馮雪貞,肖轉(zhuǎn)泉,范國榮,王宗德*

(1. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院,國家林業(yè)草原木本香料(華東)工程技術(shù)研究中心,江西 南昌 330045； 2. 江西師范大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院,江西 南昌 330027)

季銨鹽化合物是一類陽離子表面活性劑,具有水溶性較好、化學(xué)性能穩(wěn)定、使用方便、低毒高效、廣譜抗菌等優(yōu)點(diǎn)[1],已得到廣泛應(yīng)用,包括用作植物病原菌的抗菌劑[2-3]。雙子季銨鹽由于分子內(nèi)含有兩個(gè)親水基和親油基而具有優(yōu)異的表面性能和水溶性,被譽(yù)為新一代陽離子表面活性劑[4]。松香基雙子季銨鹽表面活性劑亦有報(bào)道[5-7]。作者所在課題組長期從事松節(jié)油主成分β-蒎烯的深加工研究,合成了氫化諾卜基鹵代物[8]、含氫化諾卜基的叔胺[9]以及含氫化諾卜基的單季銨鹽[10-12]等,發(fā)現(xiàn)部分單季銨鹽化合物對(duì)植物病原菌有良好的抑制活性。本研究在課題組前期研究的基礎(chǔ)上,以松節(jié)油主成分β-蒎烯制備的氫化諾卜基二甲基胺(氫化諾卜基的叔胺)為原料,將其與α,ω-二氯烷烴發(fā)生親核取代反應(yīng),合成得到含氫化諾卜基的雙子季銨鹽化合物,并測(cè)試其抗植物病原菌活性,旨在為天然可再生優(yōu)勢(shì)生物質(zhì)資源松節(jié)油的深度開發(fā)利用提供新的途徑。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 試劑、菌種與儀器

氫化諾卜基二甲基胺(純度>95%),參照文獻(xiàn)[13]制備；1,4-二氯丁烷、1,5-二氯戊烷、1,6-二氯己烷、石油醚(30～60 ℃)和乙酸乙酯均為市售分析純；百菌清為標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%)。

AmaZon SL質(zhì)譜儀，德國Bruker Daltonics公司；AVANCE400 型核磁共振儀，瑞士Bruker公司；44X- 6T 顯微熔點(diǎn)測(cè)定儀，上海光學(xué)儀器六廠；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-ID型無菌超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；GHP-250型智能培養(yǎng)箱，上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司。

植物病原菌:水稻紋枯病菌(Thanatephoruscucumeris),油茶炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioides),枇杷炭疽病菌(Colletotrichumacutatum),松枯梢病病原菌(Sphaeropsissapinea),七葉樹殼孢菌(Fusicoccumaesuli),采絨革蓋菌(Coriolusversicolor),煙草黑脛病菌(Phytophthoraparasiticavar.nicotianae),綿腐臥孔菌(Poriavaporaria),西瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporum),9種菌種均由江西農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院森林保護(hù)教研室提供。

1.2 雙子季銨鹽的合成

1.2.1合成路線 氫化諾卜基二甲基胺(1)分別與1,4-二氯丁烷、1,5-二氯戊烷、1,6-二氯己烷反應(yīng)制得3種含氫化諾卜基的雙子季銨鹽(2a～2c),合成路線見圖1。

圖1 氫化諾卜基雙子季銨鹽的合成路線

1.2.2合成方法 在150 mL錐形瓶中加入0.11 mol的氫化諾卜基二甲基胺、0.05 mol的α,ω-二氯代烷和50 mL乙酸乙酯,在65 ℃左右攪拌約3 d,冷卻,結(jié)晶(10 ℃),過濾并用石油醚洗滌3～5次,濾干后減壓干燥,得產(chǎn)物2a～2c。

1.3 結(jié)構(gòu)表征

以TMS為內(nèi)標(biāo),D2O為溶劑,用400 MHz核磁共振儀進(jìn)行1H NMR和13C NMR分析；采用電噴霧電離源(ESI) 在液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀上進(jìn)行 ESI-MS 分析。

