阮正英 范廣民 蔡小波 曹學(xué)全 陳崇陽(yáng)

10 號(hào)染色體上缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN）是迄今首個(gè)被發(fā)現(xiàn)的具有雙特異性磷酸酶活性的抑癌基因，目前被認(rèn)為是評(píng)價(jià)腫瘤預(yù)后的重要生物學(xué)行為指標(biāo)[1]，PTEN 的突變或缺失與消化道、前列腺、腦組織等多種腫瘤的增殖、存活、基因穩(wěn)定性、侵襲和轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)[2-3]。PTEN 作用機(jī)制的研究，對(duì)腫瘤的診斷、預(yù)后評(píng)估及基因治療有著重大意義，成為目前的研究熱點(diǎn)之一[4]。研究發(fā)現(xiàn)，PTEN 去甲基化和再表達(dá)，可抑制胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[5]。因此，以PTEN 為靶點(diǎn)可能是今后治療胃癌的新方法。本研究通過(guò)觀察胃癌組織PTEN 的表達(dá)，分析其與胃癌生物學(xué)的關(guān)系，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集浙江省臺(tái)州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院和臺(tái)州市中心醫(yī)院2013 年1 月—2018 年12 月收治的胃腺癌患者（胃癌組）80 例。其中伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移38 例，TNM 分期為Ⅰ～Ⅱ及Ⅲ～Ⅳ各40 例，漿膜層及漿膜內(nèi)浸潤(rùn)44 例，漿膜外浸潤(rùn)36 例，高-中分化41 例，低分化39 例，合并有幽門螺旋桿菌（HP）感染45 例。取同期慢性胃炎組織（對(duì)照組）80 例。本研究獲得臺(tái)州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理批件號(hào)：2015-007），并取得患者知情同意。

1.2 納入、排除標(biāo)準(zhǔn) 胃癌組納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合《食管癌和胃癌治療指南》中胃癌診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]，均行手術(shù)治療，并在術(shù)后經(jīng)病理確診為胃腺癌；（2）術(shù)前均未接受放療或化療；（3）所有標(biāo)本來(lái)自醫(yī)院組織庫(kù)，臨床資料全面。

對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合慢性胃炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]，病理表現(xiàn)為萎縮性胃炎伴（或不伴）腸化，不包括病理表現(xiàn)為異型增生（上皮內(nèi)瘤變）；（2）胃鏡檢查前均未接受糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑、放療或化療。

排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）有其他系統(tǒng)惡性腫瘤，如食管癌、肝癌等；（2）有嚴(yán)重的自身免疫性疾病，如甲狀腺功能亢進(jìn)、糖尿病等；（3）術(shù)前用過(guò)免疫抑制劑。

1.3 主要試劑 兔抗人PTEN IgG 抗體購(gòu)自英國(guó)biorbyt 公司（生產(chǎn)批號(hào)GR168302-1），二抗即用型DAB 染色免疫組化試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司（生產(chǎn)批號(hào)19021910）。免疫組化SP 法測(cè)定PTEN 的表達(dá)（工作濃度為1：100）。

1.4 免疫組化法測(cè)定PTEN 表達(dá) SP 兩步法染色測(cè)定PTEN 的表達(dá)，胃組織石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，3%H2O2滅活內(nèi)原性過(guò)氧化物酶，微波抗原，滴加PTEN 抗體，4℃冰箱過(guò)夜，室溫滴加二抗，二甲基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，蘇木素復(fù)染。

1.5 PTEN 陽(yáng)性結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)[8]陽(yáng)性細(xì)胞呈棕黃色表達(dá)，在200 倍光鏡下隨機(jī)選擇5 個(gè)視野觀察細(xì)胞著色情況，計(jì)數(shù)陽(yáng)性例數(shù)及陽(yáng)性率。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜5%為陰性（-），≥5%為陽(yáng)性（+），陽(yáng)性率=陽(yáng)性例數(shù)/總例數(shù)×100%。并對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行灰度掃描，采用免疫組化圖像分析系統(tǒng)，得出細(xì)胞染色的陽(yáng)性強(qiáng)度，計(jì)算光密度（OD）值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用成組資料t 檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以例（率）表示，采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料比較 胃癌組男47 例，女33 例，年齡41～78（62.76±8.02）歲。對(duì)照組男42 例，女38例，年齡45～76（62.85±7.55）歲。兩組患者性別、年齡比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 均＞0.05）。

2.2 PTEN 在胃組織表達(dá)水平 免疫組化結(jié)果顯示，陽(yáng)性細(xì)胞多見(jiàn)表達(dá)于細(xì)胞的胞核中，少量表達(dá)于胞漿中。胃癌組PTEN 陽(yáng)性率和陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度顯著低于對(duì)照組（P 均＜0.01），見(jiàn)表1、圖1。

