鄧岳，楊陽，梁麗靜，遲原龍，孫群

(1.瀘州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，四川 瀘州 646000；2.國家固態(tài)釀造工程技術(shù)研究中心，四川瀘州 646000；3.四川大學(xué) 輕工科學(xué)與工程學(xué)院，成都 610064；4.四川大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610064)

中國醬油生產(chǎn)歷史悠久，因其獨(dú)特的風(fēng)味和營養(yǎng)價(jià)值備受全球人民青睞[1]。傳統(tǒng)醬油釀造采用的是長周期開放式的釀造工藝，釀造過程中涉及到自然界眾多微生物菌系的參與，同時(shí)也受區(qū)域性溫度、濕度等環(huán)境因素影響，因而擁有獨(dú)特的風(fēng)味[2]。

四川省瀘州市先市鎮(zhèn)的釀造歷史最早可以追溯到漢朝，到唐朝時(shí)期已形成一套獨(dú)特的釀制體系，擁有一家歷時(shí)100多年的醬油老廠房和600多口百年以上的曬露缸，生產(chǎn)醬油采用手工作坊式的天然多菌種混合發(fā)酵工藝，在自然環(huán)境中日曬夜露3～5年，所產(chǎn)醬油具有獨(dú)特風(fēng)味和顯著的區(qū)域特色。該釀造技藝于2014年被列入中國“非物質(zhì)文化遺產(chǎn)”名錄進(jìn)行重點(diǎn)保護(hù)，其生產(chǎn)場所也被列為“四川重點(diǎn)文物保護(hù)單位”名錄。

傳統(tǒng)釀造醬油采用自然開放式發(fā)酵，微生物種類和數(shù)量繁多，發(fā)酵過程涉及到多種有益微生物的聯(lián)合協(xié)同作用，通過微生物發(fā)酵糖類產(chǎn)生小分子醇類、醛類、酸類、酯類、酚類等風(fēng)味物質(zhì)，這是醬油風(fēng)味產(chǎn)生的主要途徑[3]。研究通過對傳統(tǒng)工藝釀制醬油發(fā)酵過程中微生物數(shù)量和種類與產(chǎn)品風(fēng)味特征物質(zhì)進(jìn)行分析，探究傳統(tǒng)工藝釀造醬油風(fēng)味特征與微生物之間的聯(lián)系，明確傳統(tǒng)工藝發(fā)酵醬油風(fēng)味物質(zhì)重要貢獻(xiàn)微生物，為分離風(fēng)味貢獻(xiàn)菌株、提升醬油風(fēng)味品質(zhì)與工藝優(yōu)化提供了參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

樣品分別來自先市釀造發(fā)酵過程中的第0.5，1，2，3，4年，且不同年份的醬醅樣品選取采用隨機(jī)原則，均隨機(jī)取自5口不同的醬缸(N=25)，分別編號為0.5～4-1～5。樣品采集后，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑

各引物名稱、序列組成及文獻(xiàn)出處見表1，由Invitrogen(上海)貿(mào)易有限公司合成；細(xì)菌DNA提取試劑盒、酵母DNA提取試劑盒、植物DNA提取試劑盒、溶細(xì)胞酶(Lyticase)：北京天根公司；SYBR Green I：美國Sigma公司；Stool DNA Kit、Gel Extraction Kit：美國Omega公司；Premix Taq Version 2.0(loading dye mix)：日本Takara公司；D2000 DNA Marker。所有試劑均為分析純。

表1 用于本研究PCR的引物Table 1 The primers for PCR in this study

1.3 主要儀器設(shè)備

Wide Mini-Sub Cell GT型水平電泳槽；S1000型PCR儀；PowerPac Basic型電泳儀電源；Universal Hood II型凝膠成像系統(tǒng)；UV-2450紫外分光光度計(jì)、2010-plus氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 日本島津公司；手動(dòng)進(jìn)樣器、固相微萃取頭、75 μm CAR/PDMS 美國Supelco公司。

1.4 微生物的分離與鑒定

1.4.1 分離培養(yǎng)培養(yǎng)基

平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基(PCA)：5 g蛋白胨、2.5 g酵母浸粉、1 g葡萄糖、15 g瓊脂粉，補(bǔ)水至1 L，調(diào)節(jié)pH至7，滅菌。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)：300 g土豆，洗凈去皮切成小塊，加適量水煮沸20 min。用8層紗布過濾，濾液加入20 g葡萄糖、18 g瓊脂粉并補(bǔ)水至1 L，加熱使其充分溶解，滅菌。在倒平板之前，需加入用少量乙醇溶解的0.1 g氯霉素，0.22 μm濾膜過濾到冷卻至50 ℃左右的培養(yǎng)基中。

