姜 鵬，駱麗婷，李勝杰，樊佳佳，馬冬梅

(1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院 珠江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶亞熱帶水產(chǎn)資源利用與養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510380；2.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院 動(dòng)物科技學(xué)院，廣東 廣州 510225)

動(dòng)物脂肪組織不僅是機(jī)體能量貯存庫(kù)，也是活躍的內(nèi)分泌器官，其分泌的多種激素和細(xì)胞因子在機(jī)體代謝平衡、免疫應(yīng)答等方面發(fā)揮重要作用[1-3]。在組織功能研究中，分子水平研究必不可少，其中RNA提取純化是常涉及的分子生物學(xué)試驗(yàn)技術(shù)。然而，由于脂肪組織含有豐富油脂，RNA豐度低，導(dǎo)致高質(zhì)量總RNA提取常常存在一定難度，影響到下游試驗(yàn)的高效開(kāi)展。

目前，RNA提取廣泛采用經(jīng)典的酸性酚—異硫氰酸胍—氯仿一步提取法[4]。該方法具有操作便捷，無(wú)需復(fù)雜設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)，并配備有成熟的TRIzol等即用型商品化試劑[5-7]。因此，針對(duì)脂肪組織RNA含量低、難提取等問(wèn)題，大多數(shù)學(xué)者選擇在一步法基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化改良[8]。如吳江維等[9]發(fā)現(xiàn)，以豬脂肪組織為材料，增加樣品量，延長(zhǎng)靜置裂解時(shí)間，去除油脂層污染等操作，可改善RNA提取質(zhì)量。采用類似優(yōu)化步驟，在肉牛、綿羊等動(dòng)物脂肪組織也獲得了較高質(zhì)量的RNA樣品[10-11]。

草魚(yú)(Ctenopharyngodonidella)是中國(guó)養(yǎng)殖產(chǎn)量較高的淡水經(jīng)濟(jì)魚(yú)類，養(yǎng)殖過(guò)程中通常出現(xiàn)體脂過(guò)度沉積現(xiàn)象[12]。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，常規(guī)方法下，草魚(yú)脂肪組織RNA提取易發(fā)生降解，干擾到后續(xù)分子生物學(xué)試驗(yàn)的有序推進(jìn)。草魚(yú)脂肪組織主要蓄積在腹腔腸道周圍，與哺乳動(dòng)物脂肪組織相比，質(zhì)地構(gòu)造存在明顯差異?，F(xiàn)有的優(yōu)化改良策略是否適用于草魚(yú)脂肪組織RNA提取，需進(jìn)一步驗(yàn)證及摸索。因此，筆者以草魚(yú)腸系膜脂肪組織為試驗(yàn)對(duì)象，基于常規(guī)的TRIzol試劑一步法，擬通過(guò)對(duì)優(yōu)化操作步驟的比較分析，建立一種高質(zhì)量總RNA提取方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)用魚(yú)

試驗(yàn)用草魚(yú)取自中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所生物技術(shù)養(yǎng)殖基地。從正常飼養(yǎng)的群體中隨機(jī)挑選健康個(gè)體，體質(zhì)量為80～150 g。

1.2 試劑耗材與儀器

TRIzol試劑選用TaKaRa公司RNAiso Plus產(chǎn)品(Code No.9108)，DEPC水購(gòu)自Beyotime公司，氯仿和異丙醇等試劑為國(guó)產(chǎn)分析純，PRO 200型精密勻漿器(配置?7 mm×105 mm不銹鋼平頭轉(zhuǎn)子)購(gòu)自PRO Scientific公司(美國(guó))，高速冷凍離心機(jī)5417R購(gòu)自Eppendorf公司(德國(guó))，TGem微量分光光度計(jì)(OSE-260)購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司，Tanon-3500全自動(dòng)凝膠圖像分析系統(tǒng)購(gòu)自上海天能科技有限公司。離心管和移液槍頭等均使用RNase-free產(chǎn)品。

1.3 常規(guī)的RNA提取方法

草魚(yú)活體使用間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽輕微麻醉，剪斷脊柱放血后解剖，快速剪取肝臟、脾臟、腸道(不含腸系膜脂肪)、腸系膜脂肪組織，對(duì)應(yīng)樣品組編號(hào)為T1～T4(表1)。采用常規(guī)方法進(jìn)行組織RNA提取，每組測(cè)試3～5尾魚(yú)，具體操作步驟如下：

表1 常規(guī)與優(yōu)化的總RNA提取方法比較Tab.1 Comparison between conventional and optimized total RNA extraction methods (n=3～5)

