章碧靜 呂偉旗 陳健苗

絡(luò)石藤系夾竹桃科藤本植物絡(luò)石Trachelospermum jasminoides（Lindl.）Lem.的干燥帶葉藤莖，性苦，微寒，歸心、肝、腎經(jīng)，具有祛風(fēng)通絡(luò)，涼血消腫的功效，臨床多用于治療風(fēng)濕熱痹，筋脈拘攣，腰膝酸痛，喉痹，癰腫，跌撲損傷等癥[1-2]。研究表明，絡(luò)石藤干燥藤莖中富含木脂素、黃酮、萜類、甾醇、生物堿等多種化學(xué)成分[2-4]，具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗氧化、降血脂等藥理活性[5-6]。絡(luò)石藤在我國安徽、浙江、陜西、江西、云南、廣西等省均有分布，南北跨度較大，而現(xiàn)有報道多集中在化學(xué)成分[7]、藥理作用[8]、偽品鑒別[9]、臨床應(yīng)用[10]等方面，針對不同產(chǎn)地絡(luò)石藤木脂素含量測定的研究鮮有報道，已有的含量測定也僅集中在少數(shù)產(chǎn)地[11]。木脂素類（絡(luò)石苷、去甲絡(luò)石苷）是絡(luò)石藤的主要有效成分，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抑菌等藥理活性，絡(luò)石苷是2020 年版《中華人民共和國藥典》規(guī)定的質(zhì)量評價標(biāo)準(zhǔn)之一[1]。本研究收集安徽、浙江、陜西、江西、云南等絡(luò)石藤主分布區(qū)種質(zhì)資源19 份，建立高效液相色譜法（HPLC）對其干燥藤莖中絡(luò)石苷與去甲絡(luò)石苷進(jìn)行含量測定，分析其與原植物生長性狀、產(chǎn)地生境因子（經(jīng)緯度、海拔）間的相關(guān)性，以期為絡(luò)石藤藥材質(zhì)量控制提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材 料

1.1 絡(luò)石藤種質(zhì)資源 2019 年11 月—2019 年12月，采集浙江、安徽、陜西、江西、云南、廣西、湖南、河南等省絡(luò)石藤種質(zhì)資源19 份，經(jīng)浙江省麗水市人民醫(yī)院藥學(xué)部陳健苗主任藥師鑒定為夾竹桃科絡(luò)石T.jasminoides 的干燥帶葉藤莖，見表1。

1.2 儀器與試劑 2695 型高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；FRQ-1008HT 小型超聲波清洗機(jī)（杭州法蘭特超聲波科技有限公司）；ESJ120-4A 型電子分析天平（沈陽龍騰電子有限公司）；DHG-9053A 型臺式鼓風(fēng)干燥箱（無錫瑪瑞特科技有限公司）；小型多功能粉碎機(jī)（拜杰儀器有限公司）；SHB-IIIG 型臺式循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；絡(luò)石苷（B20810，上海源葉生物科技有限公司）；去甲絡(luò)石苷（PR3275，信陽市中檢計量生物科技有限公司）；色譜乙腈、色譜甲醇（上海耀勘化工有限公司）；其他甲醇等試劑為分析純（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

表1 絡(luò)石藤樣品信息

2 方 法

2.1 生長性狀測定 取絡(luò)石藤新鮮藤莖，用卷尺測量藤莖長，用游標(biāo)卡尺測量藤莖粗、葉片中脈長（葉長）與葉寬，計算葉長寬比=葉長/葉寬，n=15。

