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        異丙酚抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激減輕脂多糖誘導人肝細胞損傷的機制研究

        2021-03-24 13:33:46宋云飛
        安徽醫(yī)藥 2021年3期
        關(guān)鍵詞:異丙酚存活肝細胞

        肝臟是一種新陳代謝器官,不斷向機體提供營養(yǎng),并消除體內(nèi)廢物和有毒有害物質(zhì)。肝臟也是一個具有復雜免疫活性的部位,可產(chǎn)生具有調(diào)節(jié)免疫功能的細胞因子,清除侵入者使機體內(nèi)環(huán)境恢復平衡。然而,不能被消除的入侵者或未被控制的炎癥反應會導致肝臟的慢性感染,出現(xiàn)肝纖維化、肝細胞功能障礙和脂肪變性等病理性改變。許多研究表明,內(nèi)毒素中的脂多糖(LPS)成分可通過多種有害途徑引起肝細胞損傷。隨著對內(nèi)毒素研究的加深,如何發(fā)掘保肝藥物,緩解肝細胞損傷顯得尤為重要。

        異丙酚是臨床上用于靜脈全麻常用藥物之一,具有醒腦快、持續(xù)輸注、無蓄積等優(yōu)點。近年來,研究發(fā)現(xiàn)異丙酚對腎臟、肝臟等器官具有較好的保護作用。Wei等報道異丙酚對肝缺血再灌注損傷的保護作用。然而,異丙酚是否對LPS所致肝損傷有保護作用尚不清楚。所以本實驗用20 mg/L的LPS誘導L-02細胞損傷,觀測不同劑量異丙酚(PPF)對其保護作用,為臨床上治療感染性休克提供一定的基礎(chǔ)理論和依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 試劑

        異丙酚(貨號D126608)購自Sigma公司;LPS購自Sigma公司,用滅菌水配成2g/L母液備用;RPMI Medium 1640培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)購自Gibco公司;青-鏈霉素(penicillin-strepotomycin,P/S)購自Thermo公司;MTT、人丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒、人天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)ELISA試劑盒購自酶免公司;白細胞介素(IL)-1β、IL-6和腫瘤壞死因子α(TNFα)引物由金斯瑞生物科技有限公司合成;Hifair?Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit和Hieff?qPCR SYBR? Green Master Mix購自上海翊圣生物科技有限公司;BCA蛋白濃度測定試劑盒和SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5X)購自碧云天生物技術(shù)研究所;兔抗核因子-κB(NF-κB)p65、NF-κB、p-肌醇依賴酶1α(IRE1α)、IRE1α、激活轉(zhuǎn)錄因子6(ATF-6)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)一抗購自Cell Signaling Technology公司,HRP標記二抗購自Santa Cruz Biotechnology公司。

        1.2 儀器

        倒置熒光顯微鏡(德國徠卡);DFC500照相系統(tǒng)(德國萊卡);多功能酶標儀(南京德鐵);二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo公司);超低溫冰箱(青島海爾);蛋白質(zhì)印跡法(Western blotting)電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀(Bio-Rad)。

        1.3 L

        -

        02細胞的培養(yǎng)

        將L-02細胞(人正常肝細胞系,遼寧中醫(yī)藥大學藥學院饋贈)培養(yǎng)于含有10% FBS和1% P/S的RPMI 1640培養(yǎng)基中,含有5%二氧化碳-95%空氣的37℃的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng),取生長期的細胞以5×10/mL的密度接種于經(jīng)多聚賴氨酸包被的96孔板中,每孔100μL。

        1.4 LPS誘導L

        -

        02細胞損傷模型的制備

        將細胞按隨機數(shù)字表法分為0(正常組)、5、10、15、20、25 mg/L的LPS組,每組6個復孔,待細胞長到80%以上時,加入不同濃度的LPS,置于含有5%二氧化碳-95%空氣的37℃的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)6、12、24、48 h,四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色法(MTT法)檢測各組細胞的存活情況,確定損傷模型。

        1.5 PPF給藥處理及分組

        將細胞分為正常組、LPS模型組(LPS)、LPS+25和50μmol/L PPF給藥組以及LPS+4 mmol/L 4-苯基丁酸(PBA)的陽性藥組,每組6個復孔,觀察PPF對LPS致肝細胞損傷的保護情況。

