喉癌是臨床常見惡性腫瘤之一，隨著現(xiàn)代生活節(jié)奏的加快，喉癌發(fā)病率逐年升高，嚴重威脅人類生命安全，目前臨床采用手術切除聯(lián)合放化療等方法治療喉癌，但缺乏針對喉癌晚期病人的有效治療方法。因而尋找潛在靶點成為喉癌治療領域的重點研究問題。近年來，微小RNA（microRNA，miRNA）作為內(nèi)源性非編碼RNA分子，可通過調(diào)控下游靶基因表達而參與喉癌等多種腫瘤發(fā)生及發(fā)展過程，與miRNA相似，長鏈非編碼RNA（Long non-coding RNA，LncRNA）可通過調(diào)控基因轉錄及翻譯而參與細胞增殖、凋亡等過程。研究表明LncRNA SNHG16在結腸癌、乳腺癌、口腔鱗癌等多種腫瘤細胞中呈高表達，沉默SNHG16可抑制乳腺癌、口腔癌等腫瘤細胞遷移及侵襲。研究表明miR-7在喉癌中呈低表達，過表達miR-7可通過調(diào)控磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）信號通路而抑制腫瘤細胞遷移及侵襲。通過STARBASE軟件預測顯示miR-7-5p可能是SNHG16的靶基因，因此，本研究主要探討SNHG16與miR-7-5p的靶向調(diào)控關系及其對喉癌細胞增殖、遷移及侵襲的影響，為喉癌基因治療奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 病例資料與實驗細胞

選取2016年1月至2016年12月重慶醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院收治的25例喉癌病人為研究對象，所有病人均經(jīng)病理證實為喉鱗狀細胞癌，其中男15例，女10例，年齡（67.32±5.62）歲，范圍為50～72歲。所有病人術前均未接受放療或化療等治療。所有病人均進行隨訪（隨訪截止日期為2019年6月），并統(tǒng)計總體生存期（OS），根據(jù)SNHG16、miR-7-5p表達水平分為SNHG16高表達組（18例）、低表達組（7例）與miR-7-5p高表達組（5例）、低表達組（20例），SNHG16高表達組病人生存率（33.33%）顯著低于低表達組（71.43%）（

P

＜0.05）；miR-7-5p高表達組病人生存率（60.00%）顯著高于低表達組（35.00%）（

P

＜0.05）。本研究符合《世界醫(yī)學協(xié)會赫爾辛基宣言》相關要求，所有病人知情且簽署同意書。所有病人均接受手術治療，于術中切取喉癌組織及其相應癌旁組織，放入液氮中保存，術后將組織標本轉移至-80℃超低溫冰箱內(nèi)保存。喉癌Hep-2細胞購自上海通派生物科技有限公司，Hep-2細胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清及青霉素-鏈霉素混合溶液的DMEM完全培養(yǎng)基，置于37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待細胞生長密度達到60%～70%時進行傳代培養(yǎng)。

1.2 材料

轉染試劑Lipofectamine2000購自美國Thermo Fisher公司；SNHG16小干擾RNA（si-SNHG16）、miR-7-5p抑制劑（anti-miR-7-5p）及其各自陰性對照均購自上海吉瑪；雙熒光素酶活性檢測試劑盒購自上海翊圣生物；熒光素酶報告基因載體購自美國Promega；3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）購自美國Sigma；Transwell小室與Mgteigel基質(zhì)膠購自美國BD；Trizol、反轉錄及實時熒光定量PCR（qRT-PCR）試劑盒均購自大連寶生物工程有限公司；細胞周期蛋白D1（cyclin D1）、P21、基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）、上皮鈣黏素（E-cadherin）抗體購自美國CST；二抗購自北京中杉金橋生物。

