羅 晨 張 華 歐陽(yáng)侃

神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cells，NSCs）存在于胚胎和成年哺乳動(dòng)物的嗅球、海馬、齒狀回、室管膜等腦區(qū)，其增殖、分化調(diào)控是神經(jīng)再生的主要機(jī)制之一，對(duì)缺血性腦血管疾病所引起的神經(jīng)損傷具有修復(fù)作用，但僅僅依靠?jī)?nèi)源性NSCs 難以彌補(bǔ)大量的神經(jīng)元丟失或凋亡[1-2]。中醫(yī)藥可促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)再生與修復(fù)，是治療缺血性腦血管疾病的潛在治療策略[3]。研究證實(shí)，單味中藥、中藥有效成分、中藥提取物以及中醫(yī)復(fù)方對(duì)NSCs 具有調(diào)控作用，可以促進(jìn)缺血性腦血管疾病神經(jīng)發(fā)生與損傷修復(fù)[4]。黃芩苷是從黃芩中提取的一種黃酮類化合物，可誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的胚胎皮層NSCs 分化為神經(jīng)元，并抑制其向星形膠質(zhì)細(xì)胞分化[5]。黃芩苷對(duì)在體全腦缺血/再灌注損傷大鼠海馬NSCs 的增殖具有促進(jìn)作用，并改善大鼠認(rèn)知功能[6]。本實(shí)驗(yàn)擬采用體外氧糖剝奪/再?gòu)?fù)氧（OGD/R）損傷模型模擬體內(nèi)腦缺血/再灌注損傷，觀察黃芩苷對(duì)模型大鼠海馬NSCs 的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 新生24h 內(nèi)的SPF 級(jí)SD 大鼠，雌雄不限，體質(zhì)量250～300g，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（浙）2013-0016，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：2008001654872。動(dòng)物房保持通風(fēng)，室溫22～25℃，濕度60%，12h 日光12h 黑夜，自由飲水采食，所有實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用和管理原則。本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院倫理委員會(huì)審核備案。

1.2 主要試劑與儀器 黃芩苷（純度：93.3%）由中國(guó)食品藥品鑒定研究院提供（批號(hào)110715-2013181）；DMEM/F12 培養(yǎng)基（批號(hào)12400-024）、B27 添加劑（批號(hào)17504-044）均購(gòu)于美國(guó)GIBCO 公司；堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF，批號(hào)AF-100-18B）、青霉素（批號(hào)0903311）均由美國(guó)Peprotech 提供；四甲基偶氮唑鹽（MTT，批號(hào)111108）、兔抗BrdU 多克隆抗體（批號(hào)ab26890）、Triton X-100（批號(hào)V900502）均購(gòu)于美國(guó)Sigma 公司；5-溴脫氧尿嘧啶核苷（BrdU 批號(hào)22905630），mil-lipore 公司；二甲基亞砜（DMSO，批號(hào)CAS #67-68-5）、胎牛血清（批號(hào)c2027050）、D-Hank's（批號(hào)H0321）、Earle's 液（批號(hào)114049）均由博士德生物工程有限公司提供；乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒（批號(hào)A020-2），4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，批號(hào)28718-90-3）均購(gòu)于碧云天生物技術(shù)有限公司；小鼠抗巢蛋白（Nestin）多克隆抗體（批號(hào)AN203）、山羊抗小鼠（Cy3 標(biāo)記，批號(hào)115-165-044）、山羊抗兔（FITC 標(biāo)記，批號(hào)10006588）均購(gòu)于美國(guó)Chemicon 公司；AD340 型酶標(biāo)儀（美國(guó)BECKMAN 公司）；IX71 型倒置相差顯微鏡（日本Olympus 公司）；CX41 型奧林巴斯熒光顯微鏡（日本Olympus）；PC1200D 型佳能數(shù)碼相機(jī)（日本Canon），Radiance 2100TM 型激光共聚焦顯微鏡（中國(guó)Bio-Rad 公司）。

1.3 大鼠海馬NSCs 培養(yǎng)和鑒定 將新生SD 大鼠脫頸處死，無(wú)菌條件下取出全腦并置于4℃預(yù)冷DHank's 中，在解剖顯微鏡下分離出海馬組織，剪碎成小塊并置于消化液中37℃孵育20min，入D-Hank's反復(fù)吹打，過(guò)濾、離心、去上清液，細(xì)胞重懸于含完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)液（2%B27、青霉素、20ng/mL bFGF、DMEM/F12、100U/mL 青霉素）中，以密度2×105/mL接種于75cm2培養(yǎng)瓶中，記為P1 代；細(xì)胞在培養(yǎng)箱（37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2）孵育1 周后機(jī)械分離，按2×105/L 密度傳代（P2 代），實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞為P3 代。