        1.6 MTT法檢測細胞存活能力

        收集經(jīng)過處理的接種于96孔培養(yǎng)板中各組細胞的培養(yǎng)基后,每孔加入終濃度為0.5 g/L的MTT溶液,置于含有5%二氧化碳-95%空氣的37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4 h后棄掉培養(yǎng)液,加入150μL二甲基亞砜(DMSO)溶液在搖床上慢搖直至藍紫色甲瓚完全溶解,然后用多功能酶標儀在492 nm處測定各組細胞的吸光度。

        1.7 ELISA法檢測細胞上清中ALT和AST含量

        按照ELISA試劑盒說明書所示方法檢測上步收集的各組細胞上清液中ALT和AST的表達,根據(jù)標準曲線計算各組的ALT和AST的蛋白濃度。

        1.8 qRT

        -

        PCR檢測各組細胞中IL

        -

        1

        β

        、IL

        -

        6和TNF

        mRNA水平

        按Trizol法取各組細胞的總RNA,按照Hifair?Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit所示步驟將RNA反轉(zhuǎn)成cDNA。根據(jù)Hieff?qPCR SYBR? Green Master Mix(Low Rox Plus)所示比例構(gòu)建qPCR反應。反應條件:95℃預變性0.5 min,95℃變性5 s,55℃退火0.5 min,共持續(xù)40個循環(huán),引物序列如表1。IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA在各組細胞中的相對表達水平結(jié)果用2表示。

        1.9 Western blotting檢測各組細胞中NF

        B p65、NF

        B、p

        -

        IRE1

        α

        、IRE1

        α

        和ATF

        -

        6蛋白水平

        取培養(yǎng)于培養(yǎng)瓶中的各組細胞,分別加入各種蛋白酶抑制劑,用細胞刮刮下細胞收集起來;4℃,12 000 r/min離心15 min,取上清于1.5 mL離心管中等待定量。采用BCA法測定蛋白濃度后,各組取30μg蛋白煮沸變性后進行SDS-PAGE凝膠電泳,320 mA恒流轉(zhuǎn)膜1.5 h,5%脫脂奶粉封閉液封閉1 h,TBST洗膜3次,每次5 min,按1∶1 000比例加入NF-κB p65、NF-κB、p-IRE1α、IRE1α、ATF-6和GAPDH抗體稀釋液,TBST洗膜3次,每次5 min,1∶1 000比例加入HRP標記二抗,室溫孵育1 h。ECL發(fā)光試劑盒發(fā)光,凝膠成像系統(tǒng)成像,Image J軟件計算灰度值,采用目的條帶與內(nèi)參蛋白條帶光密度比值作為結(jié)果進行統(tǒng)計分析。

        表1 PCR相關(guān)序列

        2 結(jié)果

        2.1 不同濃度LPS對人肝細胞存活能力的影響

        由圖1可知,在LPS處理0 h時,通過MTT法檢測各組人正常肝細胞的存活能力,發(fā)現(xiàn)各組細胞存活能力與正常組(0 mg/L LPS)之間差異無統(tǒng)計學意義(

        P

        >0.05),說明各組細胞在處理前狀態(tài)一致,保證實驗準確性;而LPS對肝細胞活力的影響具有劑量以及時間依賴性(見圖1),LPS作用24 h在濃度范圍內(nèi)接近線性變化并且劑量為20 mg/L的細胞(存活率為50.74%)處于亞健康狀態(tài),因此選擇20 mg/L LPS作用24 h作為致肝損傷模型劑量。

        圖1 MTT法比較不同濃度LPS對各組肝細胞的存活率影響

        2.2 PPF改善損傷肝細胞的形態(tài)

        如圖2所示,正常組肝細胞貼壁較好,結(jié)構(gòu)完整,折光性較強,細胞形態(tài)比較清晰;LPS組細胞胞體大部分皺縮成圓球狀,貼壁性不好容易脫落,鏡下可見部分細胞漂浮于培養(yǎng)基中;而給予低高濃度的PPF組和PBA陽性藥組細胞狀態(tài)較LPS組有所改善,貼壁較好,細胞胞體大都成紡錘體或梭形,數(shù)目明顯增多。