De Man, Rogosa, Sharpe瓊脂培養(yǎng)基(MRSA)：10 g 蛋白胨、10 g牛肉膏、5 g酵母浸粉、20 g葡萄糖、2 g K2HPO4、2 g檸檬酸銨、5 g乙酸鈉、0.58 g MgSO4· 7H2O、0.25 g MnSO4·4H2O、1 mL吐溫80、15 g瓊脂粉，補(bǔ)水至1 L，滅菌。

1.4.2 菌株的分離和鑒定

根據(jù)培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)和初步鏡檢觀察，最大程度地隨機(jī)挑選不同的特征菌落，然后進(jìn)行反復(fù)的分離純化后，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。待擴(kuò)大培養(yǎng)完成后，利用相應(yīng)的DNA提取試劑盒提取部分菌株DNA，并使用針對16S rDNA的通用引物對27 F/1492 R(細(xì)菌)或針對ITS rDNA的通用引物對ITS1/ITS4(真菌)對相應(yīng)目的基因序列進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物送Invitrogen公司進(jìn)行測序以供菌種鑒定。

1.5 風(fēng)味物質(zhì)的頂空固相微萃取

1.5.1 頂空固相微萃取條件

準(zhǔn)確稱量8 mL傳統(tǒng)工藝釀制的先市醬油放置于頂空瓶中，加入1 g NaCl后密封，在40 ℃水浴鍋中平衡20 min，采用安裝有75 μm CAR/PDMS固相微萃取頭的手動(dòng)進(jìn)樣器，對先市醬油中的風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行萃取，萃取時(shí)間為40 min。3個(gè)平行樣品，每個(gè)樣品手動(dòng)進(jìn)樣2次。

1.5.2 GC-MS條件[6-7]

樣品分別通過DP-5MS彈性石英毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)進(jìn)行分離；程序升溫條件：起始溫度40 ℃，以3 ℃/min升到120 ℃，保持2 min，再以15 ℃/min升至250 ℃，保持2 min；載氣為高純氦氣(1.0 mL/min)；分流比10∶1。質(zhì)譜條件：電子轟擊電離(EI)離子源，電子能量70 eV；電子倍增器電壓350 V；離子源溫度230 ℃；傳輸線溫度250 ℃；質(zhì)量范圍35～350 m/z；掃描速度3.00 scans/s。

通過計(jì)算機(jī)檢索，同時(shí)利用NIST 08和WILEY 09譜庫相互匹配進(jìn)行定性分析。各組分相對含量按照峰面積歸一化法計(jì)算。

1.6 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 19.0軟件的One-way ANOVA進(jìn)行方差分析，并用LSD法和Dunnett＇s T3法進(jìn)行事后兩兩比較分析，P≤0.05視為具有顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 可培養(yǎng)微生物的主要類群計(jì)數(shù)

發(fā)酵醬醅中可培養(yǎng)的主要微生物類群計(jì)數(shù)結(jié)果見圖1。

圖1 醬醅中不同微生物類群隨發(fā)酵時(shí)間的變化

在整個(gè)醬醅發(fā)酵過程中，微生物(TMAB)的數(shù)量始終位居較高水平，菌落總數(shù)約為1×1010～1×1011CFU/g，在第一年這一時(shí)間點(diǎn)表現(xiàn)出小幅提升，并在第二年時(shí)略微下調(diào)，之后趨于平穩(wěn)；在數(shù)量水平上，細(xì)菌的芽孢與TMAB表現(xiàn)相似，不同的是前者數(shù)量的波動(dòng)范圍更小，始終保持在1×1010CFU/g的水平；酵母的菌落總數(shù)在前兩年中相對穩(wěn)定，當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行至中后期時(shí)下降了約兩個(gè)數(shù)量級。

2.2 可培養(yǎng)微生物的分離和鑒定

根據(jù)微生物菌落形態(tài)，共挑選61株細(xì)菌、18株酵母及12株霉菌進(jìn)行分子鑒定，具體結(jié)果見表2，各菌株與GenBank數(shù)據(jù)庫檢索得到的最相似模式菌株同源性均大于或等于99%。

