王 丹，張?jiān)品?，董林?，姜 紅

(1.中國人民公安大學(xué)偵查學(xué)院，北京 100038；2.公安部物證鑒定中心，北京 100038)

硫丹于1956年由赫司特公司開發(fā)[1]，是一種廣譜有機(jī)氯殺蟲殺螨劑。商品化的硫丹是α-硫丹、β-硫丹兩種立體異構(gòu)體以質(zhì)量比7∶3組成的混合制劑，在環(huán)境中的代謝產(chǎn)物主要為硫丹硫酸酯[2-3]。硫丹和硫丹硫酸酯環(huán)境半衰期長，對生物體具有神經(jīng)、生殖和發(fā)育毒性，自2019年3月起，已在全球范圍內(nèi)禁用[4-5]，但其仍通過多種非法途徑流入市場。

硫丹由于其高毒性常被用于魚塘投毒案件中，造成大量經(jīng)濟(jì)損失甚至影響社會穩(wěn)定。在刑事技術(shù)領(lǐng)域，開發(fā)快速、準(zhǔn)確的硫丹測定方法已成為長期關(guān)注的焦點(diǎn)之一。在魚塘投毒案件中，魚塘面積大導(dǎo)致目標(biāo)毒物含量較低，養(yǎng)殖過程中投放各種藥物導(dǎo)致魚塘水基質(zhì)復(fù)雜。相關(guān)測定方法的研究雖然較多，但是每種測定方法都有不同方面的局限性。硫丹可以采用氣相色譜法[6]和氣相色譜-質(zhì)譜法[7]進(jìn)行測定。氣相色譜法僅依靠保留時(shí)間定性，容易產(chǎn)生假陽性結(jié)果；氣相色譜-質(zhì)譜法使用美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院(NIST)譜庫進(jìn)行檢索，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)品匹配，定性結(jié)果較為準(zhǔn)確，但是其測定的靈敏度比較低。使用上述儀器方法測定水中的硫丹，通常使用液液萃取(LLE)[8]、固相萃取(SPE)[9]等前處理方法對水樣進(jìn)行濃縮。LLE 需要消耗大量有機(jī)溶劑，對環(huán)境和試驗(yàn)人員具有潛在傷害；SPE 需經(jīng)柱活化、萃取、洗脫、濃縮等步驟，成本高且耗時(shí)較長。近幾年，分散液液微萃取(DLLME)[10]、Qu ECh ERS法[11]以及直接浸入式固相微萃取(DI-SPME)[12]等新型前處理方法也被應(yīng)用于水樣中硫丹的測定。DLLME和Qu ECh ERS法操作復(fù)雜，對試驗(yàn)人員的要求較高；DI-SPME在萃取過程中會受到溶液中的不揮發(fā)性高分子物質(zhì)或者腐殖質(zhì)、蛋白質(zhì)等其他雜質(zhì)污染，從而損耗萃取纖維，大大縮短了萃取纖維的使用壽命。

頂空固相微萃取(HS-SPME)將沸點(diǎn)相對較低的目標(biāo)物蒸發(fā)至頂空相中，而將難揮發(fā)的雜質(zhì)保留在水相中，在實(shí)現(xiàn)了待測物富集的同時(shí)，還減少了其他雜質(zhì)的污染，既能保護(hù)萃取纖維，又能減少儀器污染、降低儀器的維護(hù)頻次[13]。文獻(xiàn)[14]優(yōu)化了頂空固相微萃取的條件，結(jié)合氣相色譜法(電子俘獲檢測器)測定水中有機(jī)氯農(nóng)藥的含量，取得了良好的結(jié)果，但電子俘獲檢測器容易造成假陽性結(jié)果，不宜在案件中使用。

綜上所述，測定魚塘水樣中的硫丹需解決3個(gè)問題:①優(yōu)化前處理方法以減少魚塘水基質(zhì)對測定的干擾；②提高前處理自動化程度，減少技術(shù)人員的工作時(shí)間和強(qiáng)度，同時(shí)減少有機(jī)溶劑的使用；③使用高靈敏度的測定方法以減少單次分析所需的魚塘水樣用量。針對上述問題，擬通過對HS-SPME和氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(GC-MS/MS)條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了魚塘水樣中硫丹(α-硫丹和β-硫丹)和硫丹硫酸酯的全自動在線分析方法，并應(yīng)用于魚塘投毒案件水樣中硫丹的測定。本方法單次測定僅需使用2.0 mL水樣，且整個(gè)分析流程幾乎全自動完成，降低了對操作人員的要求，節(jié)約了試驗(yàn)成本，實(shí)現(xiàn)了批量化的在線分析，為魚塘水中毒物的定性、定量分析開辟了新的思路。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