海馬NSCs 的鑒定采取Nestin[7]免疫熒光染色檢測(cè)，具體步驟：細(xì)胞用4%多聚甲醛固定，漂洗，血清封閉，加入一抗小鼠抗Nestin（1∶200）4℃孵育過(guò)夜，漂洗，加入二抗山羊抗小鼠（Cy3 標(biāo)記，1∶1000）室溫避光孵育2h，漂洗，在暗室中采取CX41 型奧林巴斯熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組與OGD/R 模型的建立 將P3 代海馬NSCs 隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組、OGD/R 組、黃芩苷組。對(duì)照組：常規(guī)條件（37℃、5%CO2）下培養(yǎng)28h。OGD/R 組：將海馬NSCs 接種于無(wú)糖Earle's 液，置于缺氧罐內(nèi)，通入?yún)捬趸旌蠚怏w（95%N2和5%CO2），夾閉缺氧罐的出口和入口，37℃培養(yǎng)4h，然后換成正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24h，即為OGD/R 模型。黃芩苷組：海馬NSCs 接種于含黃芩苷（30μmol/L）的無(wú)糖Earle's 液中，置于缺氧罐內(nèi)，通入?yún)捬趸旌蠚怏w（95%N2和5%CO2），夾閉缺氧罐的出口和入口，37℃培養(yǎng)處理4h，然后換成含黃芩苷（30μmol/L）正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24h。

1.5 海馬NSCs 存活率和LDH 漏出率檢測(cè) MTT法測(cè)定：將海馬NSCs 接種于96 孔板，加入MTT 溶液（5mg/mL），室溫孵育4h，棄除MTT 溶液，加入DMSO處理10min，在酶標(biāo)儀上570nm 波長(zhǎng)處測(cè)定細(xì)胞的光密度（OD）值；以對(duì)照組存活率為100%，各組細(xì)胞存活率=（OGD/R 組或黃芩苷組OD 值/對(duì)照組OD 值）。

比色法測(cè)定：收集每組海馬NSCs 的培養(yǎng)液，加入2%Triton-X100 裂解細(xì)胞，收集裂解液；按LDH比色法試劑盒測(cè)定培養(yǎng)液和裂解液中LDH 含量。LDH 漏出率=培養(yǎng)液LDH 含量/（培養(yǎng)液LDH 含量+裂解液LDH 含量）×100%。

1.6 海馬NSCs 凋亡檢測(cè) DAPI 測(cè)定：細(xì)胞加入含DAPI（1:1000）的緩沖液，室溫避光處理5min，棄除DAPI 液，漂洗，在暗室中采取CX41 型奧林巴斯熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.7 Nestin/BrdU 免疫熒光染色測(cè)定海馬NSCs 增殖海馬NSCs 加入含BrdU（6μg/mL）的緩沖液，4℃孵育24h。對(duì)海馬NSCs 行Nestin/BrdU 免疫熒光染色：將海馬NSCs 接種于培養(yǎng)板，貼壁3h，4%多聚甲醛固定，血清封閉，一抗混合液[小鼠抗Nestin（1:1000）和兔抗BrdU（1:1500）]4℃孵育過(guò)夜，PBS 緩沖液沖洗，二抗混合液[山羊抗小鼠（Cy3 標(biāo)記）（1:1000）和山羊抗兔（FITC 標(biāo)記）（1:1000）]室溫避光孵育2h，漂洗，熒光顯微鏡下觀察拍照。采用Image J 分析3 組細(xì)胞的Nestin/BrdU 陽(yáng)性結(jié)果，每組隨機(jī)取3 個(gè)細(xì)胞孔，每孔隨機(jī)取5 個(gè)視野，計(jì)數(shù)細(xì)胞面密度和陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較進(jìn)行單因素方差分析；P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 海馬NSCs 培養(yǎng)及鑒定 原代培養(yǎng)3 天的海馬NSCs 在倒置顯微鏡下以神經(jīng)球的方式生長(zhǎng)（見圖1A）；細(xì)胞傳代培養(yǎng)后經(jīng)免疫熒光染色顯示Nestin 表達(dá)呈陽(yáng)性（見圖1B）；提示所培養(yǎng)的細(xì)胞為NSCs，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 黃芩苷對(duì)海馬NSCs 存活率和LDH 漏出率的影響 MTT 法和比色法檢測(cè)結(jié)果顯示，OGD/R 組細(xì)胞OD 值和存活率下降，LDH 漏出率增加（P＜0.01）；與OGD/R 組相比，黃芩苷組細(xì)胞OD 值和存活率明顯升高，LDH 漏出率顯著降低（P＜0.01），見表1。