表2 培養(yǎng)法獲得微生物的種類及所占比例Table 2 The types and proportion of microorganisms obtained by culture method

續(xù) 表

所有細(xì)菌菌落被鑒定為Bacillus屬，Bacillus優(yōu)勢顯著，主要為地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌三類。根據(jù)黃永光等的研究結(jié)果，芽孢桿菌能產(chǎn)生高活性的胞外產(chǎn)物酶，同時(shí)也會(huì)分泌大量自身生長需求和代謝合成風(fēng)味產(chǎn)物所需要的酶系，例如蛋白酶、淀粉酶、葡聚糖酶、纖維素酶、脂肪酶等水解酶在研究中均被發(fā)現(xiàn)，這些復(fù)雜的酶系為代謝的通路和初級代謝產(chǎn)物及其次生代謝產(chǎn)物的形成提供了關(guān)鍵動(dòng)力。根據(jù)Quan C S等的研究表明[8]，芽孢桿菌屬在發(fā)酵過程中會(huì)產(chǎn)生獨(dú)特的特征風(fēng)味，呈現(xiàn)出辛香、甜香、蜂蜜香、醋酸香、油脂腐臭、奶酪香、水果香、芳香、醚香；奶油香、草莓果香、炒芝麻香、堅(jiān)果香、青椒香、烤玉米香；玫瑰花香、杏仁香、異臭、略微氨臭味、醬香等特征性風(fēng)味。

2.3 先市醬油揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)

傳統(tǒng)工藝釀造醬油HS-SPME氣相色譜-質(zhì)譜總離子流色譜圖見圖2。

圖2 傳統(tǒng)工藝釀造先市醬油HS-SPME氣相色譜-質(zhì)譜總離子流圖Fig.2 GC/MS total ion chromatogram of Xianshi soy sauce brewed by traditional technology

由圖2可知，傳統(tǒng)工藝釀造的先市醬油中各種揮發(fā)性組分都取得了良好的分離效果，各色譜峰相應(yīng)的質(zhì)譜圖經(jīng)人工解析及計(jì)算機(jī)檢索并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)，共鑒定出48種風(fēng)味化合物，其中醇類(8種)、酯類(7種)、醛類(7種)、酸類(6種)、酮類(6種)、吡嗪類(4種)、呋喃類(3種)、含硫化合物(3種)、酚類(2種)及其他類(2種)。

由表3可知，傳統(tǒng)工藝釀制醬油的風(fēng)味成分中含量高的為酸類43%，醛類12%，呋喃類10%，醇類9%，其次為其他類、含硫類、酮類、吡嗪類、酯類。其中酸類物質(zhì)共有6種，其中以乙酸為主。有機(jī)酸可以通過酵母菌、芽孢桿菌、乳酸菌等多種微生物以三羧酸或丙酮酸循環(huán)代謝生成，有機(jī)酸的存在能賦予醬油酸味柔和、回味綿長的口感；醛類物質(zhì)含量為12%，醛類物質(zhì)主要來源于不飽和脂肪酸的降解，含量較高的為2-甲基丁醛、異戊醛、5-甲基呋喃醛、苯乙醛。其中，苯乙醛具有焦糖香、甜以及類似蜂蜜的風(fēng)味，呈咖啡和可可香氣，微帶甜的水果和巧克力似風(fēng)味。醇類物質(zhì)占9%，其中以乙醇為主，一共檢出8種醇類物質(zhì)。以丁二醇為主，丁二醇是具有黃油和奶油香、甜味復(fù)雜的高級醇類化合物。酯類香味清淡，香味散逸快，逸散遠(yuǎn)，容易讓人感覺到，在醬油中一共檢測出7種酯類物質(zhì)；雜環(huán)類化合物主要表現(xiàn)的是堅(jiān)果香味和清香；吡啶類化合物、吡嗪類化合物具有強(qiáng)烈的水果香，其香氣閾值濃度極低，香氣透散性好；3種呋喃類香味物質(zhì)和4種吡嗪類化合物在醬油中被檢測出，其中以2,6-二甲基吡嗪為主；含硫化合物是含硫氨基酸經(jīng)過美拉德反應(yīng)后通過Strecker降解產(chǎn)生，在火腿、烤肉中被檢測出，具有焦香、烤香、燒烤味，呈味閾值低，對產(chǎn)品風(fēng)味影響大，一共檢測出3種含硫化合物，在醬油中含量為3%；其他類中檢測出2種，其中2-乙?；量┚哂锌久姘?，為焦糖香化合物。

