吳建明，周慧文，陳榮發(fā)，閆海鋒，范業(yè)庚，羅　霆，丘立杭，周忠鳳*

【糖料與糖料生產(chǎn)】

甘蔗節(jié)間伸長(zhǎng)機(jī)理研究進(jìn)展

吳建明1,2,3,4，周慧文1,2,3,4，陳榮發(fā)1,2,3,4，閆海鋒1,2,3,4，范業(yè)庚1,2,3,4，羅霆1,2,3,4，丘立杭1,2,3,4，周忠鳳1,2,3,4*

(1廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所，廣西南寧 530007；2農(nóng)業(yè)農(nóng)村部廣西甘蔗生物技術(shù)與遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530007；3廣西甘蔗遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530007；4中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究中心，廣西南寧 530007)

通過(guò)重點(diǎn)介紹甘蔗節(jié)間伸長(zhǎng)的農(nóng)藝學(xué)、細(xì)胞學(xué)、生理學(xué)、基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)等方面的最新研究進(jìn)展，總結(jié)出以下重要論點(diǎn)：一是闡明了甘蔗節(jié)間伸長(zhǎng)機(jī)制，揭示了節(jié)間伸長(zhǎng)細(xì)胞變化規(guī)律；發(fā)現(xiàn)了影響節(jié)間伸長(zhǎng)主要內(nèi)源激素、相關(guān)酶和重要基因，為甘蔗分子定向育種和增產(chǎn)增糖協(xié)同提高關(guān)鍵技術(shù)研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)；二是基于甘蔗糖分積累規(guī)律開(kāi)發(fā)出了具有增糖作用的復(fù)合生物型有機(jī)葉面肥，并發(fā)現(xiàn)該葉面肥通過(guò)促進(jìn)甘蔗上部和中部節(jié)間糖分積累而增糖；三基于節(jié)間伸長(zhǎng)機(jī)理集成創(chuàng)新了“赤霉素+面葉肥”為核心的無(wú)人機(jī)作業(yè)體系，解決了甘蔗產(chǎn)量和糖分協(xié)同提高的關(guān)鍵難題，并大面積推廣應(yīng)用。

甘蔗；節(jié)間伸長(zhǎng)；赤霉素信號(hào)傳導(dǎo)；增產(chǎn)增糖

0 引言

蔗糖是關(guān)系國(guó)計(jì)民生的重要農(nóng)產(chǎn)品和國(guó)家戰(zhàn)略物資，擁有14億人口的中國(guó)是世界的食糖消費(fèi)大國(guó)，而甘蔗是我國(guó)主要的糖料作物，面積占我國(guó)常年糖料面積的85%以上，產(chǎn)糖量占食糖總產(chǎn)量的90%以上，對(duì)我國(guó)食糖安全至關(guān)重要。蔗莖是栽培甘蔗的主要收獲物，莖長(zhǎng)是重要的產(chǎn)量構(gòu)成因素，且蔗糖主要儲(chǔ)藏于甘蔗節(jié)間中，因此，研究甘蔗節(jié)間伸長(zhǎng)機(jī)理對(duì)于提高甘蔗和蔗糖產(chǎn)量具有重要研究意義。但是，從1961年至今甘蔗增產(chǎn)幅度遠(yuǎn)低于玉米、水稻、油菜等作物，而糖分也是一直維持在一個(gè)水平，波動(dòng)范圍不大。國(guó)內(nèi)外已經(jīng)證實(shí)赤霉素能刺激甘蔗莖的伸長(zhǎng)，顯著提高單莖重和產(chǎn)量[1-7]。為解決甘蔗產(chǎn)量和糖分協(xié)同提高的矛盾，廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所、廣西大學(xué)及澳大利亞甘蔗研究所(ESBS)建立了合作關(guān)系，在多個(gè)國(guó)家和省部級(jí)項(xiàng)目的支持下，集成甘蔗糖業(yè)的科研力量聯(lián)合企業(yè)協(xié)作攻關(guān)，對(duì)甘蔗節(jié)間伸長(zhǎng)的形態(tài)特征、細(xì)胞結(jié)構(gòu)、生理指標(biāo)、基因表達(dá)與功能驗(yàn)證、產(chǎn)量形成、糖分積累、高產(chǎn)栽培等進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，取得重大創(chuàng)新和突破。

