王瑞苓,劉祥義,劉建祥,吳春華*

(1. 西南地區(qū)林業(yè)生物質(zhì)資源高效利用國(guó)家林業(yè)和草原局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,云南 昆明 650224；2. 西南林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院,云南 昆明 650224； 3. 西南林業(yè)大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院,云南 昆明 650224； 4. 西南林業(yè)大學(xué) 生態(tài)與環(huán)境工程學(xué)院,云南 昆明 650224)

松脂被譽(yù)為“長(zhǎng)在樹上的石油”,它是松屬樹木生命活動(dòng)過程中產(chǎn)生的生理分泌物,是無色、透明的黏性液體,松脂的主要成分是松香和松節(jié)油[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)[2],2013年我國(guó)松香產(chǎn)業(yè)產(chǎn)值達(dá)119.1億元人民幣,出口創(chuàng)匯6.4億美元。2018年松香產(chǎn)量達(dá)42萬噸,松節(jié)油產(chǎn)量8萬噸[3]。松香具有增黏、乳化、軟化、防潮、防腐、絕緣等優(yōu)良性能,廣泛應(yīng)用于制皂、造紙、涂料、黏合劑、橡膠、食品、電氣、建筑材料等工業(yè)領(lǐng)域[4-6]。以松香為原料通過化學(xué)修飾得到的系列衍生物在香精香料、醫(yī)藥及化工等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用[7-12]。松節(jié)油是一種產(chǎn)量豐富和價(jià)格低廉的植物精油,在香料、涂料、醫(yī)藥、農(nóng)藥、新材料等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用[13-15]。采集松脂是松香生產(chǎn)中最重要的基礎(chǔ)環(huán)節(jié),該環(huán)節(jié)集技術(shù)、體力、勞動(dòng)密集為一體,同時(shí)又受采脂林的林齡、立地條件、采脂季的氣候條件所影響[16-18]。因此,如何科學(xué)采集松脂,促進(jìn)松樹資源的可持續(xù)發(fā)展值得深入研究。針對(duì)目前采脂勞動(dòng)強(qiáng)度大、采脂效率低的現(xiàn)狀,本課題組制備了一種用于促進(jìn)松脂形成和分泌的化學(xué)/生物型復(fù)合營(yíng)養(yǎng)型增脂劑,該增脂劑使用時(shí)不損傷松樹割口,對(duì)松脂及松香質(zhì)量無影響,且安全、無毒。本研究將該化學(xué)/生物型復(fù)合增脂劑應(yīng)用于云南省雙柏縣云南松的采脂試驗(yàn),并探討其增脂效果及對(duì)云南松各生理指標(biāo)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)地及樣樹選擇

2018年12月至2019年12月選擇距離云南省雙柏縣縣城20 km處的一片云南松林為實(shí)驗(yàn)樣地(東經(jīng)101°03′,北緯24°14′,海拔2 005 m)。樣地屬北亞熱帶高原季風(fēng)氣候,年平均降雨量927 mm,年平均氣溫15 ℃,年平均日照時(shí)數(shù)為2 355 h,雨熱同季,干濕季分明。該樣地為一片成熟的云南松林,選擇陽坡上的胸徑在20 cm左右的長(zhǎng)勢(shì)健壯未割脂的160株云南松為樣樹,進(jìn)行編號(hào)。所選樣樹按《松脂采脂規(guī)程》進(jìn)行下降法采脂,3 d加一刀,割面負(fù)荷率40%,敞口受脂器收脂,記錄30 d產(chǎn)脂量,去除單株產(chǎn)脂量100 g以下及500 g以上的樣本后,共得樣樹120株。

1.2 增脂劑的來源

采用一種化學(xué)增脂劑與兩種生物增脂劑分別復(fù)合施用?；瘜W(xué)增脂劑以硝酸稀土為主要成分并添加多種微量元素,生物增脂劑分別為乙烯利水溶液和α-萘乙酸溶液。乙烯利濃度為6×10-4mol/L,α-萘乙酸先用適量95%乙醇溶解，再用自來水稀釋至濃度為2×10-4mol/L，將化學(xué)增脂劑與乙烯利復(fù)合施用稱為增脂劑1,化學(xué)增脂劑與α-萘乙酸復(fù)合施用稱為增脂劑2。

