金 燦，李克虎，Harold Corke，李海權(quán)?

（1.上海交通大學(xué) 農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院 食品科學(xué)與工程系，上海200240；2.河北省農(nóng)林科學(xué)院 谷子研究所，河北 石家莊 050035；3.貴州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 生物技術(shù)系，貴州 貴陽 550025）

黍稷（Panicum miliaceum L.）屬于禾本科植物，是一種廣泛種植的谷類作物，被認(rèn)為是人類歷史上最早的種植谷物之一[1]。它是一種環(huán)境友好作物，在貧瘠、干旱和高溫環(huán)境下仍然可以生長[2]。黍稷種植過程中不需要使用化肥和農(nóng)藥，種子的生長成熟周期很短。因此，黍稷能夠在其他糧食作物可能欠收的地區(qū)生長生產(chǎn)[3]，所以它是重要的戰(zhàn)略儲(chǔ)備作物。

目前已發(fā)表有關(guān)黍稷的研究主要集中在其營養(yǎng)成分和抗氧化性方面。Yu Wen等研究了不同地理來源的黍稷所含淀粉特性的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)黍稷淀粉的理化性質(zhì)受基因型和環(huán)境因素的影響[4]。Akharume等測定了籽粒蛋白質(zhì)組分的物理化學(xué)和功能特性，并討論了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系[5]。Shen等比較了9個(gè)來自中國的黍稷品種之間的化學(xué)成分、抗氧化和抗細(xì)菌增殖活性[6]。然而，目前國內(nèi)外對以黍稷為主要原料的食品開發(fā)還不夠充分，作為一種新的商業(yè)用油類別，谷物油由于其獨(dú)特的健康效益而引起消費(fèi)者的興趣[7-9]。有研究表明，黍稷籽粒有生產(chǎn)食用油或生物柴油的開發(fā)前景[10]。由于目前國內(nèi)外有關(guān)黍稷油的資料有限，還需要進(jìn)行基礎(chǔ)性和系統(tǒng)性的研究，以便更好地了解這種油的質(zhì)量和潛在用途。類似研究已經(jīng)在主要谷類作物（玉米和水稻）上開展，甚至許多小雜糧作物也有了一定研究。Mehmood等為了研究新型食用油來源，測定了10個(gè)高粱品種的油脂含量和脂肪酸組成[11]。在燕麥中，Banas研究了不同品種和不同種子發(fā)育階段籽粒中的含油量和脂肪酸分布[12]。在谷子中，粗脂肪含量、脂肪酸組成及其相關(guān)性已經(jīng)得到了很好的研究[13-14]。

谷物的含油量決定了其油脂產(chǎn)品開發(fā)的潛力，脂肪酸組成決定著油脂的理化性質(zhì)、營養(yǎng)功能及開發(fā)前景。目前，脂肪酸組成在黍稷品種間的差異，各脂肪酸的相關(guān)性，均鮮有報(bào)道。因此，本研究以來自不同產(chǎn)地的 18個(gè)黍稷品種為研究對象，測定籽粒含油量及脂肪酸組成，分析油分性狀的相關(guān)性及品種間的差異，旨在為黍稷油脂的開發(fā)利用以及定向育種提供一定的科學(xué)指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 材料和儀器

實(shí)驗(yàn)材料：18個(gè)來自不同地區(qū)的黍稷原料，產(chǎn)地和品種名如表1所列。

實(shí)驗(yàn)儀器：JLG-ⅡA礱谷機(jī)：中儲(chǔ)糧成都儲(chǔ)藏研究院有限公司；HC-700Y高速粉碎機(jī)：永康市天祺盛世工貿(mào)有限公司；SZC-101脂肪測定儀：上海纖檢儀器有限公司；DHG-9030A電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；LE204E/02電子天平：梅特勒-托利多儀器上海有限公司；7890B-5975B 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）：美國安捷倫公司。