1 甘蔗節(jié)間細(xì)胞學(xué)研究

甘蔗產(chǎn)量的高低與甘蔗莖徑之間的關(guān)系極為密切，甘蔗莖尖細(xì)胞結(jié)構(gòu)和分生組織對(duì)蔗莖的增粗和伸長(zhǎng)有重要作用。李志剛等[8]研究結(jié)果表明，噴施乙烯利后不同時(shí)期對(duì)甘蔗莖(+3和+4葉之間節(jié)間)的觀測(cè)，結(jié)果表明，乙烯利的處理促進(jìn)了維管束的分化，密度增大，木質(zhì)部導(dǎo)管和韌皮部也發(fā)生了相應(yīng)的變化，80 mg/L濃度處理增大了維管束、木質(zhì)部導(dǎo)管和韌皮部的面積，有利于增強(qiáng)輸導(dǎo)能力；80 mg/L濃度處理對(duì)甘蔗莖及其表皮細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育有短暫的抑制作用，但隨后即表現(xiàn)為促進(jìn)作用，明顯促進(jìn)了徑向壁的增長(zhǎng)，表現(xiàn)出蔗莖橫向擴(kuò)張的趨勢(shì)，300 mg/L濃度處理則始終表現(xiàn)為抑制作用；進(jìn)一步研究還發(fā)現(xiàn)，甘蔗莖尖正在伸長(zhǎng)的幼葉部位細(xì)胞的周質(zhì)微管主要是與細(xì)胞伸長(zhǎng)軸相垂直的橫向周質(zhì)微管，莖尖幼葉部位伸長(zhǎng)緩慢細(xì)胞的微管主要為縱向及斜向排列的周質(zhì)微管，在甘蔗莖尖幼葉基部初生增粗分生組織處，橫向、斜向、縱向及隨機(jī)排列的周質(zhì)微管列陣均有分布[9]。李素麗等[10]研究不同品種甘蔗莖尖細(xì)胞分裂節(jié)律，結(jié)果表明，甘蔗1天內(nèi)(白天)不同時(shí)間均存在細(xì)胞分裂，而且細(xì)胞分裂指數(shù)呈規(guī)律性變化，大部分呈“先升后降再上升”的變化趨勢(shì)。隨后，對(duì)6個(gè)不同莖徑品種5個(gè)不同生長(zhǎng)時(shí)期的甘蔗莖尖進(jìn)行石蠟連續(xù)縱切片顯微觀察，發(fā)現(xiàn)甘蔗莖尖原生分生組織各區(qū)域細(xì)胞有明顯差異：周緣分生區(qū)細(xì)胞(3.89%)＞原體原始細(xì)胞區(qū)(2.67%)＞髄分生稱(chēng)(1.46%)＞原套原始細(xì)胞區(qū)(1.3%)，以上差異均達(dá)到顯著水平；各區(qū)域細(xì)胞分裂頻率與甘蔗莖徑均呈正相關(guān)。不同品種在不同生長(zhǎng)時(shí)期細(xì)胞分裂指數(shù)變化規(guī)律不一樣，細(xì)胞分裂高峰期出現(xiàn)的時(shí)期也不一樣，早熟品種出現(xiàn)的時(shí)期早一些，晚熟品種則晚一些。甘蔗莖徑和各生長(zhǎng)時(shí)期細(xì)胞分裂指數(shù)是呈正相關(guān)的，莖徑大，細(xì)胞分裂指數(shù)高，相反，莖徑小，細(xì)胞分裂指數(shù)低[11]。廖芬[12]研究赤霉素對(duì)甘蔗莖尖分生組織的解剖效應(yīng)及與蔗莖增粗的關(guān)系，結(jié)果表明，對(duì)甘蔗莖尖生長(zhǎng)錐的生長(zhǎng)、分化有促進(jìn)作用，對(duì)大莖品種的促進(jìn)作用更強(qiáng)一些，對(duì)中、小莖品種只起到短期的促進(jìn)效果；赤霉素對(duì)大、中、小莖品種的第3～5幼葉初生增粗分生組織的列數(shù)、寬度、長(zhǎng)度、面積及細(xì)胞分裂均有較好的促進(jìn)作用，對(duì)大莖品種的促進(jìn)作用較強(qiáng)，對(duì)中、小莖品種只起到短期促進(jìn)作用；赤霉素加快了大、中、小莖品種的伸長(zhǎng)速度，增加節(jié)間長(zhǎng)度，新出葉片寬度。