2.3 黃芩苷對(duì)細(xì)胞凋亡的影響 DAPI 染色顯示，OGD/R 組大量細(xì)胞核萎縮，出現(xiàn)細(xì)胞凋亡碎片或小體，黃芩苷組細(xì)胞的上述現(xiàn)象明顯改善，見圖2。

圖1 原代海馬NSCs 培養(yǎng)及鑒定（免疫熒光染色×200）

表1 黃芩苷對(duì)海馬NSCs 存活率和LDH 漏出率的影響（）

表1 黃芩苷對(duì)海馬NSCs 存活率和LDH 漏出率的影響（）

注：對(duì)照組為常規(guī)條件（37℃、5%CO2）下培養(yǎng)的NSCs；OGD/R 組為氧糖剝奪NSCs；黃芩苷組為氧糖剝奪NSCs，予含30μmol/L 黃芩苷無(wú)糖Earle's 液；NSCs 為神經(jīng)干細(xì)胞；LDH 為乳酸脫氫酶；OD 值為細(xì)胞光密度值；OGD/R 為氧糖剝奪再?gòu)?fù)氧；與對(duì)照組比較，aP＜0.01；與OGD/R組比較，bP＜0.01

2.4 黃芩苷對(duì)海馬增殖的影響 免疫熒光染色檢測(cè)NSCs Nestin/BrdU 表達(dá)顯示，對(duì)照組、OGD/R 組、黃芩苷組均有Nestin/BrdU 陽(yáng)性表達(dá)；對(duì)照組Nestin/BrdU陽(yáng)性表達(dá)較豐富，陽(yáng)性細(xì)胞之間連接較多，細(xì)胞周圍有大量大小和長(zhǎng)短不一的突起；OGD/R 組Nestin/BrdU 陽(yáng)性表達(dá)位置無(wú)異常改變，但陽(yáng)性細(xì)胞較少，細(xì)胞之間的連接和細(xì)胞周圍的突起數(shù)量減少，且細(xì)胞周圍的陽(yáng)性碎片增多；OGD/R 組上述異常變化在給予黃芩苷后有所改善（見圖3）。與對(duì)照組比較，OGD/R 組Nestin/BrdU 陽(yáng)性表達(dá)的面密度及細(xì)胞數(shù)明顯降低（P＜0.01）；黃芩苷組Nestin/BrdU 陽(yáng)性表達(dá)的面密度、細(xì)胞數(shù)顯著多于OGD/R 組（P＜0.01），見表2。

表2 黃芩苷對(duì)Nestin/BrdU 表達(dá)的影響（）

表2 黃芩苷對(duì)Nestin/BrdU 表達(dá)的影響（）

注：對(duì)照組為常規(guī)條件（37℃、5%CO2）下培養(yǎng)的NSCs；OGD/R 組為氧糖剝奪NSCs；黃芩苷組為氧糖剝奪NSCs，予含30μmol/L 黃芩苷無(wú)糖Earle's 液；Nestin 為巢蛋白；BrdU 為5-溴脫氧尿嘧啶核苷；OGD/R 為氧糖剝奪再?gòu)?fù)氧；與對(duì)照組比較，aP＜0.01；與OGD/R 組比較，bP＜0.01