GCMS-TQ8050 NX 型氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀；PAL RSI型全自動樣品處理及進(jìn)樣系統(tǒng)，帶頂空萃取模塊；Milli-Q Direct型水純化系統(tǒng)；100μm 聚二甲基硅氧烷(PDMS)萃取纖維頭。

α-硫丹、β-硫丹、硫丹硫酸酯標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液:1.000 g·L－1，分別稱取10.00 mgα-硫丹、β-硫丹、硫丹硫酸酯標(biāo)準(zhǔn)品(純度不小于98%)，用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至10 mL 容量瓶中，用甲醇定容，于－20 ℃保存。

α-硫丹、β-硫丹、硫丹硫酸酯混合標(biāo)準(zhǔn)溶液:含20.0 mg·L－1α-硫丹、硫丹硫酸酯以及40.0 mg·L－1β-硫丹，分別移取1.000 g·L－1α-硫丹標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液1.0 mL、1.000 g·L－1β-硫丹標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液2.0 mL 及1.000 g·L－1硫丹硫酸酯標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液1.0 mL于50 mL容量瓶中，用甲醇定容，于－20 ℃保存。使用時(shí)用水逐級稀釋至所需質(zhì)量濃度。

甲醇為色譜純；氯化鈉為分析純；試驗(yàn)用水為一級水。

1.2 儀器工作條件

1)頂空固相微萃取條件 萃取溫度75 ℃；萃取前平衡時(shí)間10 min，萃取時(shí)間60 min；振蕩速率250 r·min－1；進(jìn)樣針插入樣品瓶深度為22 mm，插入進(jìn)樣口深度為54 mm；進(jìn)樣口解析溫度260 ℃，解析時(shí)間2 min。

2)色譜條件 DB-5 ms毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；載氣為高純氦氣(純度為99.999%)，恒流模式，流量1.56 mL·min－1；進(jìn)樣口溫度260℃；不分流進(jìn)樣模式。柱升溫程序:初始溫度60 ℃，保持2 min；以10 ℃·min－1速率升溫至280 ℃，保持5 min。

3)質(zhì)譜條件 電子轟擊離子源(EI)；離子源溫度200 ℃，接口溫度280 ℃；溶劑延遲時(shí)間2 min；掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式，掃描間隔0.1 s；碰撞氣為高純氬氣。其余質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 質(zhì)譜參數(shù)Tab.1 MS parameters

1.3 試驗(yàn)方法

移取2.0 mL魚塘水樣于20 mL 頂空瓶中，加入0.6 g氯化鈉，旋緊裝有聚四氟乙烯/聚硅氧烷蓋墊的螺紋蓋，放入樣品盤中。使用100μm PDMS萃取纖維頭，按儀器工作條件進(jìn)行測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜行為

按試驗(yàn)方法對α-硫丹、β-硫丹和硫丹硫酸酯的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定，其總離子流色譜圖見圖1。

圖1 α-硫丹、β-硫丹和硫丹硫酸酯混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion current chromatogram of mixed standard solution ofα-endosulfan，β-endosulfan，and endosulfan sulfate

2.2 頂空固相微萃取條件的選擇

2.2.1 萃取溫度

頂空固相微萃取包含兩個(gè)過程，即目標(biāo)物從樣品基質(zhì)中揮發(fā)進(jìn)入頂空氣相的過程，以及萃取纖維對目標(biāo)物的吸附過程。一方面，升高萃取溫度可以增大擴(kuò)散系數(shù)，加速目標(biāo)物的揮發(fā)；另一方面，升高萃取溫度會導(dǎo)致分配系數(shù)降低，影響萃取纖維對目標(biāo)物的吸附，降低萃取效率。試驗(yàn)考察了萃取溫度依次為30，45，60，75，90℃時(shí)對α-硫丹、β-硫丹和硫丹硫酸酯萃取效果的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 萃取溫度對α-硫丹、β-硫丹和硫丹硫酸酯萃取效果的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on extraction efficiency ofα-endosulfan，β-endosulfan，and endosulfan sulfate

由圖2可知:萃取溫度為30～75 ℃時(shí)，α-硫丹、β-硫丹和硫丹硫酸酯的峰面積均隨萃取溫度升高而增大；萃取溫度為75～90 ℃時(shí)，α-硫丹和β-硫丹的峰面積均隨萃取溫度升高而減小，硫丹硫酸酯的峰面積隨萃取溫度升高而繼續(xù)增大。試驗(yàn)選擇萃取溫度為75 ℃。