2 甘蔗節(jié)間伸長(zhǎng)生理機(jī)制研究

2.1 甘蔗節(jié)間伸長(zhǎng)的效應(yīng)與相關(guān)酶活性的關(guān)系

甘蔗節(jié)間伸長(zhǎng)過(guò)程體內(nèi)生理生化方面也會(huì)隨之發(fā)生變化。潘有強(qiáng)等[13-15]研究甘蔗節(jié)間Mg2+-ATP酶活性、蛋白質(zhì)含量與節(jié)間生長(zhǎng)的關(guān)系，結(jié)果表明，從+2到+8節(jié)間，不同基因型節(jié)間長(zhǎng)度的變化極為相似，從+3到+5、+8節(jié)間，不同基因型的3種Mg2+-ATP酶活性、溶性蛋白質(zhì)、細(xì)胞壁離子型結(jié)合蛋白質(zhì)、細(xì)胞壁共價(jià)型結(jié)合蛋白質(zhì)都逐漸下降，而可溶性總糖含量逐漸提高。吳建明等[16]在甘蔗伸長(zhǎng)初期以200 mg/L GA3進(jìn)行葉面噴施處理，對(duì)照噴清水，發(fā)現(xiàn)赤霉素處理后甘蔗間伸長(zhǎng)效果主要是在莖的中部(5～10節(jié))，而甘蔗體內(nèi)α-葡萄糖苷酶和α-甘露糖苷酶的活性較對(duì)照顯著下降；POD和β-半乳糖苷酶的活性也略有下降；α-半乳糖苷酶、β-N-乙酰氨基已糖苷酶、過(guò)氧化氫酶的活性顯著提高；β-葡萄糖苷酶的活性也有一定程度提高。由此可知，外源GA3主要通過(guò)調(diào)節(jié)α-葡萄糖苷酶活性、α-甘露糖苷酶、α-半乳糖苷酶、β-N-乙酰氨基已糖苷酶活性和過(guò)氧化氫酶，其次是POD、β-半乳糖苷酶和β-葡萄糖苷酶活性，最終達(dá)到節(jié)間伸長(zhǎng)效果。陳榮發(fā)等[17]研究正常條件下甘蔗未伸長(zhǎng)期(9～10片真葉)(Ls1)、伸長(zhǎng)初期(12～13片真葉)(Ls2)和伸長(zhǎng)盛期(15～16片真葉)(Ls3)3個(gè)時(shí)期生長(zhǎng)過(guò)程生理變化關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甘蔗伸長(zhǎng)過(guò)程生理代謝是一個(gè)極為復(fù)雜的過(guò)程，NADK、鈣依賴(lài)蛋白激酶(CDPKs)、α-甘露糖苷酶、α-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、纖維素酶、木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶/水解酶(XTH)和CAT酶均隨著甘蔗節(jié)間伸長(zhǎng)而增加，呈顯著的正相關(guān)，說(shuō)明它們?cè)诟收峁?jié)間伸長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，且起正調(diào)控作用。而β-葡萄糖苷酶也是隨著甘蔗節(jié)間伸長(zhǎng)而增加，但未伸長(zhǎng)期和伸長(zhǎng)初期之間差異不明顯，說(shuō)明該β-葡萄糖苷酶在甘蔗節(jié)間快速伸長(zhǎng)期即伸長(zhǎng)盛期起關(guān)鍵作用。POD和α-葡萄糖苷酶的酶活性變化趨勢(shì)正好相反，均是隨著甘蔗節(jié)間伸長(zhǎng)而增加，呈顯著的負(fù)相關(guān)，但α-葡萄糖苷酶的酶活性伸長(zhǎng)初期比未伸長(zhǎng)期下降了15.20%，然后趨于平穩(wěn)，說(shuō)明它們?cè)诟收峁?jié)間伸長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，且起負(fù)調(diào)控作用。