取8～15 mg新鮮組織樣品放入預(yù)冷的1.0 mL TRIzol試劑中，迅速均質(zhì)勻漿約30 s，室溫靜置5 min；加入200 μL氯仿，劇烈振蕩15 s，室溫靜置5 min后，4 ℃，12 000 r/min離心15 min，小心吸取上層水相轉(zhuǎn)移至另一新離心管中；加入500 μL的異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置10 min后，4 ℃，12 000 r/min離心15 min；棄上清液，得到白色RNA沉淀物，加入1.3 mL DEPC水配制的75%體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液，翻轉(zhuǎn)洗脫，4 ℃，7500 r/min離心5 min；棄上清液，室溫干燥沉淀物約5 min，加入30～50 μL的DEPC處理水溶解RNA。質(zhì)檢后，-70 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 優(yōu)化的RNA提取方法

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，將草魚(yú)脂肪組織樣品量增加至約30 mg，每樣品TRIzol試劑量增至1.3 mL，并對(duì)常規(guī)RNA提取步驟進(jìn)行優(yōu)化(表1)，具體優(yōu)化操作如下：

(1)優(yōu)化操作1：取新鮮樣品至TRIzol試劑中機(jī)械勻漿30 s后，4 ℃，12 000 r/min離心5 min，吸棄上層油脂約150 μL，重復(fù)操作1次，將大部分余液移至新管，其余步驟與常規(guī)方法相同，對(duì)應(yīng)樣品組編號(hào)為T5。

(2)優(yōu)化操作2：取新鮮樣品至液氮急速冷凍，研缽內(nèi)人工充分研磨，然后將粉末狀樣品加入TRIzol試劑中劇烈振蕩30 s裂解，吸棄油脂等步驟與優(yōu)化操作1相同，對(duì)應(yīng)樣品組編號(hào)為T6。

(3)優(yōu)化操作3：與優(yōu)化操作1大體相同，只增加樣品機(jī)械勻漿時(shí)間至約3 min，對(duì)應(yīng)樣品組編號(hào)為T7。

(4)優(yōu)化操作4：取新鮮樣品至液氮速凍，再轉(zhuǎn)移凍樣至TRIzol試劑中機(jī)械勻漿約3 min，其余步驟與優(yōu)化操作1相同，對(duì)應(yīng)樣品組編號(hào)為T8。

以上每組(T5～T8)各取3～5尾魚(yú)測(cè)試。

1.5 RNA質(zhì)量檢測(cè)

取2.0 μL RNA樣品，利用微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA樣品濃度與純度。配制1.5%非變性瓊脂糖凝膠，取1.0～2.0 μL適量RNA，140 V電泳15 min，紫外燈光下觀察RNA條帶情況，評(píng)估提取質(zhì)量。

從提取質(zhì)量較好的T8組中，隨機(jī)取3個(gè)樣品送金唯智生物科技有限公司進(jìn)行高通量測(cè)序平臺(tái)質(zhì)檢，主要包括使用NanoDrop 2000分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度和質(zhì)量，以及Agilent 2200 Tapestation系統(tǒng)評(píng)估RNA完整性。

2 結(jié) 果

2.1 常規(guī)方法提取草魚(yú)不同組織RNA的質(zhì)量比較

采用常規(guī)方法提取的草魚(yú)不同組織RNA，質(zhì)量檢測(cè)情況見(jiàn)表2。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與肝臟、脾臟、腸道組織相比，草魚(yú)腸系膜脂肪組織總RNA的提取量偏少，表明草魚(yú)脂肪組織RNA含量較低。常規(guī)提取方法下，草魚(yú)肝臟、脾臟、腸道和腸系膜脂肪組織總RNA的D260/D280比值約為2.0，符合1.9～2.0的標(biāo)準(zhǔn)范圍，表明常規(guī)方法提取的不同組織核酸質(zhì)量均較高。樣品的D260/D230比值略小于2.0，說(shuō)明可能有微量胍鹽或有機(jī)溶劑等雜質(zhì)殘留，試驗(yàn)檢驗(yàn)其對(duì)下游分子試驗(yàn)影響輕微。

表2 分光光度計(jì)檢測(cè)的總RNA質(zhì)量情況Tab.2 Quality of total RNA content measured by spectrophotometer (n=3～5)

樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(圖1)。T1～T3組肝臟、脾臟、腸道組織樣品的總RNA在凝膠上顯示出清晰的28S和18S rRNA特征性條帶，T4組脂肪組織樣品則出現(xiàn)嚴(yán)重拖帶現(xiàn)象，28S rRNA條帶亮度也明顯弱于18S rRNA，說(shuō)明常規(guī)方法下提取的草魚(yú)脂肪組織RNA存在降解現(xiàn)象。以上不同組織間的對(duì)比試驗(yàn)表明，草魚(yú)腸系膜脂肪組織RNA不僅含量少，而且易發(fā)生降解。

圖1 總RNA瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 Agarose gel electrophoresis of total RNAM.DL2000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn).M.DL2000 DNA marker.