表3 傳統(tǒng)工藝釀制先市醬油風(fēng)味物質(zhì)相對含量(%)Table 3 The relative content (%) of volatile components of Xianshi soy sauce brewed by traditional technology

許延濤等的研究表明[9]，芽孢桿菌屬可通過糖酵解、磷酸戊糖等一系列糖代謝途徑和檸檬酸循環(huán)；丙酮酸代謝等中間節(jié)點(diǎn)代謝、丙氨酸代謝、酪氨酸和苯甲酸降解羥化等氨基酸代謝途徑[10]；膦酸酯和膦酸代謝、硫胺素代謝、維生素B6代謝、核黃素代謝等其他途徑合成大量風(fēng)味物質(zhì)，例如丙酮酸代謝途徑最終產(chǎn)物有乙醇、乙醛、乙酸、丙酮、丁醛、異丙醇、丁醇、丁酸等化合物；L-蘇氨酸代謝途徑產(chǎn)物合成吡嗪類化合物；苯丙氨酸代謝、酪氨酸代謝途徑產(chǎn)物為合成乙酸、丁酸等有機(jī)酸類物質(zhì)和苯乙醇、苯乙醛等風(fēng)味化合物[11]；α-乙酰乳酸途徑合成丁二醇，代謝途徑合成醛類、酮類、吡嗪類、呋喃類風(fēng)味物質(zhì)[12]，這與楊帆等研究得出從茅臺(tái)醬香型白酒生產(chǎn)大曲酒醅中分離產(chǎn)醬香風(fēng)味的芽孢桿菌類功能菌發(fā)酵代謝風(fēng)味物質(zhì)種類比較豐富，特別是吡嗪類、含硫化合物、醛類、酮類、酯類等種類和含量較高的結(jié)論一致，也與發(fā)酵過程中傳統(tǒng)工藝釀造醬油中微生物芽孢桿菌所占的種類、數(shù)量、比例的變化規(guī)律相吻合。

3 結(jié)論

為探究傳統(tǒng)工藝釀造醬油的微生物多樣性與風(fēng)味特征品質(zhì)，采用傳統(tǒng)培養(yǎng)法，分析傳統(tǒng)工藝釀造醬油中微生物的多樣性。結(jié)果顯示：在整個(gè)醬醅發(fā)酵過程中，微生物的數(shù)量始終居于較高水平，菌落總數(shù)約為1×1010～1×1011CFU/g，在第一年時(shí)間點(diǎn)表現(xiàn)出小幅提升，在第二年時(shí)略微下調(diào)，之后趨于平穩(wěn)；在數(shù)量水平上，細(xì)菌的芽孢與微生物總量表現(xiàn)相似，不同的是前者數(shù)量的波動(dòng)范圍更小，始終保持在1×1010CFU/g的水平；酵母的菌落總數(shù)在前兩年相對穩(wěn)定，當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行至中后期時(shí)下降了約兩個(gè)數(shù)量級；并從先市醬油發(fā)酵過程中分離出61株細(xì)菌、18株酵母及12株霉菌，其中芽孢桿菌主要有地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌三類。用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法對其揮發(fā)性風(fēng)味成分進(jìn)行定性定量。從發(fā)酵4年的醬油中，共鑒定出48種風(fēng)味化合物，其中醇類(8種)、酯類(7種)、醛類(7種)、酸類(6種)、酮類(6種)、吡嗪類(4種)、呋喃類(3種)、含硫化合物(3種)、酚類(2種)及其他類(2種)。Zhao X等的研究表明[13]，醬油中風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)生機(jī)制與微生物組成分析表明，芽孢桿菌類微生物是先市醬油中酸類、酮類、含硫類、吡嗪類等低閾值化合物合成的重要微生物，芽孢桿菌屬可能對先市醬油獨(dú)特風(fēng)味的形成起決定性作用。下一步從先市醬油中篩選出對醬油風(fēng)味形成具有重要貢獻(xiàn)的芽孢桿菌，并將其優(yōu)化改良后用于現(xiàn)代工藝釀制醬油中改善風(fēng)味不足、酒精味過重、產(chǎn)品質(zhì)量不高等問題[14]，從而提升現(xiàn)代工藝釀制醬油的風(fēng)味和質(zhì)量。