1.2 石油醚提取黍稷油工藝

將黍稷籽粒用礱谷機(jī)脫去外殼，烘干至恒重后，用高速粉碎機(jī)將其打碎成粉末狀備用。然后用索氏提取法提取黍稷油：用濾紙準(zhǔn)確稱取 2 g（精確到0.001 g）黍稷粉，包裹后放入濾紙筒，放入索氏提取儀并打開循環(huán)冷凝水，每個(gè)樣品杯中加入一定比例的石油醚，打開脂肪提取儀進(jìn)行四個(gè)階段的溫度和時(shí)間設(shè)置：（1）浸泡：55 ℃，30 min；（2）淋洗：80 ℃，30 min；（3）回收：95 ℃，15 min；（4）蒸干：110 ℃，10 min。然后取出樣品杯進(jìn)行稱重，計(jì)算黍稷油的得率。重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)，選取得率的平均值。

式中：M1為提取后樣品杯與油的質(zhì)量（g）；M0為提取前空的樣品杯的質(zhì)量（g）；M為樣品黍稷粉末的質(zhì)量（g）。

1.3 樣品檢測脂肪酸前處理

在進(jìn)行 GC-MS分析前要進(jìn)行脂肪酸的甲酯化。精確稱量50 mg經(jīng)上述方法得到的黍稷油，并將其轉(zhuǎn)移到10 mL反應(yīng)管中，然后，添加2 mL正己烷和2 mL甲醇?xì)溲趸c溶液（0.4 mol/L）。蓋緊管蓋后，在旋渦混合器上將其振蕩混合30 s。將盛有樣品的管子放入70 ℃的水浴中10 min，然后取出并使其冷卻至室溫。加入飽和NaCl溶液至總體積達(dá)到10 mL，將混合物搖勻后分層，收集上清液，經(jīng)微濾后轉(zhuǎn)移至色譜瓶待用。

1.4 樣品檢測GC-MS條件

氣相色譜條件：色譜柱：DB-wax（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；升溫程序：初始柱 GC-MS溫為70 ℃，持續(xù)5 min，隨后以4 ℃/min的速率升高至 200 ℃，以 2 ℃/min的速率升至240 ℃，溫度保持在240 ℃下10 min；進(jìn)樣溫度：260 ℃；進(jìn)樣量：1.00；分流比：不分流；載氣：氦氣（99.999%）；流速：1 mL/min。

質(zhì)譜條件：電離方式：EI+，70 ev；掃描方式：全掃描；選擇離子監(jiān)測：74 m/z；質(zhì)量掃描范圍30～500 amu；離子源溫度：230 ℃；四級桿溫度：150 ℃。

1.5 脂肪酸含量分析

為了確保鑒定的準(zhǔn)確性，將主要成分與Supelco 37個(gè)組分脂肪酸甲酯（FAME）混合物標(biāo)準(zhǔn)品（CRM47885，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO）進(jìn)行比較。將標(biāo)準(zhǔn)品用正己烷逐級稀釋至原濃度的 1/2、1/4、1/8、1/16，得到一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品。標(biāo)準(zhǔn)品在1.4條件下進(jìn)行GC-MS分析后建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。利用 NIST譜庫，并對比標(biāo)準(zhǔn)品中的脂肪酸出峰時(shí)間鑒定脂肪酸，根據(jù)峰面積，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算脂肪酸含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

所有樣品分析重復(fù)兩次，數(shù)據(jù)使用 SPSS Statistics 19.0（IBM，Armonk，NY）進(jìn)行處理。方差分析和 Duncan多重極差檢驗(yàn)差異顯著性（P＜0.05）。采用Pearson相關(guān)性分析和主成分分析法對油脂性狀相關(guān)性進(jìn)行分析。采用 Ward方法對18份不同地區(qū)的黍稷種質(zhì)進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 黍稷含油量

表1列出了18個(gè)黍稷種質(zhì)的籽粒含油量。含油量在2.54%～4.00%之間，平均3.71%（表2）。其中紅糜子（內(nèi)蒙古）含油量最低，小黑黍（山西）含油量最高（表1）。Osman等對五個(gè)大麥品種、六個(gè)高粱品種進(jìn)行含油量的研究，得出大麥籽粒的含油量在 1.90%～2.87%之間，高粱種子的含油量在 3.95%～5.63%[15]。Vázquez等對 6個(gè)不同基因型的玉米進(jìn)行研究，得出玉米種子的油的含量在 4.2%～6.8%之間[16]，Zhang等在研究了 7個(gè)品種的小米含油量后得出其粗脂肪含量在3.38%～6.49%之間[14]。Kitta等對9個(gè)品種的粳稻進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)粳稻的含油量在 2.76%～3.91%之間[17]。在對4 000多份燕麥材料研究后統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)燕麥的含油量從 3.1%到 11.6%不等，平均為7.0%[18]?？傮w來說，與其他谷類作物相比，黍稷的含油量通常高于大麥，低于玉米和燕麥，與水稻和谷子相似。

