王瑞苓,劉祥義,劉建祥,吳春華*

(1. 西南地區(qū)林業(yè)生物質資源高效利用國家林業(yè)和草原局重點實驗室,云南 昆明 650224；2. 西南林業(yè)大學 林學院,云南 昆明 650224； 3. 西南林業(yè)大學 化學工程學院,云南 昆明 650224； 4. 西南林業(yè)大學 生態(tài)與環(huán)境工程學院,云南 昆明 650224)

松脂被譽為“長在樹上的石油”,它是松屬樹木生命活動過程中產生的生理分泌物,是無色、透明的黏性液體,松脂的主要成分是松香和松節(jié)油[1]。據統計[2],2013年我國松香產業(yè)產值達119.1億元人民幣,出口創(chuàng)匯6.4億美元。2018年松香產量達42萬噸,松節(jié)油產量8萬噸[3]。松香具有增黏、乳化、軟化、防潮、防腐、絕緣等優(yōu)良性能,廣泛應用于制皂、造紙、涂料、黏合劑、橡膠、食品、電氣、建筑材料等工業(yè)領域[4-6]。以松香為原料通過化學修飾得到的系列衍生物在香精香料、醫(yī)藥及化工等領域得到了廣泛的應用[7-12]。松節(jié)油是一種產量豐富和價格低廉的植物精油,在香料、涂料、醫(yī)藥、農藥、新材料等領域有著廣泛的應用[13-15]。采集松脂是松香生產中最重要的基礎環(huán)節(jié),該環(huán)節(jié)集技術、體力、勞動密集為一體,同時又受采脂林的林齡、立地條件、采脂季的氣候條件所影響[16-18]。因此,如何科學采集松脂,促進松樹資源的可持續(xù)發(fā)展值得深入研究。針對目前采脂勞動強度大、采脂效率低的現狀,本課題組制備了一種用于促進松脂形成和分泌的化學/生物型復合營養(yǎng)型增脂劑,該增脂劑使用時不損傷松樹割口,對松脂及松香質量無影響,且安全、無毒。本研究將該化學/生物型復合增脂劑應用于云南省雙柏縣云南松的采脂試驗,并探討其增脂效果及對云南松各生理指標的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗地及樣樹選擇

2018年12月至2019年12月選擇距離云南省雙柏縣縣城20 km處的一片云南松林為實驗樣地(東經101°03′,北緯24°14′,海拔2 005 m)。樣地屬北亞熱帶高原季風氣候,年平均降雨量927 mm,年平均氣溫15 ℃,年平均日照時數為2 355 h,雨熱同季,干濕季分明。該樣地為一片成熟的云南松林,選擇陽坡上的胸徑在20 cm左右的長勢健壯未割脂的160株云南松為樣樹,進行編號。所選樣樹按《松脂采脂規(guī)程》進行下降法采脂,3 d加一刀,割面負荷率40%,敞口受脂器收脂,記錄30 d產脂量,去除單株產脂量100 g以下及500 g以上的樣本后,共得樣樹120株。

1.2 增脂劑的來源

采用一種化學增脂劑與兩種生物增脂劑分別復合施用?；瘜W增脂劑以硝酸稀土為主要成分并添加多種微量元素,生物增脂劑分別為乙烯利水溶液和α-萘乙酸溶液。乙烯利濃度為6×10-4mol/L,α-萘乙酸先用適量95%乙醇溶解，再用自來水稀釋至濃度為2×10-4mol/L，將化學增脂劑與乙烯利復合施用稱為增脂劑1,化學增脂劑與α-萘乙酸復合施用稱為增脂劑2。

