張浩然，魏晶晶，王慧春

(青海師范大學 生命科學學院，青海省青藏高原藥用動植物資源重點實驗室，西寧 810008)

猴頭菇(Hericiumerinaceus(Bull.) Pers.)是一種珍貴的真菌，又名猴頭菌、猴頭蘑、刺猬菌，屬于擔子菌門，傘菌綱，多孔菌目，齒菌科，猴頭菌屬。猴頭菇兼有藥用與食用的價值，中醫(yī)認為其性平、味甘，可治療消化不良、胃脹、胃痛和神經衰弱等癥狀；現代醫(yī)學認為猴頭菇具有降血糖、降血脂、降血壓、抗腫瘤、抗衰老、抗輻射等功效，有安全性高、毒副作用小的特點[1-2]。在食用方面，因其鮮嫩香醇的口感，歷來便有“山珍猴頭、海味燕窩”的說法[3]，早在明清時便作為皇室貢品，是我國傳統(tǒng)名貴食材[4]。由于猴頭菇人工種植技術的推廣，猴頭菇進入了尋常百姓家。目前市場上的猴頭菇多制成干品出售，近年以猴頭菇為原料的保健食品也出現在公眾視野中，譬如猴頭菇飲料、猴頭菇餅干、猴頭菇素肉干等[5]。

猴頭菇的主要活性成分是多糖，也是目前研究最多的活性物質之一[6-7]。傳統(tǒng)的多糖提取主要采用熱

水回流浸提法[8]，該方法耗時長、浸提劑用量大且效率不高(提取率<4.5%)[9]。近年來，超聲提取植物有效成分技術逐漸興起[10-11]。該技術是應用超聲波強烈的“空穴作用”與機械效應，通過提高細胞內容物的透過性來提取植物有效成分，是一種物理破碎過程，具有操作簡單、提取快速、提取率高等特點[12]。本文在單因素實驗的基礎上，通過正交實驗優(yōu)化了超聲法提取猴頭菇多糖的主要工藝條件，為猴頭菇多糖的開發(fā)利用和工業(yè)化生產提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

猴頭菇：青?；浐＾r牧集團溫室，烘干后切片粉碎，過40目篩，于55 ℃真空干燥，待用。

1.2 實驗方法

1.2.1 猴頭菇多糖提取

猴頭菇脫脂預處理：準確稱取猴頭菇樣品若干置于索氏抽提裝置中，用三氯甲烷∶甲醇為2∶1(體積比)混合溶液作為提取液，于80 ℃回流脫脂3次，105 ℃烘干備用。

超聲提取多糖：脫脂預處理后，猴頭菇粉按各因素(提取時間、提取溫度、料液比)實驗設計，以85%乙醇溶液作為提取劑，利用超聲波清洗機提取猴頭菇多糖，經過濾，取濾液測定多糖含量，并計算猴頭菇多糖得率。

1.2.2 單因素優(yōu)化實驗

準確稱取猴頭菇樣品若干置于索氏提取器中，先用乙醚回流脫脂2次，再用85%乙醇提取，設置提取時間(10，15，20，25，30 min)、提取溫度(30，40，50，60，70 ℃)、料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，g/mL)，利用超聲儀(超聲頻率為25 kHz)提取猴頭菇多糖。以多糖提取率為衡量指標，初步確定適合猴頭菇多糖超聲提取的工藝參數。每次改變一個因素進行不同單因素實驗，每實驗設3次重復。

1.2.3 正交實驗方法

《鹿鼎記》里，麗春院中到了嫖客，常常差韋小寶去買粽子。粽子整只用粽箬裹住，韋小寶要偷吃原亦甚難，但他總在粽角之中擠些米粒出來，嘗上一嘗。

在單因素實驗的基礎上，設計 L9(33)正交實驗(見表1)，確定超聲提取猴頭菇多糖的最佳工藝條件，并進行實驗驗證，證實該方法的可靠性。

表1 L9(33)正交實驗因素水平表Table 1 The factors and levels of L9(33) orthogonal test

1.2.4 多糖含量測定

參照苯酚-硫酸法測定猴頭菇多糖含量[13]，具體操作過程如下：

葡萄糖標準曲線的繪制：準確稱取105 ℃下干燥至恒重的分析純葡萄糖10 mg，加適量蒸餾水使其溶解，定容至100 mL，得到0.1 mg/mL的葡萄糖標準溶液。用移液管精密移取1，2，3，4，5，6 mL的葡萄糖標準溶液分別定容至10 mL，精密吸取2 mL于10 mL比色試管中，各加1 mL 5%苯酚溶液、5 mL濃硫酸，搖勻后靜置冷卻10 min，置于30 ℃水浴中10 min，用空白矯正零點，在490 nm下測定其吸光度。以葡萄糖濃度(mg/mL)為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制葡萄糖標準曲線。回歸方程為Y=14.521X+0.0092，R2=0.9959，線性關系較好。