2.2 不同優(yōu)化操作提取草魚(yú)脂肪組織RNA的比較

在優(yōu)化操作中，適當(dāng)增加脂肪組織量(25～35 mg)，有助于RNA提取量提升，可滿足常規(guī)試驗(yàn)用量需求(T6組RNA質(zhì)量濃度略低，是因研缽里收集粉末狀樣品時(shí)有損耗)。針對(duì)草魚(yú)脂肪組織RNA頑固性降解難題，探索可行的優(yōu)化操作方法。分光光度計(jì)檢測(cè)顯示，4種優(yōu)化方法提取的草魚(yú)脂肪組織總RNA純度均保持了較高水平。進(jìn)一步瓊脂糖凝膠電泳(圖1)后發(fā)現(xiàn)，T5組樣品經(jīng)簡(jiǎn)單去除油脂層操作并未有效改善RNA降解問(wèn)題，而樣品前處理改用液氮速凍研磨方式，T6組樣品顯示RNA降解有所緩解，但仍有一定程度拖帶現(xiàn)象。當(dāng)T7組樣品僅增加了樣品機(jī)械勻漿時(shí)間時(shí)，RNA降解問(wèn)題得以顯著改善，尤其是將液氮速凍和增加樣品機(jī)械勻漿時(shí)間步驟一同使用，提取的T8組脂肪組織RNA展示出較高質(zhì)量的電泳條帶特征。

試驗(yàn)結(jié)果表明，在TRIzol試劑裂解過(guò)程中，增加樣品機(jī)械勻漿時(shí)間(約3 min)可顯著降低RNA降解程度，而且勻漿前樣品采用液氮速凍處理可減輕取樣操作可能帶來(lái)的降解問(wèn)題。

2.3 草魚(yú)脂肪組織優(yōu)化提取RNA的質(zhì)檢分析

為進(jìn)一步明確優(yōu)化操作4提取的樣品質(zhì)量，隨機(jī)挑選T8組3個(gè)樣品送測(cè)序公司進(jìn)行質(zhì)檢分析。檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3個(gè)樣品RNA純度較高，關(guān)鍵的RIN值為8.7～9.0(表3)，依據(jù)公司評(píng)級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，3個(gè)樣品均為最佳的A級(jí)(A級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：核酸質(zhì)量≥2 μg，D260/D280≥2.0，RIN值≥7，28S/18S≥1.0，核酸質(zhì)量濃度≥100 mg/L，體積≥10 μL，5S峰形正常等)，表明RNA完整性好，質(zhì)量滿足高通量轉(zhuǎn)錄組建庫(kù)測(cè)序要求。此外，由Agilent 2200生物分析儀生成的凝膠圖像及電泳色譜峰圖(圖2)可見(jiàn)，3個(gè)RNA樣品的質(zhì)量水平較高，其峰圖基線較平整，無(wú)明顯降解雜峰，28S與18S峰形正常。

表3 改良方法提取草魚(yú)腸系膜脂肪組織總RNA的質(zhì)量情況Tab.3 Quality of total RNA extracted from mesenteric adipose tissues of grass carp C.idella by the improved method

圖2 Agilent 2200生物分析儀評(píng)估總RNA完整性Fig.2 Integrity assessment of total RNA by the Agilent 2200 bioanalyzera.采用優(yōu)化操作4提取的總RNA樣品膠樣圖;b～d.分別為T8-1、T8-2和T8-3樣品的電泳圖譜;M.電子化分子量標(biāo)準(zhǔn);Lower.25 bp分子量.a.gel-like images of total RNA of the samples extracted by the optimized-4 method;b—d.electropherograms of T8-1,T8-2 and T8-3 samples,respectively;M.electronic ladder;Lower:25 bp ladder.