表1 胃腺癌和慢性胃炎組織PTEN 表達(dá)水平比較

圖1 免疫組化法檢測(cè)胃組織PTEN 的表達(dá)（DAB 染色×200）

2.3 胃腺癌組織PTEN 表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系 胃癌組PTEN 陽(yáng)性率和陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度在低分化、伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃腺癌組織均分別顯著低于高-中分化、不伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃腺癌組織（P＜0.05 或＜0.01）；漿膜外浸潤(rùn)胃癌組織PTEN 的陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度顯著低于漿膜層及漿膜內(nèi)浸潤(rùn)（P＜0.01），兩組陽(yáng)性率表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；TNM 分期為Ⅲ～Ⅳ組胃癌組織的PTEN 陽(yáng)性率顯著低于TNM 分期為Ⅰ～Ⅱ組（P＜0.05），兩組陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；不同性別、年齡胃腺癌組織PTEN 陽(yáng)性率和陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

表2 胃癌組織PTEN 表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系

2.4 HP 感染胃癌組PTEN 表達(dá)水平 HP 陽(yáng)性感染胃癌組PTEN 陽(yáng)性率及陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度低于HP 陰性感染胃癌組（P＜0.05 或P＜0.01），見(jiàn)表3。

3 討論

PTEN 是1997 年分離鑒定的一種新穎的抑癌基因，基因位于染色體10q23.3，全長(zhǎng)200kb，具有與酪氨酸磷酸酯酶相似的功能，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。與抑癌功能相關(guān)的結(jié)構(gòu)域主要是氨基端的磷酸酶結(jié)構(gòu)域、脂質(zhì)結(jié)合c2 結(jié)構(gòu)域和羧基端結(jié)構(gòu)域，部分機(jī)制可能是通過(guò)PI3K/PTEN/Akt/mTOR 信號(hào)通路，參與胃癌細(xì)胞增殖、凋亡、血管生成、侵襲與轉(zhuǎn)移等過(guò)程[9]。過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子EYA1 可促進(jìn)胃癌細(xì)胞株SGC-7901 PTEN 的表達(dá)、抑制PI3K/Akt 通路的激活，抑制細(xì)胞胃癌細(xì)胞株的增殖、遷移和侵襲能力，抑制細(xì)胞凋亡[10]。通過(guò)改變miR-590-5p 的表達(dá)水平可以上調(diào)或下調(diào)PTEN 的表達(dá)，從而提高胃腺癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，起到治療胃癌的作用[11]。

表3 HP 感染胃腺癌組織PTEN 表達(dá)水平

本研究發(fā)現(xiàn)，陽(yáng)性細(xì)胞多見(jiàn)表達(dá)于細(xì)胞的胞核中，少量表達(dá)于細(xì)胞的胞漿中。提示PTEN 可通過(guò)細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核部位發(fā)揮其病理生理功能[12]。研究還發(fā)現(xiàn)，胃癌組織PTEN 的表達(dá)強(qiáng)度低于慢性胃炎組織，提示可能由于PTEN 的表達(dá)下降，其抑癌作用減弱，降低了對(duì)癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用，從而間接促進(jìn)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[13]。

本研究分析了PTEN 與胃癌患者性別、年齡、腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)程度、TNM 分期的相關(guān)性，結(jié)果顯示，在低分化的胃癌組織中PTEN 的表達(dá)強(qiáng)度低于高-中分化的胃癌組織，提示隨著胃癌細(xì)胞的分化程度降低PTEN 的表達(dá)水平也隨之降低；同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，在伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織PTEN表達(dá)強(qiáng)度也降低，提示PTEN 與不良預(yù)后有關(guān)，與楊銘等[14]研究相似。本研究結(jié)果還顯示，有漿膜外浸潤(rùn)時(shí)PTEN 的陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度降低，而在TNM 分期為Ⅲ～Ⅳ時(shí)PTEN 的陽(yáng)性率下降。表明在有漿膜外浸潤(rùn)或TNM 分期為Ⅲ～Ⅳ時(shí)，PTEN 呈現(xiàn)低表達(dá)，提示隨著疾病生物學(xué)惡性程度增加，PTEN 水平下降，其抑癌作用下降。但也有研究認(rèn)為，PTEN 表達(dá)水平與胃癌分化程度和浸潤(rùn)深度無(wú)關(guān)，而與臟器轉(zhuǎn)移相關(guān)[15]，支持PTEN 與腫瘤的不良預(yù)后有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，HP感染胃癌組織PTEN 表達(dá)水平低于無(wú)HP 感染組，表明HP 感染后可能與PTEN 的表達(dá)水平降低有關(guān)，推測(cè)HP 感染誘發(fā)胃癌發(fā)生可能部分通過(guò)降低PTEN抑癌的機(jī)制[16]。年齡≥60 歲與＜60 歲胃癌患者PTEN表達(dá)水平無(wú)差異，男性與女性PTEN 表達(dá)水平也無(wú)差異，提示胃癌患者PTEN 表達(dá)水平不受患者性別、年齡影響，與庹敏和童仕倫[17]研究結(jié)果相似。

綜上所述，胃腺癌組織PTEN 表達(dá)降低，與胃癌組織低分化、伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、漿膜外浸潤(rùn)、TNM 分期Ⅲ～Ⅳ期及HP 感染陽(yáng)性等生物學(xué)特性有關(guān)，預(yù)示胃癌不良預(yù)后。