2.2 甘蔗節(jié)間伸長(zhǎng)的效應(yīng)與內(nèi)源激素活性的關(guān)系

植物激素在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起著調(diào)節(jié)作用。吳建明等[18]在甘蔗伸長(zhǎng)初期以200 mg/L GA3進(jìn)行葉面噴施處理，對(duì)照噴清水，發(fā)現(xiàn)赤霉素處理后體內(nèi)GA3含量顯著高于對(duì)照；ABA含量則相反，赤霉素處理的均顯著低于對(duì)照。赤霉素處理的乙烯釋放量稍低于對(duì)照，IAA含量從第7天開(kāi)始稍高于對(duì)照；赤霉素處理對(duì)ZR含量的影響不明顯。赤霉素處理的ABA/IAA的比值顯著下降，ZR/IAA和EH/IAA的比值也有一定程度的下降，而GA3/IAA的比值有所提高。這說(shuō)明外源赤霉素促進(jìn)甘蔗節(jié)間的伸長(zhǎng)可能主要通過(guò)調(diào)節(jié)ABA和赤霉素含量，其次是乙烯釋放量和生長(zhǎng)素含量，最終達(dá)到調(diào)節(jié)節(jié)間伸長(zhǎng)效果。范業(yè)庚等[19]通過(guò)分析正常條件下甘蔗未伸長(zhǎng)期(9～10片真葉)(Ls1)、伸長(zhǎng)初期(12～13片真葉)(Ls2)和伸長(zhǎng)盛期(15～16片真葉)(Ls3) 3個(gè)時(shí)期生長(zhǎng)過(guò)程內(nèi)源激素變化關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在甘蔗伸長(zhǎng)過(guò)程中，GA和IAA含量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，CTK和ABA含量呈下降趨勢(shì)，ETH含量先上升后下降，BR含量則變化不明顯。說(shuō)明甘蔗節(jié)間伸長(zhǎng)過(guò)程主要與GA和IAA相關(guān)，其次為CTK和ABA，而ETH受到IAA的調(diào)控影響節(jié)間伸長(zhǎng)。

3 甘蔗節(jié)間伸長(zhǎng)分子機(jī)理研究

3.1 差異表達(dá)分析赤霉素誘導(dǎo)甘蔗節(jié)間伸長(zhǎng)，獲得了一些重要差異基因

植物激素通過(guò)調(diào)控植物細(xì)胞的基因表達(dá)參與調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育。吳建明等[20-23]在甘蔗伸長(zhǎng)初期進(jìn)行葉面噴施200 mg/L濃度的赤霉素為處理，以噴施清水為對(duì)照，在不同時(shí)間取幼莖樣品，用cDNA-AFLP、cDNA-SRAP和cDNA-SCoT 3種技術(shù)聯(lián)合分析。結(jié)果表明，3種技術(shù)通過(guò)不同引物組合篩選了約26000個(gè)cDNA片段，經(jīng)反向Northern雜交驗(yàn)證，獲得了80個(gè)顯陽(yáng)性差異片段，其中有52個(gè)基因片段受赤霉素上調(diào)而28個(gè)基因片段下調(diào)；按照功能可以將80條差異表達(dá)基因片段分為7類(lèi)，分別為能量與代謝相關(guān)基因、未知功能蛋白、未知基因、植物抗性相關(guān)基因、細(xì)胞壁生物合成與修飾相關(guān)基因、信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)基因和轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)基因。不同技術(shù)擴(kuò)增結(jié)果各有特點(diǎn)，但不同技術(shù)也能擴(kuò)增出相同基因差異片段如赤霉素受體基因、1,3,4-三磷酸肌醇56激酶基因、S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因、核糖體相關(guān)基因等。但這些基因是否參與調(diào)節(jié)甘蔗節(jié)間伸長(zhǎng)仍需要進(jìn)一步驗(yàn)證。由此可知，cDNA-AFLP、cDNA-SRAP和cDNA-SCoT技術(shù)均是研究基因差異表達(dá)的重要工具，但各技術(shù)在原理、方法、結(jié)果等方面均有各自的特點(diǎn)，研究者可以根據(jù)不同的研究方向、目的等選擇自己需要的方法或不同方法結(jié)合應(yīng)用，特別是不同的差異表達(dá)技術(shù)結(jié)合應(yīng)用可以獲得更全面的信息，從而在植物基因差異表達(dá)、新基因發(fā)現(xiàn)、抗逆性分子機(jī)理研究等方面發(fā)揮更大的作用。

3.2 轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析甘蔗節(jié)間伸長(zhǎng)