1.3 增脂劑的施加方法

將實(shí)驗(yàn)樣樹根據(jù)最初產(chǎn)脂量分為0#、1#、2#三組,每組40株,每組初產(chǎn)脂總量相近。0#組為對(duì)照組不施藥,1#和2#組分別施用增脂劑1和增脂劑2。

增脂劑施加方式：在離云南松根部1.8 m處,用鉆頭打出傾斜于樹干30°、深3～5 cm的小孔,將裝有5 mL化學(xué)增脂劑的增脂劑瓶口插入小孔中,在瓶底用針頭刺穿一個(gè)小孔讓化學(xué)增脂劑能自然流出,30 d后,施加5 mL生物增脂劑(乙烯利和α-萘乙酸)。每30 d,化學(xué)增脂劑和生物增脂劑交替施加。在施加增脂劑下方10 cm處開V字型割溝和中溝,安裝受脂器采脂。以施加增脂劑為第一天，每3 d割一刀,任松脂自然流入受脂器,每月收脂一次,稱質(zhì)量。

1.4 增脂效果分析

1.4.1增脂率的計(jì)算 按下式計(jì)算增脂率：

P=(Y-Y0)/Y0×100%

式中:Y—施加增脂劑后每30 d平均每株產(chǎn)脂量,g；Y0—對(duì)照組每30 d平均每株產(chǎn)脂量,g；P—增脂率,%。

1.4.2增脂劑對(duì)云南松生理指標(biāo)的影響 在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了兩個(gè)月后(一輪復(fù)合施用后),每月隨機(jī)采集各處理3株樣樹松針。將所采松針測(cè)量鮮質(zhì)量、干質(zhì)量[19],葉綠素總量,可溶性糖,可溶性蛋白,超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)酶活性,丙二醛(MDA)含量。每處理3個(gè)平行樣所得數(shù)據(jù)取平均值。

葉綠素總量采用分光光度法[20],可溶性糖含量采用蒽酮法[19],可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)法[21],采用氮藍(lán)四唑(NBT)法測(cè)定SOD酶活性[22-23],采用高錳酸鉀滴定法測(cè)定CAT酶活性[24]；采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定POD酶活性[24]；采用硫代巴比妥酸比色法測(cè)定MDA含量[24]。

1.5 松脂氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)分析

氣相色譜條件:TG-1701 MS毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm),程序升溫(初始溫度為70 ℃ 保持10 min,以5.0 ℃/min升至150 ℃保持2.0 min,以10.0 ℃/min升至220 ℃保持10.0 min),載氣為高純He,恒流模式,柱流量1.0 mL/min,平均線速度37 cm/s,進(jìn)樣量0.2 μL,進(jìn)樣口溫度230 ℃,分流比50 ∶1。

質(zhì)譜條件:EI電離模式,電子倍增管電壓1 913.0 V,電子能量70.0 eV,離子傳輸管溫度250 ℃,離子源溫度230 ℃,掃描質(zhì)量范圍m/z30～550。

2 結(jié)果與分析

2.1 增脂劑對(duì)云南松松脂的影響

2.1.1增脂劑的增脂效果 增脂劑對(duì)云南松產(chǎn)脂量和增脂率的影響見表1。

表1 增脂劑對(duì)云南松產(chǎn)脂量和增脂率的影響1)

從表1可以看出,增脂劑1的年均增脂率可達(dá)31.48%,增脂劑2的年均增脂率為20.20%,比增脂劑1效果略差,說明施用增脂劑有助于提高松脂的產(chǎn)量。而且不同的月份,隨著氣候的變化,松樹的生長(zhǎng)受天氣的影響,增脂率有所變化。對(duì)于寒冷的12月份和1月份,松脂產(chǎn)量少,增脂率也不高,隨著氣溫的升高,增脂率也提高。2019年6月份由于特別干旱,雨季來臨較晚,施用增脂劑后增脂率反而升高很多,說明環(huán)境不利時(shí),增脂劑的施用更有利于松脂的生長(zhǎng),這也說明本課題組研究的增脂劑是營(yíng)養(yǎng)型增脂劑,有利于松樹的生長(zhǎng),從而提高云南松的增脂率。