1.3 方法

1.3.1

細胞轉染及實驗分組 收集對數(shù)生長期喉癌Hep-2細胞，0.25%胰蛋白酶消化，制備細胞懸浮液，以每孔3×10/mL的密度接種至6孔板，放入37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細胞生長匯合達到50%時進行轉染，轉染前更換為Opti-MEM減血清培養(yǎng)基，喉癌Hep-2細胞按照隨機數(shù)字表法分為四組：si-NC組（轉染無意義干擾序列si-NC）、si-SNHG16組（轉染si-SNHG16）、si-SNHG16+anti-miR-NC組（共轉染si-SNHG16與anti-miR-NC）、si-SNHG16+anti-miR-7-5p組（共轉染si-SNHG16與anti-miR-7-5p），轉染6 h，更換為含有10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集轉染成功的細胞進行功能驗證。

1.3.2

qRT-PCR檢測細胞中SNHG16、miR-7-5p表達水平 取凍存喉癌及癌旁組織，液氮中研磨，同時收集各組喉癌Hep-2細胞，加入細胞裂解液裂解細胞，分別加入Trizol試劑，依次分別加入200μL氯仿、500μL異丙醇，4℃，12 000 r/min轉速離心15 min，提取組織或細胞總RNA，參照反轉錄試劑盒將總RNA反轉錄合成互補DNA（cDNA），以cDNA為模板進行qRT-PCR反應，用2法計算SNHG16、miR-7-5p相對表達量。

1.3.3

四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色法（MTT法）檢測細胞增殖 收集對數(shù)生長期喉癌Hep-2細胞按照100微升/孔接種于96孔板，分別在培養(yǎng)24 h、48 h、72 h時加入MTT溶液（20微升/孔），繼續(xù)培養(yǎng)4 h，每孔分別加入150μL二甲基亞砜（DMSO），振蕩混勻后應用酶標儀檢測490 nm波長處各孔吸光度。每組設置3個復孔，實驗設置3次重復。

1.3.4

Transwell實驗檢測細胞遷移及侵襲 細胞侵襲：取100μLMatrigel基質(zhì)膠稀釋液鋪于內(nèi)室，Hep-2細胞（2×10/mL）200μL細胞懸液接種于上室，取500μL含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液加入下室，24 h后多聚甲醛固定15 min，結晶紫溶液染色5 min，顯微鏡下隨機選取10個視野觀察侵襲細胞數(shù)。細胞遷移：無須加入Matrigel基質(zhì)膠稀釋液，后續(xù)實驗步驟同侵襲實驗。

1.3.5

熒光素酶報告基因檢測SNHG16、miR-7-5p靶向關系 STARBASE軟件預測SNHG16可能結合靶基因，預測結果顯示miR-7-5p與SNHG16的3"非翻譯區(qū)（UTR）存在結合位點，構建SNHG16-3"UTR野生型及其突變型熒光素酶報告載體（WT-SNHG16、MUT-SNHG16），WT-SNHG16、MUT-SNHG16分別與miR-7-5p mimics、miR-NC共轉染至喉癌Hep-2細胞，參照熒光素酶活性檢測試劑盒測定細胞相對熒光素酶活性。

1.3.6

蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）檢測cyclin D1、P21、MMP-2、E-cadherin蛋白表達 提取喉癌Hep-2細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，蛋白變性，取30μg蛋白上樣，經(jīng)SDS-PAGE電泳分離蛋白，轉膜，封閉1 h，加入蛋白一抗（1∶1 000），4℃孵育過夜，TBAT洗滌，加入二抗（1∶2 000），TBST洗滌，ECL顯色，曝光，應用Quantityone軟件檢測條帶灰度值。

