致食物中毒8～44 h的潛伏期特征[16]，也滿足C.perfringens導(dǎo)致食物中毒8～24 h潛伏期特征[17]，同時8個病例糞便C.perfringens計數(shù)均>106cfu/g，與文獻(xiàn)[18]報道符合，不同病例糞便中分別分離到同帶型EAEC和C.perfringens，因此本次腹瀉暴發(fā)事件可能由C.perfringens和EAEC混合感染導(dǎo)致。

文獻(xiàn)報道，CPE腸毒素是引起食物中毒和非食源性人類胃腸道疾病的重要原因[19]，β2腸毒素與人類胃腸道疾病緊密相關(guān)[20]。本事件中分離到的C.perfringens均攜帶cpe基因或β2基因，且β2+菌株為同PFGE帶型，說明病例可能被多克隆C.perfringens感染，但實驗者針對每個病例分離的C.perfringens僅保存1株，這可能是個別病例分離株帶型不一致的原因。所有患者(9名)可疑暴露餐次位于新疆烏魯木齊，因此無法對就餐場所環(huán)境和疑似污染食品進(jìn)行采集，最終導(dǎo)致無法完成食品-環(huán)境-病例的完整溯源。C.perfringens導(dǎo)致食物中毒是否存在多克隆感染值得在今后的工作中持續(xù)關(guān)注。建議進(jìn)行C.perfringens相關(guān)暴發(fā)實驗室分析中應(yīng)挑取并保存多個單菌落，更易于識別患者可能存在的多克隆感染。

EAEC是小兒腹瀉感染的最常見病因，發(fā)展中國家食品中EAEC有較高檢出率，而且也存在無癥狀感染者[21-22]。本次事件有6例患者糞便標(biāo)本分離到astA+的EAEC，雖然菌株aggR-，仍從病原學(xué)上支持6名患者有EAEC感染。6例患者分離到的6株EAEC菌株中，有5株菌PFGE帶型相同、耐藥表型相同，進(jìn)一步說明患者可能存在著相同克隆的感染。5株P(guān)FGE為E2帶型分離株僅對AMP+CAZ耐藥，與北京市致病性大腸埃希菌耐藥譜存在一定差異[23]，這個克隆的菌株在腹瀉患者的感染特征有待于未來進(jìn)一步地監(jiān)測和分析。

本次暴發(fā)事件中，有5名患者的糞便樣本檢出2種病原，推測可能是2種病原同時污染食品。該結(jié)果提示我們在進(jìn)行實驗室病原檢測分析時，應(yīng)該盡量全面地篩查有可能引起腹瀉癥狀的各個病原，包括致病細(xì)菌和病毒。篩查病原的覆蓋面增大后，可以使我們的實驗室病原檢測結(jié)果更為準(zhǔn)確、可信，也可以將檢測結(jié)果更好地服務(wù)臨床的治療工作。類似的多病原混合感染造成的食源性暴發(fā)事件在之前也有報導(dǎo)，這更加提示我們在應(yīng)對食源性疾病暴發(fā)實驗室分析過程中進(jìn)行多病原篩查的重要性。

利益沖突：無