3 討論

缺血性腦卒中可引起神經(jīng)元死亡或凋亡，及時(shí)恢復(fù)缺血區(qū)血液灌注，有利于腦內(nèi)神經(jīng)元再生，但會(huì)進(jìn)一步加重缺血所致的神經(jīng)損傷及腦功能、結(jié)構(gòu)破壞，即發(fā)生缺血再灌注損傷[8]。體外OGD/R 微環(huán)境對(duì)NSCs 增殖、分化的影響是體外模擬缺血性腦卒中的重要模型之一，已被廣泛用于腦卒中的各種動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中[9-10]。海馬是NSCs 的主要分布腦區(qū)之一，該區(qū)域神經(jīng)元與學(xué)習(xí)、記憶等功能聯(lián)系密切。生理?xiàng)l件下NSCs 聚集的海馬齒區(qū)域的氧體積分?jǐn)?shù)為2.5%～3.0%，缺血性腦卒中發(fā)生時(shí)海馬局部的氧體積分?jǐn)?shù)接近于0，引起大量神經(jīng)元丟失或死亡[11]。Nestin 是主要的胚胎中樞神經(jīng)系統(tǒng)第Ⅳ類中間絲蛋白，且常表達(dá)在發(fā)育中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，而在已出現(xiàn)分化的膠質(zhì)細(xì)胞及神經(jīng)元中幾乎不表達(dá)，在NSCs 標(biāo)志物中，Nestin 被廣泛認(rèn)可[12-13]。本研究結(jié)果顯示，原代培養(yǎng)的海馬NSCs 在倒置顯微鏡下以神經(jīng)球的方式生長(zhǎng)，具有折光性強(qiáng)的特點(diǎn)，經(jīng)免疫熒光染色后NSCs 細(xì)胞呈Nestin 陽(yáng)性表達(dá)，提示本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)的細(xì)胞為NSCs。

圖2 黃芩苷對(duì)細(xì)胞凋亡的影響（免疫熒光染色×200）

圖3 黃芩苷對(duì)海馬NSCs Nestin/BrdU 陽(yáng)性表達(dá)的影響（免疫熒光染色×200）

本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，OGD/R 組細(xì)胞OD 值、存活率明顯降低，LDH 漏出率顯著增加（P＜0.01）。LDH 是活細(xì)胞胞漿內(nèi)含酶之一，正常情況下不能通過(guò)細(xì)胞膜；當(dāng)細(xì)胞遭到損傷或死亡時(shí)可釋放至胞外，使細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH 含量增高[14]，說(shuō)明OGD/R 可降低細(xì)胞存活率以及引起細(xì)胞死亡。馬浚寧等[15]采取OGD/R 誘導(dǎo)NSCs 損傷發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增殖能力明顯降低，且可促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生凋亡。本研究DAPI核染結(jié)果顯示，OGD/R 組大量細(xì)胞核萎縮，出現(xiàn)細(xì)胞凋亡碎片或小體。

目前臨床或研究領(lǐng)域?qū)GD/R 誘導(dǎo)大鼠海馬NSCs 損傷的標(biāo)準(zhǔn)藥未見報(bào)道，部分文獻(xiàn)報(bào)道中藥單體對(duì)海馬NSCs 損傷具有保護(hù)作用，但其確切作用尚待研究證實(shí)[10]。本研究結(jié)果顯示，黃芩苷（濃度為30μmol/L）可增強(qiáng)OGD/R 后細(xì)胞的存活率，減少LDH 漏出率，并減輕OGD/R 所引起的細(xì)胞凋亡。BrdU 是一種胸腺嘧啶衍生物，在細(xì)胞處于DNA 合成期時(shí)BrdU 可摻入新合成的DNA 中，經(jīng)免疫組化染色法檢測(cè)其表達(dá)可用于評(píng)價(jià)細(xì)胞的增殖狀態(tài)[16]。本研究結(jié)果顯示，OGD/R 組Nestin/BrdU 陽(yáng)性表達(dá)位置無(wú)異常改變，但陽(yáng)性細(xì)胞較少，細(xì)胞之間的連接和細(xì)胞周圍的突起數(shù)量減少，且細(xì)胞周圍的陽(yáng)性碎片增多；OGD/R 組上述異常變化在給予黃芩苷后有所改善。本研究結(jié)果還顯示，黃芩苷（濃度為30μmol/L）能明顯提高Nestin/BrdU 陽(yáng)性表達(dá)的面密度、細(xì)胞數(shù)，即改善OGD/R 抑制海馬NSCs 的增殖。崔猛等[5]觀察到7.5、15、30μmol/L 的黃芩苷均可促進(jìn)體外培養(yǎng)的NSCs 向神經(jīng)元分化，以30μmol/L 黃芩苷組最明顯。林筱潔等[16]也發(fā)現(xiàn)，20μmol/L 的黃芩苷可通過(guò)調(diào)控線粒體自噬，減輕OGD/R 誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷。綜合以上研究表明，黃芩苷（濃度為30μmol/L）能減輕OGD/R 對(duì)大鼠海馬NSCs 的損傷，并促進(jìn)其增殖。但黃芩苷能否促進(jìn)體內(nèi)腦缺血性損傷后海馬NSCs 的增殖、改善神經(jīng)損傷，則有待進(jìn)一步探討。