1.3 增脂劑的施加方法

將實驗樣樹根據最初產脂量分為0#、1#、2#三組,每組40株,每組初產脂總量相近。0#組為對照組不施藥,1#和2#組分別施用增脂劑1和增脂劑2。

增脂劑施加方式：在離云南松根部1.8 m處,用鉆頭打出傾斜于樹干30°、深3～5 cm的小孔,將裝有5 mL化學增脂劑的增脂劑瓶口插入小孔中,在瓶底用針頭刺穿一個小孔讓化學增脂劑能自然流出,30 d后,施加5 mL生物增脂劑(乙烯利和α-萘乙酸)。每30 d,化學增脂劑和生物增脂劑交替施加。在施加增脂劑下方10 cm處開V字型割溝和中溝,安裝受脂器采脂。以施加增脂劑為第一天，每3 d割一刀,任松脂自然流入受脂器,每月收脂一次,稱質量。

1.4 增脂效果分析

1.4.1增脂率的計算 按下式計算增脂率：

P=(Y-Y0)/Y0×100%

式中:Y—施加增脂劑后每30 d平均每株產脂量,g；Y0—對照組每30 d平均每株產脂量,g；P—增脂率,%。

1.4.2增脂劑對云南松生理指標的影響 在實驗進行了兩個月后(一輪復合施用后),每月隨機采集各處理3株樣樹松針。將所采松針測量鮮質量、干質量[19],葉綠素總量,可溶性糖,可溶性蛋白,超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)酶活性,丙二醛(MDA)含量。每處理3個平行樣所得數據取平均值。

葉綠素總量采用分光光度法[20],可溶性糖含量采用蒽酮法[19],可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍法[21],采用氮藍四唑(NBT)法測定SOD酶活性[22-23],采用高錳酸鉀滴定法測定CAT酶活性[24]；采用愈創(chuàng)木酚法測定POD酶活性[24]；采用硫代巴比妥酸比色法測定MDA含量[24]。

1.5 松脂氣相色譜-質譜(GC-MS)分析

氣相色譜條件:TG-1701 MS毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm),程序升溫(初始溫度為70 ℃ 保持10 min,以5.0 ℃/min升至150 ℃保持2.0 min,以10.0 ℃/min升至220 ℃保持10.0 min),載氣為高純He,恒流模式,柱流量1.0 mL/min,平均線速度37 cm/s,進樣量0.2 μL,進樣口溫度230 ℃,分流比50 ∶1。

質譜條件:EI電離模式,電子倍增管電壓1 913.0 V,電子能量70.0 eV,離子傳輸管溫度250 ℃,離子源溫度230 ℃,掃描質量范圍m/z30～550。

2 結果與分析

2.1 增脂劑對云南松松脂的影響

2.1.1增脂劑的增脂效果 增脂劑對云南松產脂量和增脂率的影響見表1。

表1 增脂劑對云南松產脂量和增脂率的影響1)

從表1可以看出,增脂劑1的年均增脂率可達31.48%,增脂劑2的年均增脂率為20.20%,比增脂劑1效果略差,說明施用增脂劑有助于提高松脂的產量。而且不同的月份,隨著氣候的變化,松樹的生長受天氣的影響,增脂率有所變化。對于寒冷的12月份和1月份,松脂產量少,增脂率也不高,隨著氣溫的升高,增脂率也提高。2019年6月份由于特別干旱,雨季來臨較晚,施用增脂劑后增脂率反而升高很多,說明環(huán)境不利時,增脂劑的施用更有利于松脂的生長,這也說明本課題組研究的增脂劑是營養(yǎng)型增脂劑,有利于松樹的生長,從而提高云南松的增脂率。