2.2 木脂素含量測定

2.2.1 色譜條件 Agilent Extend-C18 色譜柱（4.6×250mm，5μm），流動相乙腈-0.2%冰醋酸溶液，體積流速1.0mL/min，檢測波長λ=280nm，柱溫28℃，進(jìn)樣量10μL，HPLC 色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2.2.2 線性關(guān)系考察 配制濃度分別為0.612、1.224、1.836、2.448、3.060、6.120mg/L 的絡(luò)石苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液，及濃度為0.128、0.256、0.384、0.512、0.640、1.280mg/L的去甲絡(luò)石苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液，過0.45μm 微孔濾膜，在“2.2.1”色譜條件下進(jìn)樣，以峰面積Y 為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品濃度X 為橫坐標(biāo)，得絡(luò)石苷線性方程為Y1=3537.1X1－67273，R2=0.9995，在61.2～612μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，得去甲絡(luò)石苷線性方程為Y2=4218.8X1－16603，R2=0.9996，在12.8～128μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.3 樣品溶液制備 將絡(luò)石藤切片，60℃烘箱烘至恒重，粉碎過60 目篩，置于干燥器中保存待用。精密稱取粉末2g，置具塞錐形瓶中，加入甲醇80mL，稱重，浸泡過夜，室溫超聲處理（功率250W，頻率35kHz）30min，冷卻至室溫，甲醇補(bǔ)足失重，抽濾，濾液定容至100mL 容量瓶。吸取樣品溶液適量，過0.45μm 微孔濾膜，在“2.2.1”色譜條件下進(jìn)樣，測定峰面積（n=3）。

2.2.4 精密度試驗(yàn) 取絡(luò)石苷與去甲絡(luò)石苷對照品，過0.45μm 微孔濾膜，在“2.2.1”色譜條件下進(jìn)樣6 次，測定絡(luò)石苷與去甲絡(luò)石苷峰面積RSD 分別為0.22%與0.18%，表明儀器精密度良好。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取浙江仙居樣品，在“2.2.3”條件下制備樣品溶液，在“2.2.1”色譜條件下分別于2、4、8、12、16、20、24h 進(jìn)樣，測得絡(luò)石苷與去甲絡(luò)石苷峰面積RSD 分別為1.06%與1.78%，表明樣品溶液在24h 穩(wěn)定性良好。

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取浙江仙居樣品，連續(xù)稱樣6次，在“2.2.3”條件下制備樣品溶液，在“2.2.1”色譜條件下進(jìn)樣，測得該樣品絡(luò)石苷與去甲絡(luò)石苷平均含量分別為2.43mg/g 與8.39mg/g，RSD 為2.01%與1.66%，表明方法重復(fù)性良好。

2.2.7 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取絡(luò)石苷與去甲絡(luò)石苷含量已知的浙江仙居樣品適量，加入適量標(biāo)準(zhǔn)品，在“2.2.3”條件下制備樣品溶液，在“2.2.1”色譜條件下進(jìn)樣，測定峰面積，計算加樣回收率，試驗(yàn)平行6次，見表2。

表2 加樣回收率試驗(yàn)（n=6）

2.3 統(tǒng)計學(xué)方法 不同產(chǎn)地間絡(luò)石藤生長性狀、木脂素類成分含量比較應(yīng)用SPSS 23.0 統(tǒng)計軟件單因素ANOVA 方差分析，木脂素類成分含量與生境因子間相關(guān)性分析應(yīng)用Excel 2010 數(shù)據(jù)分析中相關(guān)系數(shù)工具包，絡(luò)石藤聚類分析應(yīng)用SPSS 23.0 統(tǒng)計軟件組間聯(lián)接法[12]，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 生長性狀比較 19 個產(chǎn)地絡(luò)石藤生長性狀存在差異（P＜0.05 或P＜0.01），藤莖長與藤莖粗的變幅分別為3.45～9.32m 與1.78～4.56mm，其中云南大姚絡(luò)石藤藤莖長、藤莖粗、葉長指標(biāo)數(shù)值最大，分別為9.32m、4.56mm 與8.26cm，云南巧家絡(luò)石藤葉片最寬，葉寬數(shù)值為3.21cm，廣西西林絡(luò)石藤葉片最為狹長，葉長寬比數(shù)值為2.76，而陜西漢陰絡(luò)石藤葉片最為寬鈍，葉長寬比數(shù)值最小，僅為1.47，見表3。