2.2.2 萃取時(shí)間

頂空固相微萃取作為一種平衡萃取技術(shù)，萃取時(shí)目標(biāo)物在樣品基質(zhì)、頂空氣體以及纖維涂層這三相中轉(zhuǎn)移直至平衡。若萃取時(shí)間過短，吸附尚未達(dá)到平衡狀態(tài)，無法保證方法的靈敏度和精確度，達(dá)到平衡狀態(tài)之后繼續(xù)萃取只會增加該方法的時(shí)間成本，對于提高方法的靈敏度和精確度無意義。試驗(yàn)考察了萃取時(shí)間依次為30，45，60，75，90 min時(shí)對α-硫丹、β-硫丹和硫丹硫酸酯萃取效果的影響，結(jié)果見圖3。

由圖3可知:隨著萃取時(shí)間的延長，α-硫丹、β-硫丹和硫丹硫酸酯的峰面積逐漸增大；萃取時(shí)間為60 min時(shí)，α-硫丹、β-硫丹和硫丹硫酸酯在纖維涂層中的吸附均達(dá)到平衡。試驗(yàn)選擇萃取時(shí)間為60 min。

圖3 萃取時(shí)間對α-硫丹、β-硫丹和硫丹硫酸酯萃取效果的影響Fig.3 Effect of extraction time on extraction efficiency ofα-endosulfan，β-endosulfan，and endosulfan sulfate

2.2.3 氯化鈉加入量

在使用頂空固相微萃取過程中常加入大量的鹽來增加溶液的離子強(qiáng)度，使目標(biāo)物在水溶液中的溶解度下降，分配系數(shù)增大，改善方法靈敏度[15]。試驗(yàn)選擇最常用的鹽氯化鈉作為離子強(qiáng)度調(diào)節(jié)劑，考察了水樣中不加氯化鈉和加入過量氯化鈉(加入量為0.3 kg·L－1)，即離子強(qiáng)度對α-硫丹、β-硫丹和硫丹硫酸酯萃取效果的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 離子強(qiáng)度對α-硫丹、β-硫丹和硫丹硫酸酯萃取效果的影響Fig.4 Effect of ionic strength on extraction efficiency ofα-endosulfan，β-endosulfan，and endosulfan sulfate

由圖4可知:加入過量氯化鈉(0.3 kg·L－1)時(shí)，α-硫丹、β-硫丹和硫丹硫酸酯的峰面積增加了0.69～4.87倍。這是由于加入過量氯化鈉使樣品達(dá)到飽和狀態(tài)后，可將樣品間離子強(qiáng)度的差異降至最低。試驗(yàn)在水樣中添加過量氯化鈉進(jìn)行萃取，選擇氯化鈉加入量為0.3 kg·L－1。

2.2.4 樣品體積

在萃取溫度不變的情況下，增大樣品體積，頂空固相微萃取的萃取相中樣品絕對量相應(yīng)增加，因此增大樣品體積可以提高測定方法的靈敏度。試驗(yàn)在保證萃取纖維不接觸水相的前提下，考察了樣品體積依次為0.5，1.0，2.0 mL 時(shí)對α-硫丹、β-硫丹和硫丹硫酸酯萃取效果的影響，結(jié)果見圖5。

由圖5可知:隨著樣品體積的增大，α-硫丹、β-硫丹和硫丹硫酸酯的峰面積逐漸增大；樣品體積為2.0 mL時(shí)，α-硫丹、β-硫丹和硫丹硫酸酯的峰面積最大。試驗(yàn)結(jié)果表明:樣品體積大于2.0 mL 時(shí)，頂空固相微萃取過程的劇烈振蕩會導(dǎo)致萃取頭接觸到液體樣品，從而減小了萃取頭的使用壽命；樣品體積為2.0 mL 時(shí)，萃取效果最好。試驗(yàn)選擇樣品體積為2.0 mL。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和測定下限

按試驗(yàn)方法對含0.05，0.5，5.0，10，25，50，100μg·L－1α-硫丹、硫丹硫酸酯和0.1，1.0，10，20，5 0，100，200μg·L－1β-硫丹的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列進(jìn)行測定，以α-硫丹、β-硫丹和硫丹硫酸酯的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。α-硫丹、β-硫丹和硫丹硫酸酯的線性范圍、線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表2。