2.1.2松脂質量 增脂劑1施用6個月后,對所得云南松松脂進行GC-MS分析,結果見圖1。從云南松松脂的總離子流量可知,云南松松脂的主要化學成分沒有變化。但從所得松脂的氣相色譜按面積歸一化法計算松節(jié)油含量,得出施用增脂劑1后云南松含松節(jié)油的量平均增加24.6%。說明施用增脂劑后云南松松節(jié)油的含量增加,松脂的流動性增加,松脂的品質更好?？梢娛┯迷鲋瑒┖?不但可以提高松脂的產量,還能提高松脂的質量。

a.對照組control; b.施加增脂劑1 adding tapping irritant agent 1

2.2 增脂劑對云南松生理指標的影響

2.2.1松針鮮質量、干質量 施加增脂劑對云南松的長勢有明顯影響,通過測量松針鮮質量和干質量以及松針的葉綠素含量判斷樹的長勢,結果如表2所示。

表2 增脂劑對云南松針片鮮質量、干質量的影響

葉片鮮質量反應了植物水分吸收等代謝的旺盛程度,干質量反應了植物干物質的積累,體現了植物的營養(yǎng)狀況。從表2可知,施加兩種增脂劑均可提高松針的鮮質量和干質量,云南松松針鮮質量和干質量的增加率最大值分別為34.57%和37.89%,這說明實驗增脂劑是營養(yǎng)型的物質,可以促進云南松葉片水分的吸收和干物質的積累。同時也說明增脂劑有利于植物進行光合作用,并且從干質量和鮮質量的增加率數據可知，增脂劑1促進光合作用物質積累效果好于增脂劑2。

2.2.2葉綠素、可溶性糖和可溶性蛋白含量 為進一步探討施用增脂劑后對云南松生長狀況的影響,分析其增脂機理,實驗測定了云南松葉綠素、可溶性糖和可溶性蛋白含量,結果見表3。由表3可知,施用增脂劑1后云南松葉綠素、可溶性糖和可溶性蛋白含量都比對照組高,增脂劑2在施用后的前3個月，可溶性糖和可溶性蛋白含量都比對照組高，葉綠素含量稍微低于對照組。不同月份的天氣狀況不同,施加增脂劑后對云南松的這些指標的影響也不同。葉綠素是植物進行光合作用的主要物質,研究表明植物葉片的葉綠素含量與光合速率之間呈密切的正相關[25]。4個月后施用增脂劑的松針中葉綠素含量提高,松樹長勢優(yōu)于未施藥對照組,說明施用增脂劑后,葉綠素含量增加,光合作用加強,松脂產量增加。并且從表3還可以看出施用增脂劑1比增脂劑2更好。

可溶性糖在植物的生命周期中具有重要作用,它可以為植物的生長發(fā)育提供必要的能量,也可以提供代謝的原料?？扇苄蕴且彩侵参锷L發(fā)育和基因表達的重要調節(jié)因子。由表3可知,施用增脂劑3個月后,可溶性糖的含量都比對照組要高,7月份的增加率達25.88%，9、10月份,松針可溶性糖含量最高。這可能是糖分在松樹生物體內進行一系列生化反應,轉變成了萜烯和樹脂酸,即松脂。推測增脂劑有利于促進可溶性糖含量增加,糖進一步轉化為松脂,從而提高云南松的產脂能力。

表3 增脂劑對云南松葉綠素、可溶性糖和可溶性蛋白含量的影響

可溶性蛋白是重要的滲透調節(jié)物質和營養(yǎng)物質,主要影響植物細胞的保水能力,對植物細胞的生命物質及生物膜起到保護作用,是研究植物抗寒能力的重要生理指標。從表3數據可知,施用增脂劑后可溶性蛋白含量增加,施用復合增脂劑1云南松可溶性蛋白的增加率更大,3月份，可溶性蛋白含量增加率可達42.85%說明施用增脂劑后,云南松的保水能力、抗寒能力更強,更有利于云南松的生長。這可能是增脂劑中復合稀土作為植物生長調節(jié)劑,促進了松樹對土壤中氮、磷、鉀的吸收,提高葉綠素含量,增強云南松的光合作用和抗逆性[26]。