3 討 論

3.1 RNA提取方法及原理

自Chomczynski等[13]提出酸性酚—異硫氰酸胍—氯仿一步提取法，RNA提取才變得簡(jiǎn)便易行。該方法操作流程主要包括：樣品均質(zhì)與裂解，氯仿分離含RNA水相，異丙醇沉淀和乙醇洗滌。在提取過(guò)程中，想要獲得高質(zhì)量RNA需要嚴(yán)格防范內(nèi)源性和外源性RNA酶的破壞。RNA酶是一種專一水解RNA磷酸二酯鍵的蛋白酶，在環(huán)境中廣泛存在，而且可耐受高溫煮沸等嚴(yán)苛處理?xiàng)l件[14-15]。因此，為了避免外界環(huán)境中RNA酶的干擾，通常需要使用RNase-free耗材，維持清潔的試驗(yàn)環(huán)境以及科學(xué)規(guī)范的操作。除此之外，為了有效抑制樣品組織細(xì)胞所包含的內(nèi)源性RNA酶，則需要依賴裂解試劑中異硫氰酸胍等強(qiáng)效蛋白變性劑。

在本試驗(yàn)中，草魚(yú)腸系膜脂肪組織RNA降解問(wèn)題主要是源于常規(guī)提取方法未能有效阻止內(nèi)源性RNA酶的水解作用。初步分析，RNA降解可能發(fā)生在取樣起始階段，也可能在組織裂解過(guò)程中，或是二者兼有。為此，在樣品取樣階段嘗試采用液氮速凍人工研磨方法，期望利用超低溫環(huán)境來(lái)抑制組織內(nèi)RNA酶的活性，并盡可能縮短樣品空氣暴露時(shí)間。但多次實(shí)操發(fā)現(xiàn)，液氮速凍研磨操作對(duì)樣品RNA降解雖有一定緩解，但凝膠電泳仍顯示出不同程度拖帶現(xiàn)象，甚至?xí)r常出現(xiàn)嚴(yán)重降解個(gè)例，說(shuō)明RNA降解在組織裂解過(guò)程中也有發(fā)生。這意味著TRIzol試劑中的異硫氰酸胍等成分未能高效抑制腸系膜脂肪組織中的RNA酶。考慮到脂肪組織特異性因素，推測(cè)脂肪組織所包含的大量油脂很可能影響了蛋白變性劑發(fā)揮效能。

3.2 脂肪組織RNA提取方法的優(yōu)化

如何破除油脂影響，有學(xué)者利用液態(tài)油滴比重低的特點(diǎn)，采用簡(jiǎn)單離心去除油脂層方法[16]；也有學(xué)者通過(guò)調(diào)整試劑配方來(lái)強(qiáng)化脂肪乳化劑分離油脂的效果[17]。以上方法在草魚(yú)腸系膜脂肪中驗(yàn)證效果均不理想。基于上述實(shí)際情況，擬嘗試在裂解過(guò)程中加入劇烈振蕩等物理手段。經(jīng)反復(fù)摸索測(cè)試后發(fā)現(xiàn)，當(dāng)樣品采用機(jī)械勻漿，并將勻漿時(shí)間由原有約30 s延長(zhǎng)至約3 min時(shí)，RNA降解得以顯著改善，而且批量驗(yàn)證效果也較為穩(wěn)定。據(jù)此推測(cè)，長(zhǎng)時(shí)間機(jī)械勻漿所形成的持續(xù)剪切沖擊力或許有助于TRIzol試劑中的異硫氰酸胍等成分突破油滴阻礙而有效抑制內(nèi)源性RNA酶。

需要特別說(shuō)明的是，草魚(yú)腸系膜脂肪組織中實(shí)際包裹有難以分離的胰腺組織，這在石蠟切片和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(數(shù)據(jù)未展示)中得以證實(shí)。通常認(rèn)為，動(dòng)物的胰腺組織因富含RNA酶，RNA較難提取[18-19]，這也可能是造成草魚(yú)腸系膜脂肪組織RNA易發(fā)生降解的原因之一。有研究表明，小鼠胰腺組織樣品在液氮低溫環(huán)境中研磨處理，能有效避免RNA發(fā)生降解[20]。在本試驗(yàn)中，或許是由于油脂的復(fù)合疊加作用，導(dǎo)致單純采用液氮研磨未能較好抑制富含RNA酶的草魚(yú)腸系膜脂肪組織。

4 結(jié) 論

筆者建立了一種草魚(yú)腸系膜脂肪組織高質(zhì)量總RNA提取的方法，簡(jiǎn)要地說(shuō)，在常規(guī)方法基礎(chǔ)上，將取樣量增至約30 mg，有助于RNA產(chǎn)量提升以滿足常規(guī)試驗(yàn)需求；樣品前處理建議采用液氮速凍方式，并直接將凍樣放入TRIzol試劑中機(jī)械勻漿，勻漿時(shí)間需延長(zhǎng)至約3 min，可顯著降低RNA降解發(fā)生，同時(shí)保留離心去除油脂層等操作步驟。該改良方法所獲得的總RNA純度和完整性較高，可滿足轉(zhuǎn)錄組建庫(kù)測(cè)序等試驗(yàn)要求。