3.2.1 基于mRNA-seq和small RNA-Seq關(guān)聯(lián)分析甘蔗節(jié)間伸長(zhǎng)動(dòng)態(tài)變化

為了明確甘蔗節(jié)間伸長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控圖譜，丘立杭等[24]以綜合性狀優(yōu)良的主栽品種桂糖42號(hào)為研究對(duì)象，基于Illumina平臺(tái)分別對(duì)未伸長(zhǎng)期(EI)、伸長(zhǎng)初期(EII)和伸長(zhǎng)盛期(EIII)的蔗莖節(jié)間組織樣品進(jìn)行了測(cè)序，經(jīng)過(guò)生物信息學(xué)分析，我們從mRNA-Seq中過(guò)濾得到484324322條clean reads，de novo組裝后產(chǎn)生80745個(gè)unigenes。經(jīng)過(guò)EIEII、EIEIII和EIIEIII比較分析后，分別獲得493、5035和3041個(gè)差異表達(dá)unigenes，這些基因的GO和KEGG注釋和顯著富集結(jié)果顯示，“Zeatin biosynthesis”、“Nitrogen metabolism”和“Plant hormone signal transduction”通路及其差異基因顯著參與了甘蔗節(jié)間伸長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。同時(shí)，small RNA-Seq獲得137610370條clean reads，產(chǎn)生了241個(gè)已知miRNAs和245個(gè)未知候選miRNAs，且EIEII、EIEIII和EIIEIII的比較分析也分別獲得了11、42和26個(gè)差異表達(dá)的miRNAs，這些差異miRNAs一共靶向266個(gè)unigenes，并富集在59條KEGG pathway上。甘蔗節(jié)間伸長(zhǎng)是由一系列基因差異表達(dá)而觸發(fā)的組織生長(zhǎng)過(guò)程，通過(guò)mRNA和miRNA關(guān)聯(lián)分析，靶向“Zeatin biosynthesis”、“Nitrogen metabolism”和“Plant hormone signal transduction”通路中的差異基因的miRNAs共同調(diào)控甘蔗的節(jié)間伸長(zhǎng)，并獲得了甘蔗節(jié)間伸長(zhǎng)的miRNA-mRNA轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖模型(圖1)。

注：這些miRNAs的靶向基因從“Zeatin biosynthesis”、“Nitrogen metabolism”和“Plant hormone signal transduction”途徑參與甘蔗節(jié)間伸長(zhǎng)

3.2.2 利用高通量測(cè)序分析赤霉素與縮節(jié)胺在甘蔗節(jié)間伸長(zhǎng)的差異

3.2.2.1 高通量測(cè)序分析赤霉素促進(jìn)甘蔗節(jié)間伸長(zhǎng)的差異

節(jié)間伸長(zhǎng)是影響甘蔗產(chǎn)量和糖分的重要性狀。赤霉素(GA)是甘蔗節(jié)間伸長(zhǎng)的關(guān)鍵調(diào)控因子。理解GA介導(dǎo)的節(jié)間伸長(zhǎng)的基因表達(dá)特征具有重要的科學(xué)和現(xiàn)實(shí)意義。在探究GA處理后甘蔗節(jié)間伸長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄組變化方面，陳榮發(fā)等[25]以赤霉素處理為處理組，以正常生長(zhǎng)條件下為對(duì)照組，處理后的第0、3、6天取樣，取樣部位為節(jié)間，共構(gòu)建18個(gè)節(jié)間組織的cDNA文庫(kù)、測(cè)序，并研究其基因表達(dá)。RNA-seq分析結(jié)果表明，利用甘蔗伸長(zhǎng)的節(jié)間測(cè)序，共產(chǎn)生1338723248條reads和70821條unigenes。研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，GA處理組大量的轉(zhuǎn)錄體差異表達(dá)。進(jìn)一步分析表明，差異表達(dá)基因富集在代謝、單碳化合物轉(zhuǎn)運(yùn)和單生物過(guò)程中。KEGG通路注釋表明以上差異表達(dá)基因在光合作用和植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路顯著富集，表明這些通路的基因參與節(jié)間伸長(zhǎng)。功能分析表明，赤霉素處理植株的節(jié)間的基因富集在代謝途徑和次生代謝物、植物激素及細(xì)胞壁組分的生物合成通路。同時(shí)，通過(guò)鑒定中心基因，發(fā)現(xiàn)該基因具有纖維素合成的功能。本研究結(jié)果提供了甘蔗節(jié)間伸長(zhǎng)過(guò)程中基因表達(dá)變化的全局特征，擴(kuò)展了我們對(duì)GA介導(dǎo)的細(xì)胞過(guò)程參與蔗莖生長(zhǎng)的認(rèn)識(shí)。