2.2.3三大保護酶活性 為了進一步探討增脂劑對云南松生長狀況的影響,研究了施用增脂劑對云南松三大保護酶活性的影響,結果見表4。

表4 增脂劑對云南松酶活性的影響

超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)是植物體內三大保護酶,可以提高植物適應環(huán)境的能力。SOD是存在于生命體中的活性物質,SOD能清除多余的自由基,因此,SOD活性的高低一定程度反映植物耐氧化能力的強弱。CAT是一種催化過氧化氫分解的催化酶,廣泛分布于細胞的過氧化物內。而過氧化氫是植物體內對機體造成嚴重損害的代謝廢物,過氧化氫酶能將過氧化氫快速氧化分解,從而避免對機體的損害。POD是植物在受到過氧化物侵害時,自身所產生的一類氧化還原酶,它們能催化過氧化物氧化分解,可催化體內的過氧化物和胺類等多種代謝廢物氧化反應,分解為無毒無害或毒性較小的物質,降低過剩的自由基,使植物體內自由基含量始終維持動態(tài)平衡,以提高植物的抗逆性。由表4可知,施加增脂劑可以明顯增加云南松SOD、CAT、POD三大保護酶活性,不同月份酶活性的增加程度不同,4月份，施加增脂劑1的云南松，其SOD,CAT增加率分別可達178.37%和137.60%，12月份POD的增加率達42.86%。在比較寒冷的11、12月份,三大保護酶活性更強,這可能是植物為了御寒保護自己的應激行為。施加增脂劑后三大保護酶增加更多,酶活性更強,更有利于提高植物的御寒能力。這與廣西農業(yè)大學梁和等用乙烯利處理甘蔗后,對其過氧化物酶影響的研究結果一致[25，27]。因此,可以推斷施加增脂劑后,云南松對環(huán)境的抵抗和適應能力都有所增加,有利于松樹產脂。

圖2 增脂劑對MDA含量的影響Fig.2 Effects of tapping irritant agents on the content of MDA

2.2.4丙二醛含量 丙二醛(MDA)作為生物過氧化的標志物,是自由基在生物體內產生脂質過氧化過程[16]。故MDA含量反映了生物膜受傷害的程度。增脂劑對云南松MDA的影響見圖2。

由圖2可知,施加增脂劑可以使云南松MDA含量減少,特別是在比較干旱的6月、比較寒冷的2月、11月、12月,云南松MDA值都比較高,而施加增脂劑后,MDA含量均有所降低,且增脂劑1的降低幅度大于增脂劑2。說明增脂劑能保護云南松生物膜的穩(wěn)定性,保障各項生命活動正常有序進行?？傊?施加化學/生物復合增脂劑的云南松MDA含量明顯減小,從而減少云南松膜系統受損并提高云南松對干旱、寒冷等不良氣候的抗逆性。

3 結 論

3.1制備了兩種化學/生物型復合增脂劑,將其用于云南松的增脂,結果顯示兩種增脂劑均可增加云南松松脂的產量,平均增脂率分別為31.48%和20.20%,增脂劑1的增脂效果優(yōu)于增脂劑2。施用增脂劑后松脂的化學組成不變,松節(jié)油含量可以提高24.6%,流動性增強,松脂品質更好。

3.2通過生理指標分析發(fā)現：增脂劑可以提高云南松松針鮮質量、干質量，增加率最大值分別為34.57% 和37.89%。含葉綠素的量明顯增加(最高可增加59.94%),光合作用增強；提高可溶性糖(最高可增加25.88%)和可溶性蛋白的量(最高可增加42.85%)；增強SOD(最高可增加178.38%)、CAT(最高可增加137.60%)、POD(最高可增加42.86%)三大植物保護酶活性,提高植物的耐寒性和環(huán)境適應能力；降低云南松MDA含量,減少干旱、寒冷等對生物膜的傷害,保障各項生命活動正常有序進行。

3.3施加化學/生物復合增脂劑可增加松脂產量,能提高采脂勞動生產率,有利于云南松采脂的可持續(xù)性健康發(fā)展。