3.2 木脂素類成分含量比較 19 個產(chǎn)地絡(luò)石藤中去甲絡(luò)石苷與絡(luò)石苷含量存在差異（P＜0.01），平均含量分別為2.05mg/g 與6.84mg/g，變幅為1.19～2.89mg/g 與4.75～10.02mg/g。從絡(luò)石苷含量看，供試19 個產(chǎn)地絡(luò)石藤中絡(luò)石苷含量均滿足2020 年版《中華人民共和國藥典》[1]規(guī)定不低于4.5mg/g 的標(biāo)準(zhǔn)，表明供試絡(luò)石藤藥材質(zhì)量良好。19 個產(chǎn)地中，浙江與河南樣品中去甲絡(luò)石苷與絡(luò)石苷含量較高，湖南樣品次之，安徽、陜西、江西、云南與廣西樣品含量較低，其中浙江縉云樣品去甲絡(luò)石苷含量最高，為2.89mg/g，是其他樣品的1.05～2.43 倍，浙江磐安樣品絡(luò)石苷含量最高，為10.02mg/g，是其他樣品的1.07～2.11 倍，見表3。

3.3 相關(guān)性分析 供試絡(luò)石藤中絡(luò)石苷、去甲絡(luò)石苷與生長性狀、生境因子關(guān)系密切（見表4）。絡(luò)石苷與藤莖長、藤莖粗、葉長、葉長寬比、經(jīng)度、緯度呈正相關(guān)關(guān)系，其中與經(jīng)度正相關(guān)性最高，相關(guān)系數(shù)為0.6835，與葉長寬比正相關(guān)性次之，相關(guān)系數(shù)為0.3317，與海拔呈唯一負(fù)相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為-0.4216，而與葉寬相關(guān)性較低，相關(guān)系數(shù)僅為0.0167；去甲絡(luò)石苷與葉長寬比、經(jīng)度、緯度呈正相關(guān)關(guān)系，其中與經(jīng)度正相關(guān)性最高，相關(guān)系數(shù)為0.5224，與葉長寬比正相關(guān)性次高，相關(guān)系數(shù)為0.1801，與葉寬、海拔呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，其中與海拔負(fù)相關(guān)關(guān)系最高，相關(guān)系數(shù)為-0.2914，而與葉長相關(guān)性較低，相關(guān)系數(shù)僅為0.0503。相關(guān)性分析結(jié)果表明，在供試經(jīng)緯度與海拔范圍內(nèi)，高經(jīng)緯度、低海拔地區(qū)種植絡(luò)石藤有利于其藤莖中絡(luò)石苷與去甲絡(luò)石苷成分含量積累。

3.4 聚類分析 以木脂素含量與生長性狀為參考指標(biāo)，根據(jù)歐式距離D2=18.05 將19 個產(chǎn)地劃分為4 個類群（見圖2）。第Ⅰ類群共4 個產(chǎn)地，為云南與廣西產(chǎn)地，包括云南大姚、云南巧家、廣西西林與廣西樂業(yè)，該類群絡(luò)石藤植株較高，藤莖較粗壯，葉片大而狹長，但絡(luò)石苷與去甲絡(luò)石苷含量較低；第Ⅱ類群共8 個產(chǎn)地，為浙江、湖南與河南產(chǎn)地，該類群絡(luò)石藤植株中等高度，葉片較大或中等大小，葉型多狹長少寬厚，絡(luò)石苷與去甲絡(luò)石苷含量較高；第Ⅲ類群僅2 個產(chǎn)地，為安徽休寧與安徽祁門，該類群絡(luò)石藤植株較矮，藤莖較細(xì)，葉片小而多寬厚，絡(luò)石苷與去甲絡(luò)石苷含量較低；第Ⅳ類群共5 個產(chǎn)地，包括陜西藍(lán)田、陜西漢陰、江西永新、陜西柞水與江西婺源，該類群絡(luò)石藤植株最矮，藤莖細(xì)，葉片小而寬厚，絡(luò)石苷與去甲絡(luò)石苷含量較低。