3.2.2.2 高通量測(cè)序分析縮節(jié)胺在甘蔗節(jié)間伸長(zhǎng)的作用差異

縮節(jié)胺(DPC)是一種廣泛用于調(diào)控栽培植物節(jié)間生長(zhǎng)和冠層致密化的化學(xué)藥劑。以往的研究表明，DPC可以抑制甘蔗赤霉素的生物合成。然而，DPC抑制植物生長(zhǎng)的分子機(jī)制仍然很大程度上是未知的。為了明確DPC影響甘蔗節(jié)間伸長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄變化，陳榮發(fā)等首次利用三代測(cè)序儀Pacbio Sequel系統(tǒng)從甘蔗節(jié)間獲得了高質(zhì)量的長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本。總共產(chǎn)生了72671個(gè)isoform，N50長(zhǎng)達(dá)3073 bp。這些長(zhǎng)isoform將作為進(jìn)一步轉(zhuǎn)錄組研究的參考基因集。隨后，Illumina Hiseq 4000平臺(tái)測(cè)序產(chǎn)生短reads，將用于比較DPC和對(duì)照組中的差異表達(dá)基因。以上轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜的結(jié)果表明，DPC處理后第6天，處理組與對(duì)照組的甘蔗節(jié)間基因變化最明顯。這些基因與植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和多種代謝產(chǎn)物的生物合成有關(guān)，說(shuō)明DPC除了抑制赤霉素生物合成，還影響多條通路。進(jìn)一步利用加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析(Weighted gene co-expression network analysis，WGCNA)對(duì)關(guān)鍵階段的DPC的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行了研究。在WGCNA所構(gòu)建的36個(gè)模塊中，噴施DPC后第6天，與DPC調(diào)控相關(guān)性最高的模塊為sienna3模塊。sulphotransferase、cyclin-like F-box和HOX12是sienna3模塊中與該模塊中其他基因高度相關(guān)的中心基因。qPCR證實(shí)了RNA-seq結(jié)果的高準(zhǔn)確性。綜上所述，研究證明了這些基因在DPC誘導(dǎo)甘蔗生長(zhǎng)抑制中的關(guān)鍵作用。

3.3 調(diào)控甘蔗節(jié)間伸長(zhǎng)重要基因挖掘與功能分析

3.3.1 赤霉素信號(hào)傳導(dǎo)基因的克隆、表達(dá)及功能研究

DELLA蛋白在赤霉素信號(hào)途徑中發(fā)揮重要作用。通過(guò)RACE技術(shù)克隆了甘蔗赤霉素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的核心轉(zhuǎn)錄因子1878 bp的ORF序列，其編碼625個(gè)氨基酸，具有保守的DELLA和GRAS結(jié)構(gòu)域。亞細(xì)胞定位表明，ScGAI定位于細(xì)胞核，這與其是轉(zhuǎn)錄因子所發(fā)揮的功能相一致?；虮磉_(dá)發(fā)現(xiàn)，在甘蔗節(jié)間伸長(zhǎng)初期的表達(dá)量較高，但隨著節(jié)間的不斷伸長(zhǎng)，其表達(dá)量呈逐漸下降趨勢(shì)[19]。過(guò)表達(dá)()到煙草和甘蔗后，轉(zhuǎn)基因植株的節(jié)間長(zhǎng)度顯著縮短；干擾表達(dá)()后，轉(zhuǎn)基因甘蔗植株莖稈中的貯藏薄壁細(xì)胞和維管束顯著積累，同時(shí)甘蔗節(jié)間長(zhǎng)度比野生型對(duì)照增加了2倍(圖2)[26-27]。綜合以上證據(jù)說(shuō)明，ScGAI在甘蔗節(jié)間伸長(zhǎng)中起到了關(guān)鍵的負(fù)調(diào)控作用，通過(guò)降低ScGAI的表達(dá)能夠有效增加甘蔗的節(jié)間長(zhǎng)度。該研究證實(shí)了ScGAI是甘蔗節(jié)間伸長(zhǎng)的重要調(diào)控因子，為甘蔗節(jié)間長(zhǎng)度的調(diào)節(jié)提供了重要的基因靶點(diǎn)。