2.1.2松脂質(zhì)量 增脂劑1施用6個(gè)月后,對(duì)所得云南松松脂進(jìn)行GC-MS分析,結(jié)果見圖1。從云南松松脂的總離子流量可知,云南松松脂的主要化學(xué)成分沒有變化。但從所得松脂的氣相色譜按面積歸一化法計(jì)算松節(jié)油含量,得出施用增脂劑1后云南松含松節(jié)油的量平均增加24.6%。說明施用增脂劑后云南松松節(jié)油的含量增加,松脂的流動(dòng)性增加,松脂的品質(zhì)更好?？梢娛┯迷鲋瑒┖?不但可以提高松脂的產(chǎn)量,還能提高松脂的質(zhì)量。

a.對(duì)照組control; b.施加增脂劑1 adding tapping irritant agent 1

2.2 增脂劑對(duì)云南松生理指標(biāo)的影響

2.2.1松針鮮質(zhì)量、干質(zhì)量 施加增脂劑對(duì)云南松的長(zhǎng)勢(shì)有明顯影響,通過測(cè)量松針鮮質(zhì)量和干質(zhì)量以及松針的葉綠素含量判斷樹的長(zhǎng)勢(shì),結(jié)果如表2所示。

表2 增脂劑對(duì)云南松針片鮮質(zhì)量、干質(zhì)量的影響

葉片鮮質(zhì)量反應(yīng)了植物水分吸收等代謝的旺盛程度,干質(zhì)量反應(yīng)了植物干物質(zhì)的積累,體現(xiàn)了植物的營(yíng)養(yǎng)狀況。從表2可知,施加兩種增脂劑均可提高松針的鮮質(zhì)量和干質(zhì)量,云南松松針鮮質(zhì)量和干質(zhì)量的增加率最大值分別為34.57%和37.89%,這說明實(shí)驗(yàn)增脂劑是營(yíng)養(yǎng)型的物質(zhì),可以促進(jìn)云南松葉片水分的吸收和干物質(zhì)的積累。同時(shí)也說明增脂劑有利于植物進(jìn)行光合作用,并且從干質(zhì)量和鮮質(zhì)量的增加率數(shù)據(jù)可知，增脂劑1促進(jìn)光合作用物質(zhì)積累效果好于增脂劑2。

2.2.2葉綠素、可溶性糖和可溶性蛋白含量 為進(jìn)一步探討施用增脂劑后對(duì)云南松生長(zhǎng)狀況的影響,分析其增脂機(jī)理,實(shí)驗(yàn)測(cè)定了云南松葉綠素、可溶性糖和可溶性蛋白含量,結(jié)果見表3。由表3可知,施用增脂劑1后云南松葉綠素、可溶性糖和可溶性蛋白含量都比對(duì)照組高,增脂劑2在施用后的前3個(gè)月，可溶性糖和可溶性蛋白含量都比對(duì)照組高，葉綠素含量稍微低于對(duì)照組。不同月份的天氣狀況不同,施加增脂劑后對(duì)云南松的這些指標(biāo)的影響也不同。葉綠素是植物進(jìn)行光合作用的主要物質(zhì),研究表明植物葉片的葉綠素含量與光合速率之間呈密切的正相關(guān)[25]。4個(gè)月后施用增脂劑的松針中葉綠素含量提高,松樹長(zhǎng)勢(shì)優(yōu)于未施藥對(duì)照組,說明施用增脂劑后,葉綠素含量增加,光合作用加強(qiáng),松脂產(chǎn)量增加。并且從表3還可以看出施用增脂劑1比增脂劑2更好。

可溶性糖在植物的生命周期中具有重要作用,它可以為植物的生長(zhǎng)發(fā)育提供必要的能量,也可以提供代謝的原料?？扇苄蕴且彩侵参锷L(zhǎng)發(fā)育和基因表達(dá)的重要調(diào)節(jié)因子。由表3可知,施用增脂劑3個(gè)月后,可溶性糖的含量都比對(duì)照組要高,7月份的增加率達(dá)25.88%，9、10月份,松針可溶性糖含量最高。這可能是糖分在松樹生物體內(nèi)進(jìn)行一系列生化反應(yīng),轉(zhuǎn)變成了萜烯和樹脂酸,即松脂。推測(cè)增脂劑有利于促進(jìn)可溶性糖含量增加,糖進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為松脂,從而提高云南松的產(chǎn)脂能力。