表1 本研究中使用的18個(gè)樣品的品種名、產(chǎn)地和含油量Table 1 Common name,geographical origin and oil content of 18 samples used in this study

2.2 脂肪酸組成

表2列出了18個(gè)黍稷品種的脂肪酸組成。共檢測到 10種主要脂肪酸：棕櫚酸（16:0）、棕櫚油酸（16:1n9）、硬脂酸（18:0）、油酸（18:1n9）、亞油酸（18:2n6）、亞麻酸（18:3n6）、花生烯酸（20:1n11）、二十二烷酸（22:0）和二十四烷酸（24:0），如圖 1。其中亞油酸（18:2n6）、油酸（18:1n9）和棕櫚酸（16:0）是黍稷油中含量最高的三種脂肪酸。這三種脂肪酸的范圍分別為0.075～5.19、0.150～3.02 和 0.897～1.81（g/100 g），平均值分別為1.61、1.18和1.39（g/100 g）。

黍稷油的脂肪酸組成與其他谷類作物相似。研究發(fā)現(xiàn)燕麥中含量最豐富的脂肪酸是亞油酸、油酸和棕櫚酸[19]，玉米油中的主要脂肪酸是油酸、亞油酸和棕櫚酸，糙米中的主要脂肪酸是棕櫚酸、亞油酸和油酸[20]。但是與其他谷類品種相比，黍稷油中不飽和脂肪酸（UFA）的比例更高。

在18個(gè)樣品中，不飽和脂肪酸（UFA）的含量在 82.1%～94.7%之間。飽和脂肪酸，包括硬脂酸、花生烯酸、二十二烷酸和二十四烷酸含量相對較低。在不飽和脂肪酸中，單不飽和脂肪酸（MUFA）的含量在 42.1%～75.6%之間，多不飽和脂肪酸（PUFA）的含量在10.5%～52.4%之間。其中不飽和脂肪酸（UFA）的含量以密穗紅（寧夏）最高，紅糜子（內(nèi)蒙古）最低。UFA是必需的脂肪酸，必須通過飲食攝入[21]。缺乏必需脂肪酸會(huì)導(dǎo)致一系列疾病，據(jù)報(bào)道，UFA對人體健康有許多益處。例如，亞油酸在細(xì)胞生理學(xué)、免疫和生殖方面發(fā)揮著重要作用[22]。多不飽和脂肪酸可以降低冠心病、老年癡呆癥、精神分裂癥和代謝綜合征的風(fēng)險(xiǎn)[23]。從本研究的數(shù)據(jù)來看，黍稷油中含有豐富的不飽和脂肪酸，表明食用黍稷油對人體健康有益。

如表3所示，每種脂肪酸在不同品種間差異顯著。亞油酸含量以青海白圪塔糜最高，白稷子（江蘇）最低。油酸含量以白圪塔糜（青海）最高，青隴黃黍（河北）最低。棕櫚酸含量以紅糜（陜西）最高，白稷子（江蘇）最低。本研究所揭示的黍稷脂肪酸濃度的廣泛變化，表明后續(xù)可以利用分子生物學(xué)的方法來闡明黍稷脂肪酸生物合成途徑。

表3 18個(gè)基因型黍稷的脂肪酸組成統(tǒng)計(jì)分析Table 3 Descriptive statistics of oil traits in 18 proso millet genotypes

2.3 脂肪酸相關(guān)性分析

如表4的相關(guān)分析表明，不同脂肪酸之間存在顯著的相互關(guān)系。在三種主要脂肪酸中，油酸與亞油酸（r=0.886，P＜0.000 1）和二十二烷酸的含量（r=0.764，P＜0.001）呈顯著相關(guān)。亞油酸與亞麻酸（r=0.771，P＜0.001）和二十二烷酸含量（r=0.904，P＜0.000 1）呈正相關(guān)。先前的研究也報(bào)道了燕麥、大米和谷子油中的亞油酸與亞麻酸含量顯著相關(guān)[24]。

表4 18個(gè)基因型黍稷的脂肪酸組成的相關(guān)分析Table 4 Correlation analysis of oil traits in 18 proso millet genotypes