圖2　ScGAI轉(zhuǎn)化煙草(a)和甘蔗(b)后的表型

3.3.2 赤霉素受體基因克隆、表達(dá)及遺傳轉(zhuǎn)化

利用RACE技術(shù)克隆了甘蔗赤霉素受體基因() 1062 bp的ORF序列，其編碼353個(gè)氨基酸，具有保守的Abhydrolase_3結(jié)構(gòu)域，屬于親水蛋白?；虮磉_(dá)表明，在甘蔗節(jié)間伸長(zhǎng)初期的表達(dá)量較低，但隨著節(jié)間的逐漸伸長(zhǎng)，其表達(dá)量逐漸升高，說(shuō)明的基因表達(dá)量與甘蔗節(jié)間伸長(zhǎng)呈正相關(guān)[19,28]。

3.3.3 赤霉素合成關(guān)鍵限速酶基因克隆、表達(dá)及功能驗(yàn)證

用RT-PCR和RACE技術(shù)克隆的全長(zhǎng)cDNA序列，發(fā)現(xiàn)基因全長(zhǎng)有1574 bp，其中含有一個(gè)1125 bp的完整開(kāi)放閱讀框(ORF)，編碼375個(gè)氨基酸。生物信息學(xué)分析表明，該蛋白為親水蛋白，不含信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)，包含典型的“NYYPPCQRP”保守結(jié)構(gòu)域、“LPWKET”基元及H和D殘基，與玉米、秈稻的GA20ox蛋白親緣關(guān)系最近。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明的表達(dá)量為莖＞葉＞根；在一定時(shí)間內(nèi)赤霉素處理促進(jìn)該基因在莖中的表達(dá)[19, 29-30]。遺傳轉(zhuǎn)化后的擬南芥植株高度表達(dá)，轉(zhuǎn)基因擬南芥株系ga20-1、ga20-3、ga20-5的表達(dá)量遠(yuǎn)高于其他株系，且T1代3號(hào)株系(基因表達(dá)量較高的株系)的3株T2代植株表現(xiàn)為共同的主莖光溜，無(wú)花無(wú)果莢(圖3左起第5～7株)，由此，可推測(cè)甘蔗SoGA20ox1是否促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)，而抑制生殖生長(zhǎng)仍然需要進(jìn)一步研究。

3.3.4 赤霉素合成途徑基因基因克隆與表達(dá)分析

用RACE技術(shù)克隆了赤霉素(GA)重要合成基因1137 bp的ORF全長(zhǎng)序列。生物信息學(xué)分析表明，ScGA3ox的分子量為41.158 ku，是不穩(wěn)定親水性蛋白，與玉米ZmGA3ox1和水稻OsGA3ox具有相同的motif組成結(jié)構(gòu)和較近的進(jìn)化關(guān)系；ScGA3ox沒(méi)有明顯的跨膜結(jié)構(gòu)，分別存在15個(gè)絲氨酸和14個(gè)蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)分析表明，200 mg/L GA3處理后的48 h內(nèi)，在莖和幼葉中的表達(dá)量持續(xù)升高；0℃低溫處理后的24 h內(nèi)，在甘蔗根和葉中的表達(dá)量均明顯升高；200 mg/L的PEG6000處理后的48 h中，在根中的表達(dá)量逐漸下降，在莖中的表達(dá)量逐漸升高[31]。說(shuō)明ScGA3ox除了在GA信號(hào)通路中發(fā)揮作用外，還可能參與甘蔗對(duì)外界非生物逆境的應(yīng)答過(guò)程。

圖3　野生型擬南芥(1～3)與轉(zhuǎn)基因擬南芥(4～6)的表型觀察

4 基于甘蔗節(jié)間伸長(zhǎng)機(jī)理的應(yīng)用技術(shù)研究

1950年澳大利亞的專(zhuān)家率先研究赤霉素在甘蔗上的應(yīng)用。隨后，赤霉素在甘蔗上的應(yīng)用在美國(guó)得到比較系統(tǒng)的研究。至今，赤霉素在甘蔗上的研究已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用，結(jié)果均表明能促進(jìn)萌芽和萌芽后的生長(zhǎng)；對(duì)分蘗有抑制作用；對(duì)開(kāi)花影響不顯著；而最突出的效應(yīng)是刺激甘蔗莖的伸長(zhǎng)，顯著提高單莖重和產(chǎn)量[32-37]。