2 結果

2.1 SNHG16、miR

-

7

-

5p在喉癌組織及癌旁組織中的表達

qRT-PCR檢測結果顯示，相對于癌旁組織，喉癌組織中SNHG16的表達水平升高，miR-7-5p的表達水平降低（

P

＜0.05），見表1。

表1 長鏈非編碼RNA SNHG16、miR-7-5p在喉癌組織及癌旁組織中表達/±s

2.2 抑制SNHG16對喉癌細胞Hep

-

2增殖的影響

喉癌Hep-2細胞中抑制SNHG16表達后，相對于si-NC組，細胞中SNHG16表達水平降低（

P

＜0.05），提示轉染成功。與si-NC組相比，si-SNHG16組細胞增殖能力降低，cyclin D1蛋白表達水平降低，而P21蛋白表達水平升高（

P

＜0.05）。見圖1、表2。

圖1 抑制SNHG16對喉癌細胞Hep-2增殖蛋白表達的影響

2.3 抑制SNHG16對喉癌細胞Hep

-

2遷移、侵襲的影響

相對于si-NC組，si-SNHG16組喉癌Hep-2細胞遷移及侵襲細胞數(shù)減少（

P

＜0.05）；與si-NC組相比，si-SNHG16組喉癌Hep-2細胞中MMP-2蛋白表達水平降低，而E-cadherin蛋白表達水平升高（

P

＜0.05），見圖2、表3。

圖2 抑制長鏈非編碼RNA SNHG16對喉癌細胞Hep-2遷移、侵襲蛋白表達的影響

表3 抑制長鏈非編碼RNA SNHG16對喉癌細胞Hep-2遷移、侵襲的影響/±s

表2 抑制長鏈非編碼RNA SNHG16對喉癌細胞Hep-2增殖的影響/±s

2.4 SNHG16靶向、調(diào)控miR

-

7

-

5p的表達

STARBASE軟件預測SNHG16可能調(diào)控的miRNA，預測結果顯示miR-7-5p可能是SNHG16的靶基因，見圖3。雙熒光素酶報告實驗結果顯示，相對于WT-SNHG16、miR-NC共轉染組，WT-SNHG16、miR-7-5p mimics共轉染組細胞熒光素酶活性降低（

P

＜0.05）；與MUT-SNHG16、miR-NC共轉染組相比，MUT-SNHG16、miR-7-5p mimics共轉染組細胞熒光素酶活性差異無統(tǒng)計學意義（

P

＞0.05），見表4。qRT-PCR檢測結果顯示，與pcDNA3.1組相比，pcDNA3.1-SNHG16組細胞中miR-7-5p表達水平降低［（0.18±0.02）比（0.04±0.01）］（

P

＜0.05）；與si-NC組相比，si-SNHG16組細胞中miR-7-5p表達水平升高［（0.19±0.02）比（0.53±0.05）］（

P

＜0.05）（

F

=306.118，

P

＜0.001）。

圖3 STARBASE軟件預測長鏈非編碼RNA SNHG16可能結合的靶基因——miR-7-5p

表4 雙熒光素酶報告實驗檢測長鏈非編碼RNA SNHG16與miR-7-5p靶向關系/±s

2.5 抑制miR

-

7

-

5p表達能逆轉抑制SNHG16對喉癌細胞Hep

-

2增殖、遷移、侵襲的影響

為探究SNHG16是否可通過調(diào)控miR-7-5p而參與喉癌Hep-2細胞增殖、遷移及侵襲過程，結果顯示，與si-SNHG16+anti-miR-NC組相比，si-SNHG16+anti-miR-7-5p組喉癌Hep-2細胞中miR-7-5p表達水平降低（

P

＜0.05），進一步研究顯示，喉癌Hep-2細胞中共轉染si-SNHG16與anti-miR-7-5p后，相較于si-SNHG16+anti-miR-NC組，細胞增殖能力顯著升高，遷移及侵襲細胞數(shù)增加（

P

＜0.05），cyclin D1、MMP-2蛋白表達水平升高，而P21、E-cadherin蛋白表達水平降低（

P

＜0.05），見圖4、表5，表6。

圖4 抑制miR-7-5p表達能逆轉抑制長鏈非編碼RNA SNHG16對喉癌細胞Hep-2增殖、遷移、侵襲蛋白表達的影響

3 討論

部分LncRNA可作為喉癌早期診斷及評估病人預后的分子標志物，LncRNA還可能作為腫瘤治療新靶點。研究表明LncRNA、miRNA異常表達與喉癌細胞增殖、凋亡、遷移及侵襲等生物學行為密切相關。因此本研究通過RNA干擾技術靶向抑制喉癌細胞中SNHG16的表達，檢測細胞增殖、遷移及侵襲能力的改變，為揭示SNHG16在喉癌發(fā)生及發(fā)展中的作用機制提供理論基礎。