圖5 樣品體積對α-硫丹、β-硫丹和硫丹硫酸酯萃取效果的影響Fig.5 Effect of sample volume on extraction efficiency ofα-endosulfan，β-endosulfan，and endosulfan sulfate

以3倍信噪比和10倍信噪比計(jì)算方法的檢出限(3S/N)和測定下限(10S/N)，結(jié)果見表2。

表2 線性范圍、線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和測定下限Tab.2 Linearity ranges，linear regression equations，correlation coefficients，detection limits and lower limits of determination

2.4 精密度和回收試驗(yàn)

按試驗(yàn)方法對空白水樣分別進(jìn)行3個(gè)濃度水平的加標(biāo)回收試驗(yàn)，每個(gè)濃度水平平行測定6個(gè)樣品，連續(xù)測定3 d，計(jì)算回收率和測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果見表3。

由表3可知:回收率為83.6%～117%，日內(nèi)RSD 為2.2%～18%，日間RSD 為4.2%～18%。樣品在加熱模塊中升溫并不斷振蕩進(jìn)行萃取時(shí)，樣品瓶壁可能會吸附部分目標(biāo)物，尤其是當(dāng)基質(zhì)中目標(biāo)物含量較低時(shí)，瓶壁的吸附作用會對測定值的RSD 產(chǎn)生較大影響。

表3 精密度和回收試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Results of tests for precision and recovery

在空白水樣中分別設(shè)置α-硫丹、硫丹硫酸酯的加標(biāo)質(zhì)量濃度為10μg·L－1，β-硫丹的加標(biāo)質(zhì)量濃度為20μg·L－1，使用同一萃取頭按試驗(yàn)方法連續(xù)測定180個(gè)樣品，樣品中3個(gè)化合物峰面積的變化見圖6。1號樣品和180號樣品的色譜圖見圖7。

圖6 樣品中3個(gè)化合物峰面積的變化Fig.6 Variation of peak area of 3 compounds in the samples

圖7 1號樣品和180號樣品的色譜圖Fig.7 Chromatograms of sample 1 and sample 180

由圖6、圖7可知:180號樣品中，α-硫丹、β-硫丹和硫丹硫酸酯的峰形、峰面積以及信噪比未見明顯變化。這表明萃取頭的萃取效率以及儀器靈敏度未受影響，方法具有較好的穩(wěn)定性。

2.5 案例應(yīng)用

2019年8月22日，我中心受理河北省盧龍縣送檢的投毒案件樣品，安某某報(bào)警稱其自家水庫里養(yǎng)的魚被人投藥，按試驗(yàn)方法檢驗(yàn)其送檢的8瓶水樣，均檢出α-硫丹和β-硫丹。2019年9月18日，我中心受理河南省魯山縣送檢的投毒案件樣品，許某某承包魚塘內(nèi)的魚大量死亡，懷疑是硫丹投毒所致，按試驗(yàn)方法對送檢的魚塘水樣和魚鰓樣品進(jìn)行分析，魚塘水中檢出α-硫丹、β-硫丹和硫丹硫酸酯，同時(shí)將魚鰓的血水稀釋10 倍后進(jìn)行分析，檢出了α-硫丹和β-硫丹。

頂空固相微萃取對魚塘水中的硫丹類化合物具有良好的萃取效果，結(jié)合氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行分析，檢出限低達(dá)0.001μg·L－1。本方法僅需2.0 mL魚塘水樣，無需使用有機(jī)溶劑，綠色環(huán)保，測定過程對儀器污染小，連續(xù)進(jìn)樣180針，目標(biāo)物的峰形、靈敏度未受明顯影響。萃取步驟為程序設(shè)定的全自動化操作，平行性好，且萃取模塊直接搭載在質(zhì)譜儀上方，樣品處理完畢后直接進(jìn)樣測定，整個(gè)過程僅需1.5 h左右，實(shí)現(xiàn)了前處理分析一體化的功能，能夠滿足公安機(jī)關(guān)對魚塘投毒案件水樣中硫丹的測定需求。

除硫丹外，有機(jī)磷及擬除蟲菊酯類農(nóng)藥也常見于魚塘投毒案件中，后續(xù)的方法研究可以進(jìn)一步根據(jù)有機(jī)磷和擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的性質(zhì)，篩選不同的萃取纖維涂層種類，優(yōu)化萃取條件，建立測定魚塘水中有機(jī)磷及擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的頂空固相微萃取-氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，更加豐富該項(xiàng)技術(shù)在刑事技術(shù)領(lǐng)域的應(yīng)用。