對于其他脂肪酸，棕櫚油酸與亞麻酸（r=0.817，P＜0.000 1）和花生烯酸的含量（r=0.817，P＜0.000 1）呈正相關(guān)。硬脂酸與油酸（r=0.889，P＜0.000 1）、亞油酸（r=0.791，P＜0.000 1）和二十二烷酸的含量呈正相關(guān)（r=0.784，P＜0.001）。亞麻酸與二十二烷酸的含量呈正相關(guān)（r=0.908，P＜0.001），而與二十四烷酸的含量呈負(fù)相關(guān)（r=-0.861，P＜0.001）。二十二烷酸與二十四烷酸的含量呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.861，P＜0.000 1）。

此外，棕櫚酸與硬脂酸、亞麻酸、花生酸和二十二烷酸之間的相關(guān)性較弱。本研究揭示脂肪酸之間的相互關(guān)系對以改善油質(zhì)為目標(biāo)的黍稷育種計(jì)劃具有重要價(jià)值，因?yàn)楦鶕?jù)脂肪酸之間的相關(guān)性，提高一種脂肪酸的濃度可能導(dǎo)致另一種脂肪酸濃度的增加或降低。然而，正如淀粉研究中發(fā)現(xiàn)的那樣，相關(guān)性分析的結(jié)果可能因不同研究中使用的樣本而異[25-26]，因此，本研究中的黍稷油中脂肪酸之間的相關(guān)性有待后續(xù)研究驗(yàn)證。

2.4 主成分分析（PCA）

本研究利用spss2.0對18個(gè)黍稷的10種脂肪酸進(jìn)行主成分分析，以探討油脂性狀之間的關(guān)系。如表 5所示，前兩個(gè)主成分的累積貢獻(xiàn)率達(dá)到80.3%，基本包含了所有脂肪酸的信息。如表 6所示，第一主成分包含棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、亞麻酸和二十二碳酸，二十四碳酸。第二主成分包含棕櫚油酸、花生酸和花生烯酸，硬脂酸和油酸。

表5 黍稷脂肪酸的主成分分析Table 5 The principal component analysis of the fatty acids in proso millet

表6 黍稷脂肪酸主成分的成分矩陣Table 6 Component matrix of the fatty acids in proso millet

2.5 聚類分析

對原始變量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理后，對18個(gè)黍稷品種采用系統(tǒng)聚類分析法進(jìn)行分析。以歐式平方距離作為度量標(biāo)準(zhǔn)，聚類結(jié)果如圖2所示。

圖2 18種黍稷的脂肪酸組成的聚類圖Fig.2 Hierarchical clustering of 18 proso millet genotypes based on oil traits

如圖2所示，當(dāng)距離為5時(shí)，18個(gè)樣本可分為四類。螞蚱眼（遼寧）的棕櫚烯酸含量最高，被單獨(dú)分為一類。黍子（波蘭）、紅糜子（內(nèi)蒙古）、青隴黃黍（河北）、白稷子（江蘇）、小黑黍（山西）、紅鵪鶉尾（黑龍江）、790051（印度）歸為Ⅰ類。Ⅱ類包括白軟黍（山西）、黃糜子（遼寧）、黃黍子（內(nèi)蒙古）、紅糜（山西）組成。其余5個(gè)品種屬于Ⅲ類。當(dāng)距離為10時(shí)，分為三類，螞蚱眼（遼寧）仍然單獨(dú)一類，每一類都有相似的脂肪酸組成。聚類分析結(jié)果表明，18份材料可以通過脂肪酸組成譜進(jìn)行區(qū)分。

3 結(jié)論

本文研究了18個(gè)黍稷種質(zhì)的含油量、脂肪酸組成及其相互關(guān)系。總體來說，黍稷籽粒含油量高，不飽和脂肪酸比例高，屬于優(yōu)質(zhì)食用油。脂肪酸含量在品種間存在顯著差異，這表明利用分子生物學(xué)方法在黍稷中鑒定脂肪酸生物合成相關(guān)基因型具有良好的研究前景。綜上所述，對于后續(xù)研究，在探索黍稷在食用油開發(fā)中的潛在用途以及研究黍稷油脂性狀的遺傳基礎(chǔ)，本研究將提供一定的數(shù)據(jù)支撐。