SNHG16在胃癌組織中呈高表達，其高表達量與病人臨床病理特征及預后不良密切相關，進一步研究發(fā)現(xiàn)敲低SNHG16表達后，喉癌細胞周期阻滯于G1期，抑制細胞生長。研究表明SNHG16可作為致癌基因，通過競爭性吸附miR-216-5p而調(diào)節(jié)miR-216-5p/ZEB1信號軸進而促進宮頸癌進展。與上述研究結果相似，本研究結果表明SNHG16在喉癌組織中的表達水平明顯升高，喉癌細胞中抑制SNHG16表達后，細胞增殖、遷移及侵襲能力明顯降低，說明抑制SNHG16表達可減緩喉癌發(fā)展進程。提示SNHG16表達水平升高可能與病人生存期及不良預后密切相關。研究表明細胞過度增殖與細胞周期失控密切相關，細胞周期時間順序為G1期、S期、G2期、M期，細胞周期相關蛋白可調(diào)控細胞周期進程，cyclin D1屬于原癌基因，可與周期蛋白依賴性激酶（CDK4）結合形成復合物而促使細胞周期從G0/G1期進入S期，P21可抑制cyclin D1與CDK4結合從而抑制細胞周期進程。本研究結果顯示抑制SNHG16表達后，喉癌細胞中cyclin D1表達量降低，P21表達量升高，提示抑制SNHG16表達可通過下調(diào)cyclin D1表達及上調(diào)P21表達進而抑制喉癌細胞增殖。上皮-間質(zhì)轉化（EMT）可促進腫瘤細胞遷移及侵襲，E-cadherin是細胞上皮標志物，E-cadherin表達下調(diào)表明細胞發(fā)生EMT進而增強其遷移及侵襲能力，同時MMP-2等基質(zhì)金屬蛋白酶與細胞遷移及侵襲密切相關。本研究結果顯示，抑制SNHG16表達后，喉癌細胞中MMP-2表達水平降低，Ecadherin表達水平升高，說明抑制SNHG16可通過下調(diào)MMP-2表達及上調(diào)E-cadherin表達而抑制喉癌細胞遷移及侵襲。提示SNHG16可能作為喉癌基因治療的潛在靶點。

表5 抑制miR-7-5p表達能逆轉抑制長鏈非編碼RNA SNHG16對喉癌細胞Hep-2增殖的影響/±s

表6 抑制miR-7-5p表達能逆轉抑制長鏈非編碼RNA SNHG16對喉癌細胞Hep-2遷移、侵襲的影響/±s

miR-7-5p在乳腺癌細胞中呈低表達，miR-7-5p過表達可通過靶向EGFR而抑制乳腺癌細胞增殖及侵襲能力。miR-7-5p還可抑制膀胱癌發(fā)生及發(fā)展進程。LncRNA ZFAS1通過靶向miR-7-5p而調(diào)控結直腸癌細胞增殖、遷移、侵襲及凋亡過程。本研究結果表明miR-7-5p在喉癌組織中呈低表達，說明miR-7-5p表達降低可能促進喉癌發(fā)生。提示miR-7-5p表達水平降低可能與病人生存期及不良預后密切相關。為進一步揭示SNHG16在喉癌中的潛在作用機制，雙熒光素酶報告實驗與qRT-PCR實驗證實SNHG16可負向調(diào)控下游靶基因miR-7-5p的表達，同時本研究結果表明抑制miR-7-5p表達可逆轉抑制SNHG16對喉癌細胞增殖、遷移、侵襲的抑制作用。提示抑制SNHG16表達可通過上調(diào)miR-7-5p表達而降低喉癌細胞增殖、遷移及侵襲能力。

綜上所述，喉癌組織中SNHG16呈高表達，而miR-7-5p呈低表達，抑制SNHG16可促進miR-7-5p表達，抑制喉癌細胞增殖、遷移及侵襲，為SNHG16與miR-7-5p確定相互作用位點奠定理論基礎，可為喉癌基因治療提供潛在靶點。但SNHG16在喉癌中的作用是由多種因素共同作用引起的，本研究僅通過體外細胞實驗進行初步分析，而體內(nèi)作用及其相關作用機制仍需深入研究。