        2.3 PPF提高損傷肝細胞的存活能力

        與正常組(100±9.30)%相比,LPS組肝細胞存活率顯著降低為(54.26±7.77)%(

        P

        <0.01);而給予低高濃度的PPF和PBA的細胞存活能力顯著上升[LPS+25μmol/L PPF:(66.86±4.31)%,LPS+50μmol/L PPF:(84.71±7.30)%,LPS+4 mmol/L PBA:(83.74±7.48)%](

        P

        <0.05),

        F

        =34.125,

        P

        <0.001。

        2.4 PPF降低損傷肝細胞中AST和ALT的含量

        表2 結(jié)果顯示,LPS組細胞上清液中AST和ALT濃度與正常組相比,差異有統(tǒng)計學意義(

        P

        <0.01);在孵育了低高濃度PPF和PBA后的細胞上清液中AST和ALT濃度顯著降低,與LPS組相比差異有統(tǒng)計學意義(

        P

        <0.01)。

        2.5 PPF降低損傷肝細胞中IL

        -

        1

        β

        、IL

        -

        6和TNF

        mRNA的表達

        如表3所示,與正常組比較,LPS組細胞中IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA的表達明顯上升(

        P

        <0.01);與LPS組相比,給予低高濃度PPF組和PBA組細胞中IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA的表達降低(

        P

        <0.01)。

        2.6 PPF降低損傷肝細胞中NF

        B蛋白的磷酸化

        如圖3所示,LPS組NF-κB p65蛋白水平較正常組相比顯著性升高[(3.16±0.42)比(1.00±0.16),

        P

        <0.01];而給予了低高濃度PPF組和PBA組的細胞中NF-κB p65蛋白水平明顯降低至(2.50±0.38),(1.81±0.20)和(1.84±0.17)(

        P

        <0.01),且不同組間均數(shù)比較,

        F

        =47.267,

        P

        <0.001。

        圖2 光鏡下各組人肝細胞的形態(tài)(×100)

        表2 各組L-02細胞中ALT和AST濃度/(mg/L,±s)

        表3 各組細胞中相關(guān)炎性因子的mRNA表達/±s

        圖3 比較各組L-02細胞中核因子-κB(NF-κB)磷酸化蛋白水平的表達

        2.7 PPF降低損傷肝細胞中ATF

        -

        6和p

        -

        IRE1

        α

        蛋白的表達

        表4和圖4結(jié)果顯示,與正常組相比,LPS組ATF-6和p-IRE1α表達量明顯增加(

        P

        <0.01);低高濃度PPF和PBA組能降低ATF-6和p-IRE1α的表達,差異有統(tǒng)計學意義(

        P

        <0.01)。

        3 討論

        機體發(fā)生嚴重感染,尤其是革蘭陰性菌感染時極易引起感染性休克。機體中的致病微生物及其毒產(chǎn)物等進入血液循環(huán)系統(tǒng)后,首先激活宿主的免疫細胞,釋放各種細胞因子,隨后損傷機體重要器官如肝臟,導致肝細胞缺血缺氧、代謝紊亂、功能障礙,甚至肝功能衰竭。LPS是存在于革蘭陰性菌細胞壁中的主要成分之一,當細菌裂解或死亡時,LPS才會從細胞中釋放出來,發(fā)揮對宿主的毒性作用。內(nèi)毒素血癥是肝功能衰竭發(fā)生的外源性物質(zhì)基礎(chǔ),我們選用LPS誘導L-02人正常肝細胞損傷,體外模擬感染性休克對肝細胞的損傷。結(jié)果表明,LPS會導致L-02人正常肝細胞形態(tài)變差,核固縮,存活能力明顯下降;而給予不同濃度的PPF對LPS致人肝細胞形態(tài)有一定的改善作用;顯著提高損傷肝細胞的存活能力,且呈濃度依賴性,說明PPF對受損的肝細胞具有保護作用。ALT和AST是臨床上最常用的肝功能檢測指標之一,有研究表明,肝細胞損傷時,ALT和AST表達明顯升高,其表達水平與肝細胞受損的程度呈正相關(guān)。為了確定PPF是否對受損的肝細胞具有保護作用,我們采用ELISA試劑盒檢測各組細胞培養(yǎng)液中AST和ALT的濃度。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)LPS組肝細胞中ALT和AST表達顯著升高,說明模型的成功建立;而給予不同濃度的PPF后降低了ALT和AST的含量。