1.4 抑菌活性測(cè)試

用菌絲生長速率法[14-16]測(cè)定氫化諾卜基雙子季銨鹽對(duì)9種植物病原菌的抑制作用。以不含任何化合物的馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基平板作為空白對(duì)照組,以百菌清為陽性對(duì)照。將季銨鹽用無菌水配制成質(zhì)量濃度為2 g/L的溶液,通過二倍稀釋法將溶液配成1、 0.5、 0.25和0.125 g/L濃度梯度,將其與滅菌過的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)液以體積比1 ∶9混合,得到質(zhì)量濃度為200、 100、 50、 25和12.5 mg/L 的含藥培養(yǎng)液,將含藥培養(yǎng)液倒入培養(yǎng)皿中,得到含藥液的平板,每個(gè)處理重復(fù)3次。接菌后置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)數(shù)天,待空白對(duì)照組平板的菌落直徑生長到整個(gè)培養(yǎng)皿的三分之二左右,用十字交叉法測(cè)量菌落直徑(菌落直徑=菌落實(shí)際生長直徑-菌餅直徑),根據(jù)菌落直徑求抑制率,計(jì)算公式如下:

菌絲生長抑制率=(對(duì)照組菌落直徑-處理組菌落直徑)/對(duì)照組菌落直徑×100%

2 結(jié)果與討論

2.1 合成反應(yīng)分析

叔胺與α,ω-二氯烷烴反應(yīng)可得到雙子季銨鹽。為了保證二氯烷烴兩端都發(fā)生反應(yīng)形成季銨鹽,叔胺的用量必須過量,以避免產(chǎn)物中夾雜尚有一端仍未季銨化的單季銨鹽,從而影響雙子季銨鹽的結(jié)晶和純度。由于合成過程中用的是氯代烷烴,與叔胺的反應(yīng)活性不如溴代烷烴,所以有必要延長反應(yīng)時(shí)間,使反應(yīng)完全。

2.2 3種雙子季銨鹽的結(jié)構(gòu)表征

化合物2a:四亞甲基-1,4-雙(氫化諾卜基二甲基氯化銨),C30H58N2Cl2,白色細(xì)粒狀結(jié)晶體,得率87.6%,m.p.252.9～254.5 ℃。1H NMR (400 MHz,D2O)δH: 3.30(8H,m,H-11,H-11′,H-12,H-12′),3.04(12H,s,H-α),2.33(2H,m,H-2,H-2′),1.99～1.80(20H,m,H-7-a,H-7′-a,H-10,H-10′,H-5,H-5′,H-1,H-1′,H- 4,H- 4′,H-3-a,H-3′-a,H-13,H-13′),1.44(2H,m,H-3-b,H-3′-b),1.17(6H,s,H-9,H-9′),1.01(6H,s,H-8,H-8′),0.87(2H,d,J=9.2 Hz,H-7-b,H-7′-b);13C NMR (100 Hz,D2O)δC:36.94(C-1,C-1′),44.44(C-2,C-2′),20.51(C-3,C-3′),24.81(C- 4,C- 4′),39.94 (C-5,C-5′),37.08(C- 6,C- 6′),28.51(C-7,C-7′),21.76(C-8,C-8′),26.57(C-9,C-9′),37.74(C-10,C-10′),61.98(C-11,C-11′),61.11(C-12,C-12′),18.19(C-13,C-13′),49.90(C-α,C-α,C-α,C-α);ESI-MSm/z:481.5,483.5[M-Cl]+,551.5,553.5,555.5[M+Cl]+。

化合物2b:五亞甲基-1,5-雙(氫化諾卜基二甲基氯化銨),C31H60N2Cl2,白色細(xì)粒狀結(jié)晶體,得率84.2%,m.p.258.4～260.7 ℃。1H NMR (400 MHz,D2O)δH:3.30(8H,m,H-11,H-11′,H-12,H-12′),3.04(12H,s,H-α),2.33(2H,m,H-2,H-2′),1.99～1.80(22H,m,H-7-a,H-7′-a,H-10,H-10′,H-5,H-5′,H-1,H-1′,H- 4,H- 4′,H-3-a,H-3′-a,H-13,H-13′,H-14),1.44(2H,m,H-3-b,H-3′-b),1.17(6H,s,H-9,H-9′),1.01(6H,s,H-8,H-8′),0.87(2H,d,J=9.2 Hz,H-7-b,H-7′-b);13C NMR(100 Hz,D2O)δC:37.08(C-1,C-1′),44.61(C-2,C-2′),20.92(C-3,C-3′),25.10(C- 4,C- 4′),40.16(C-5,C-5′),37.31(C- 6,C- 6′),28.52(C-7,C-7′),21.90(C-8,C-8′),26.86(C-9,C-9′),32.07(C-10,C-10′),61.47(C-10,C-11′),61.24(C-12,C-12′),21.53(C-13,C-13′),20.63(C-14),50.31(C-α,C-α,C-α,C-α); ESI-MSm/z:495.5,497.5[M-Cl]+,565.5,567.5,569.5[M+Cl]+。