表3 絡(luò)石藤生長性狀、木脂素類成分含量比較

表4 絡(luò)石藤中2 種木脂素含量與生長性狀、生境因子間的相關(guān)性

圖2 19 批絡(luò)石藤樣品聚類分析圖

4 討論

絡(luò)石苷是2020 年版《中華人民共和國藥典》規(guī)定的絡(luò)石藤藥材及其飲片的主要質(zhì)量評價指標(biāo)，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抑菌等藥理活性，在已有文獻(xiàn)與2020年版《中華人民共和國藥典》的基礎(chǔ)上[1，11]，本試驗(yàn)考察了提取溶劑（甲醇、80%甲醇、乙醇）、提取方式（超聲、加熱回流、索式提?。?、提取時間（20min、30min、40min）、流動相（甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.2%冰醋酸）及檢測波長對絡(luò)石藤中絡(luò)石苷與去甲絡(luò)石苷含量測定的影響，發(fā)現(xiàn)以甲醇為提取溶劑，在室溫超聲（功率250W，頻率35kHz）提取30min 即可提取完全，在Agilent Extend-C18 色譜柱（4.6×250mm，5μm），流動相乙腈-0.2%冰醋酸，流速1.0mL/min，檢測波長280nm，柱溫28℃，進(jìn)樣量10μL 的色譜條件下，洗脫效果較好，去甲絡(luò)石苷與絡(luò)石苷的保留時間分別為22.51min 與28.36min，色譜峰分離度均＞1.5，理論塔板數(shù)＞4500，定量限分別為2.86μg/mL 與5.28μg/mL，檢測限為2.13μg/mL 與3.95μg/mL。本試驗(yàn)建立HPLC 測定絡(luò)石藤干燥帶葉藤莖中去甲絡(luò)石苷與絡(luò)石苷含量操作簡單，重復(fù)性好，準(zhǔn)確度高，可用于絡(luò)石藤藥材質(zhì)量評價與質(zhì)量控制。

19 個產(chǎn)地絡(luò)石藤中去甲絡(luò)石苷、絡(luò)石苷含量存在差異（P＜0.01），其中浙江與河南樣品含量較高，湖南樣品次之，安徽、陜西、江西、云南與廣西樣品含量較低；經(jīng)度、緯度、海拔與絡(luò)石藤中去甲絡(luò)石苷、絡(luò)石苷含量積累關(guān)系密切，在供試經(jīng)緯度與海拔范圍內(nèi)，高經(jīng)緯度、低海拔地區(qū)種植絡(luò)石藤有利于其藤莖中絡(luò)石苷與去甲絡(luò)石苷成分含量積累；從絡(luò)石苷與去甲絡(luò)石苷含量看，絡(luò)石藤優(yōu)良種質(zhì)選育可優(yōu)先在高經(jīng)緯度、低海拔的浙江與河南產(chǎn)地中選擇，而從藤莖產(chǎn)量指標(biāo)看，可優(yōu)先在云南與廣西產(chǎn)地中選擇。中藥材中有效成分含量受諸多環(huán)境因素影響，這些環(huán)境因素之間往往具有自相關(guān)性[13]。本實(shí)驗(yàn)將進(jìn)一步在絡(luò)石藤優(yōu)良種質(zhì)篩選的基礎(chǔ)上，開展不同種質(zhì)在同一區(qū)域（不同海拔）條件下種植實(shí)驗(yàn)，以期篩選出高木脂素含量、高產(chǎn)量的絡(luò)石藤優(yōu)良種質(zhì)。同時，因絡(luò)石藤在我國分布較廣，課題組將進(jìn)一步收集其他分布區(qū)如廣東、江蘇、貴州等種質(zhì)資源，擴(kuò)充絡(luò)石藤種質(zhì)資源庫，為絡(luò)石藤優(yōu)良品種選育提供種質(zhì)資源。