        表4 各組細胞中ATF-6和p-IRE1α蛋白的表達/±s

        圖4 蛋白質(zhì)印跡法檢測各組L-02細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關(guān)蛋白的表達

        越來越多的證據(jù)表明,肝臟調(diào)節(jié)免疫反應與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和炎癥有關(guān)。誘發(fā)炎癥的病原體相關(guān)分子和損傷相關(guān)分子會激活所謂的“急性期反應”,主要是由IL-6、轉(zhuǎn)錄激活因子3、促炎細胞因子IL-1β和腫瘤壞死因子α(TNF-α)介導的早期全身反應。急性期反應的靶點肝細胞通過產(chǎn)生急性期蛋白,使代謝和分泌蛋白的儲備適應變化的需求。急性期蛋白可迅速誘發(fā)機體產(chǎn)生以防御為主的非特異性反應,清除入侵機體的病原體或損傷的組織,同時激活抗炎和肝臟免疫調(diào)節(jié)機制。但是,未能被清除的病原體或損傷的組織及炎癥進一步發(fā)展,則可導致肝臟慢性感染、自身免疫反應及惡性腫瘤的發(fā)生。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)與正常組相比,LPS組人肝細胞中的IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA的表達顯著升高。說明LPS可能通過炎性因子釋放來損傷肝細胞,而給予不同劑量的PPF后的人肝細胞與LPS組相比,IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA水平的表達顯著降低。說明PPF可以通過抑制炎性因子的釋放來發(fā)揮對受損肝細胞的保護作用。

        有證據(jù)表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激與炎癥反應的誘導直接相關(guān)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)是蛋白質(zhì)折疊修飾組裝以及細胞內(nèi)鈣貯存的場所,約1/3新合成的蛋白被轉(zhuǎn)運到ER內(nèi)并折疊成正確的三維結(jié)構(gòu),然后運輸?shù)竭_目的地。當?shù)鞍装l(fā)生不正確的加工或修飾時,將會引起ER平衡失調(diào),從而導致ER應激。早期的ER應激通過激活非折疊蛋白反應(UPR)減輕ER內(nèi)壓力,而長期嚴重的ER應激則導致細胞凋亡或死亡。NF-κB是一類轉(zhuǎn)錄因子蛋白家族,參與多種炎癥基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控,在炎癥反應中發(fā)揮重要作用。靜息狀態(tài)下,NF-κB與NF-κB抑制蛋白(IκB)形成復合物,以無活性形式存在于胞質(zhì)中。當細胞受多種外界因素(包括應激性損傷細菌脂多糖病毒氧自由基和細胞因子)刺激后,IκB激酶復合物(IKK)被激活并磷酸化IκB,使NF-κB游離并暴露核定位位點,游離的NF-κB迅速移位到細胞核,與NF-κB反應基因啟動子區(qū)域的特異性序列結(jié)合,參與炎癥反應基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。目前研究發(fā)現(xiàn)UPR的3條信號通路,即PERK、IRE1α和ATF-6均能激活NF-κB。本研究發(fā)現(xiàn)LPS組細胞NF-κB p65、p-IRE1α/IRE1α和ATF-6的表達較正常組明顯升高,低高劑量PPF治療后NF-κB p65、p-IRE1α/IRE1α和ATF-6增強的作用被抑制。為了進一步證實PPF對LPS損傷的肝細胞的治療效果,我們采用了ER-stress的抑制劑PBA作為陽性對照,結(jié)果發(fā)現(xiàn)高劑量PPF與PBA的治療效果相當。

        綜上所述,PPF有助于緩解LPS誘導的人肝細胞損害反應,抑制炎性因子的釋放,發(fā)揮肝保護作用。其機制可能與PPF減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激,抑制炎癥通路NF-κB的活化,維持體內(nèi)細胞所處的微環(huán)境穩(wěn)定有關(guān),但具體的作用機制尚需進一步研究。

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