樣品的測定：取1 mL猴頭菇多糖提取液，用蒸餾水定容至10 mL，如上方法測定吸光度值。參照葡萄糖標準曲線計算樣品多糖含量，進而計算猴頭菇多糖提取率：

2.1 單因素實驗

式中：c為根據吸光度值計算出的猴頭菇多糖溶液質量濃度，D為猴頭菇多糖溶液稀釋倍數，V為猴頭菇多糖溶液體積，m猴頭菇為猴頭菇原料干重。

2 結果與分析

2.1.1 不同提取時間對猴頭菇多糖提取率的影響

圖1 超聲提取時間對多糖提取率的影響

由圖1可知，在超聲提取15～20 min內猴頭菇多糖提取率有明顯提升；當超聲時間為20 min時，多糖提取率達到最高點4.96%；超聲時間超過20 min后，多糖提取率隨著超聲時間的增加而降低，這是由于超聲波產生的強烈空化效應、攪拌作用以及高的加速度，使有效成分快速進入溶劑，從而提高了多糖提取率[14]。因此，選取最佳的超聲提取時間為20 min。

2.1.2 不同提取溫度對猴頭菇多糖提取率的影響

在料液比 1∶15、超聲提取20 min的條件下，考察了超聲提取溫度對猴頭菇多糖提取率的影響，見圖2。

圖2 超聲提取溫度對多糖提取率的影響

由圖2可知，隨著溫度的升高，多糖提取率上升較快，當溫度超過50 ℃以后，多糖提取率上升幅度較小，這可能是由于隨著溫度的升高，超聲空穴作用加強，使細胞破碎程度過大，導致其他雜質被溶出，進而影響了多糖提取率。從節(jié)能角度考慮，選擇最佳超聲提取溫度為50 ℃。

2.1.3 不同料液比對猴頭菇多糖提取率的影響

在提取溫度為50 ℃、提取時間為20 min的條件下，考察了料液比對猴頭菇多糖提取率的影響，結果見圖3。

圖3 料液比對多糖提取率的影響

由圖3可知，隨著提取劑乙醇的增加，多糖提取率呈現先快速增加又逐漸降低的趨勢；當料液比為1∶15 (g/mL)時，多糖提取率達到最高值5.41%，這可能是因為料液比過小，多糖未被浸透導致其提取率偏低；料液比過高，溶出的蛋白質與多糖重新結合使其提取率降低，同時還增加了后續(xù)處理時間和提取液濃縮成本。因此，最佳提取料液比為1∶15 (g/mL)。

2.2 正交實驗結果與分析

根據單因素實驗結果設計3因素3水平的L9(33)正交實驗，結果見表2，極差R值反映了3個因素對猴頭菇多糖提取率的影響，依次為提取溫度(B)>提取時間(A)>料液比(C)；猴頭菇多糖提取最優(yōu)水平組合是A2B3C2，即超聲時間20 min，提取溫度60 ℃，料液比1∶15 (g/mL)，這與單因素實驗結果略有差異。

表2 L9(33)正交實驗結果Table 2 L9(33) orthogonal experimental results

2.3 驗證實驗

對正交實驗最優(yōu)組合A2B3C2進行驗證實驗，在料液比1∶15 (g/mL)、提取溫度為50 ℃的條件下，超聲提取為15 min，猴頭菇多糖提取率為6.16%，高于單因素實驗結果。因此，確定超聲提取猴頭菇多糖的最優(yōu)工藝條件為：提取時間20 min，提取溫度60 ℃，料液比1∶15 (g/mL)。

3 討論

多糖物質作為目前科研領域的研究熱點，不僅有極高的營養(yǎng)、醫(yī)藥價值，還具有重要的經濟價值。猴頭菇作為大型藥食兩用菌，其多糖有特殊、天然和高效的活性作用，有較好的抗氧化性，對多種自由基均有顯著的去除能力?，F已有猴頭菇多糖保健食品的研制，如猴頭菇多糖口含片和猴頭菇多糖飲料[15]。因此，研究能夠最大程度保留營養(yǎng)價值和活性成分的猴頭菇多糖提取方法具有重要的現實意義。

用超聲法提取猴頭菇多糖有簡化提取步驟、減少對多糖的破壞、提取時間短、多糖得率高等優(yōu)點，在中草藥化學成分提取中具有明顯優(yōu)勢[16]。但目前儀器設備耗能高，應用較少，推廣存在一定的難度。因此需要優(yōu)化超聲法提取猴頭菇多糖工藝，為后期推廣及產品的生產打下基礎。

4 結論

本研究采用單因素和正交試驗法對猴頭菇多糖的超聲提取工藝進行了探討，評價了提取時間、提取溫度和料液比對多糖提取率的影響，并優(yōu)化了提取工藝條件。對猴頭菇多糖提取率影響的主次順序為提取溫度>提取時間>料液比，最優(yōu)的提取條件為：超聲溫度60 ℃，超聲時間20 min，料液比為1∶15 (g/mL)。在此條件下，猴頭菇多糖提取率達6.16%。該方法簡化了猴頭菇多糖的提取步驟，避免了高溫和長時間提取對多糖結構的破壞，節(jié)省了成本，且多糖提取率較高，是一種較理想的高效又經濟的猴頭菇多糖提取新工藝。