從2000年以來(lái)，廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所一直研究赤霉素在甘蔗的應(yīng)用效果，結(jié)果表明，外源赤霉素處理提高甘蔗產(chǎn)量在6.79%～20%之間，糖分提高0.41%～1.29%(絕對(duì)值)；甘蔗產(chǎn)量提高主要是通過(guò)增加莖長(zhǎng)和單莖重；甘蔗蔗糖分主要集中在莖部，而莖長(zhǎng)得到提高后蔗糖分也得到提高[38-39]。但是也會(huì)引起甘蔗莖徑變細(xì)，且不同甘蔗品種的效果差異比較大。為了解決這個(gè)問(wèn)題，通過(guò)多年篩選不同化學(xué)物質(zhì)、中微量元素、內(nèi)生菌液等，發(fā)明了基于無(wú)人甘蔗增產(chǎn)增糖劑施用方法已獲澳大利亞專(zhuān)利授權(quán)[40]，集成創(chuàng)新了“赤霉素+面葉肥”為核心的無(wú)人機(jī)作業(yè)體系，仿地飛行模塊結(jié)合蔗區(qū)地形地貌獲得最優(yōu)參數(shù)組合：參數(shù)噴頭流量15 L/hm2、霧滴粒徑80～120 μm、仿地高度3 m、飛行速度4 m/s、寬幅3～4 m，并進(jìn)行大面積示范推廣應(yīng)用。

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The Research Progress on the Mechanism of Internode Elongation of Sugarcane

WU Jian-ming1,2,3,4, ZHOU Hui-wen1,2,3,4, CHEN Rong-fa1,2,3,4, YAN Hai-feng1,2,3,4, FAN Ye-geng1,2,3,4, LUO Ting1,2,3,4, QIU Li-hang1,2,3,4, ZHOU Zhong-feng1,2,3,4

(1Sugarcane Research Institute, Guangxi Academy of Agricultural Sciences, Nanning, Guangxi 530007;2Guangxi Key Laboratory of Sugarcane Biotechnology and Genetic Improvement, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Nanning, Guangxi 530007;3Guangxi Key Laboratory of Guangxi Sugarcane Genetic Improvement, Nanning, Guangxi 530007;4Sugarcane Research Center of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Nanning, Guangxi 530007)

In this paper, the latest research progress of internode elongation in agronomy, cytology, physiology, genomics and transcriptomics were presented. We summarized the following points: Firstly, the mechanism of internode elongation of sugarcane was clarified and the variation rule of internode elongation cells was revealed. The main endogenous hormones, related enzymes and key genes affecting internode elongation were found, which provided a scientific basis for the research and development of key technologies for sugarcane molecular targeted breeding and cooperative improvement of yield and sugar increase. Secondly, based on the sugar accumulation rule of sugarcane, a compound biological organic foliar fertilizer was developed. And it was found that it could promote sugar accumulation in the lower internodes of sugarcane and then transport sugar upward in advance to achieve the effect of sugar increasing. Thirdly, based on the internode elongation mechanism combined with the screening of different chemical substances, medium and trace elements, endophytic bacteria liquid, etc., a sugarcane yield and sugar increasing agent based on UAV was invented, which solved the key problem of the cooperative improvement of sugarcane yield and sugar and was popularized and applied widely.

Sugarcane; Internode elongation; Gibberellin signal transduction; Increase yield and sugar

1005-9695(2021)01-0024-08

2021-01-10；

2021-02-01

國(guó)家自然科學(xué)基金(31360312)；中央引導(dǎo)地方科技發(fā)展專(zhuān)項(xiàng)(桂科ZY20111001)；廣西科技計(jì)劃項(xiàng)目(桂科AD19245080)；廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技先鋒隊(duì)專(zhuān)項(xiàng)行動(dòng)項(xiàng)目(桂農(nóng)科JZ202003)；廣西農(nóng)科院基本科研業(yè)務(wù)專(zhuān)項(xiàng)(桂農(nóng)科2020YM22)

吳建明(1978-)，博士，研究員，從事甘蔗栽培和生理生化研究；E-mail：wujianming2004@126.com

周忠鳳(1974-)，副研究員，主要從事甘蔗育種與栽培；E-mail：445708586@qq.com

吳建明，周慧文，陳榮發(fā)，等. 甘蔗節(jié)間伸長(zhǎng)機(jī)理研究進(jìn)展[J]. 甘蔗糖業(yè)，2021，50(1)：24-31.