化合物2c:六亞甲基-1,6-雙(氫化諾卜基二甲基氯化銨),C32H62N2Cl2,白色細(xì)粒狀結(jié)晶體,得率90.4%,m.p.264.2～265.3 ℃。1H NMR (400 MHz,D2O)δH: 3.26(8H,m,H-11,H-11′,H-12,H-12′),3.06(12H,s,H-α),2.33(2H,m,H-2,H-2′),2.04～1.77(20H,m,H-7-a,H-7′-a,H-10,H-10′,H-5,H-5′,H-1,H-1′,H- 4,H- 4′,H-3-a,H-3′-a,H-13,H-13′),1.43(6H,m,H-3-b,H-3′-b,H-14,H-14′),1.20(6H,s,H-9,H-9′),1.04(6H,s,H-8,H-8′),0.92(2H,d,J=9.6 Hz,H-7-b,H-7′-b);13C NMR (100 Hz,D2O)δC:36.97(C-1,C-1′),44.57(C-2,C-2′),20.89(C-3,C-3′),24.98(C- 4,C- 4′),40.07(C-5,C-5′),37.21(C- 6,C- 6′),28.49(C-7,C-7′),21.82(C-8,C-8′),26.74(C-9,C-9′),31.93(C-10,C-10′),61.67(C-11,C-11′),61.29(C-12,C-12′),24.27(C-13,C-13′),20.58(C-14,C-14′),50.18(C-α,C-α,C-α,C-α);ESI-MSm/z:509.5,511.5[M-Cl]+,579.6,581.6,583.6[M+Cl]+。

2.3 雙子季銨鹽的抑菌活性

3種含氫化諾卜基的雙子季銨鹽化合物在5種濃度下對(duì)9種植物病原菌的抑制率數(shù)據(jù)列于表1。從表中所列的抑制率數(shù)據(jù)可以看出,3種雙子季銨鹽化合物對(duì)綿腐臥孔菌的抑制率均為100%,抑菌率和百菌清相同；2b、2c在質(zhì)量濃度為12.5 mg/L時(shí)和2a在25 mg/L時(shí)對(duì)松枯梢病病原菌、七葉樹殼孢菌、煙草黑脛病菌和西瓜枯萎病菌的抑制率,均高于百菌清在200 mg/L時(shí)的抑制率；2a和2c在質(zhì)量濃度為25 mg/L時(shí)對(duì)枇杷炭疽病菌的抑制率也高于百菌清質(zhì)量濃度為200 mg/L時(shí)的抑制率；3種化合物在5個(gè)不同質(zhì)量濃度下對(duì)采絨革蓋菌的抑制率高于相應(yīng)濃度下百菌清的抑制率；3種化合物在質(zhì)量濃度200 mg/L時(shí)對(duì)油茶炭疽病菌的抑制率高于百菌清；在質(zhì)量濃度為50 mg/L及以上時(shí),3種化合物對(duì)水稻紋枯病菌的抑制率高于百菌清。

表1 氫化諾卜基雙子季銨鹽的抑菌活性1)

從表中數(shù)據(jù)還可以看出,對(duì)9種植物病原菌的抑制率均以化合物2c為最高；對(duì)油茶炭疽病菌、松枯梢病病原菌、七葉樹殼孢菌和西瓜枯萎病菌的抑制率,化合物2b又高于2a。說明此類雙子季銨鹽化合物分子中兩個(gè)陽離子之間的碳鏈越長越能增加其對(duì)這些病原菌的抑制效果。

3 結(jié) 論

3.1由氫化諾卜基二甲基胺分別與3種α,ω-二氯代烷反應(yīng)制得四亞甲基-1,4-雙(氫化諾卜基二甲基氯化銨)(2a)、五亞甲基-1,5-雙(氫化諾卜基二甲基氯化銨)(2b)和六亞甲基-1,6-雙(氫化諾卜基二甲基氯化銨)(2c)，并通過NMR和MS對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了確認(rèn)和表征。

3.23種化合物2a～2c對(duì)所試9種植物病原菌均具有優(yōu)良的抑制活性,其中2c的抑制效果最好。質(zhì)量濃度為12.5～200 mg/L時(shí)，2c對(duì)松枯梢病病原菌、七葉樹殼孢菌、煙草黑脛病菌、西瓜枯萎病菌和枇杷炭疽病菌的抑制率都大大高于相同質(zhì)量濃度的百菌清。