表3 增脂劑對(duì)云南松葉綠素、可溶性糖和可溶性蛋白含量的影響

可溶性蛋白是重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),主要影響植物細(xì)胞的保水能力,對(duì)植物細(xì)胞的生命物質(zhì)及生物膜起到保護(hù)作用,是研究植物抗寒能力的重要生理指標(biāo)。從表3數(shù)據(jù)可知,施用增脂劑后可溶性蛋白含量增加,施用復(fù)合增脂劑1云南松可溶性蛋白的增加率更大,3月份，可溶性蛋白含量增加率可達(dá)42.85%說明施用增脂劑后,云南松的保水能力、抗寒能力更強(qiáng),更有利于云南松的生長(zhǎng)。這可能是增脂劑中復(fù)合稀土作為植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑,促進(jìn)了松樹對(duì)土壤中氮、磷、鉀的吸收,提高葉綠素含量,增強(qiáng)云南松的光合作用和抗逆性[26]。

2.2.3三大保護(hù)酶活性 為了進(jìn)一步探討增脂劑對(duì)云南松生長(zhǎng)狀況的影響,研究了施用增脂劑對(duì)云南松三大保護(hù)酶活性的影響,結(jié)果見表4。

表4 增脂劑對(duì)云南松酶活性的影響

超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)是植物體內(nèi)三大保護(hù)酶,可以提高植物適應(yīng)環(huán)境的能力。SOD是存在于生命體中的活性物質(zhì),SOD能清除多余的自由基,因此,SOD活性的高低一定程度反映植物耐氧化能力的強(qiáng)弱。CAT是一種催化過氧化氫分解的催化酶,廣泛分布于細(xì)胞的過氧化物內(nèi)。而過氧化氫是植物體內(nèi)對(duì)機(jī)體造成嚴(yán)重?fù)p害的代謝廢物,過氧化氫酶能將過氧化氫快速氧化分解,從而避免對(duì)機(jī)體的損害。POD是植物在受到過氧化物侵害時(shí),自身所產(chǎn)生的一類氧化還原酶,它們能催化過氧化物氧化分解,可催化體內(nèi)的過氧化物和胺類等多種代謝廢物氧化反應(yīng),分解為無毒無害或毒性較小的物質(zhì),降低過剩的自由基,使植物體內(nèi)自由基含量始終維持動(dòng)態(tài)平衡,以提高植物的抗逆性。由表4可知,施加增脂劑可以明顯增加云南松SOD、CAT、POD三大保護(hù)酶活性,不同月份酶活性的增加程度不同,4月份，施加增脂劑1的云南松，其SOD,CAT增加率分別可達(dá)178.37%和137.60%，12月份POD的增加率達(dá)42.86%。在比較寒冷的11、12月份,三大保護(hù)酶活性更強(qiáng),這可能是植物為了御寒保護(hù)自己的應(yīng)激行為。施加增脂劑后三大保護(hù)酶增加更多,酶活性更強(qiáng),更有利于提高植物的御寒能力。這與廣西農(nóng)業(yè)大學(xué)梁和等用乙烯利處理甘蔗后,對(duì)其過氧化物酶影響的研究結(jié)果一致[25，27]。因此,可以推斷施加增脂劑后,云南松對(duì)環(huán)境的抵抗和適應(yīng)能力都有所增加,有利于松樹產(chǎn)脂。

圖2 增脂劑對(duì)MDA含量的影響Fig.2 Effects of tapping irritant agents on the content of MDA

2.2.4丙二醛含量 丙二醛(MDA)作為生物過氧化的標(biāo)志物,是自由基在生物體內(nèi)產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化過程[16]。故MDA含量反映了生物膜受傷害的程度。增脂劑對(duì)云南松MDA的影響見圖2。

由圖2可知,施加增脂劑可以使云南松MDA含量減少,特別是在比較干旱的6月、比較寒冷的2月、11月、12月,云南松MDA值都比較高,而施加增脂劑后,MDA含量均有所降低,且增脂劑1的降低幅度大于增脂劑2。說明增脂劑能保護(hù)云南松生物膜的穩(wěn)定性,保障各項(xiàng)生命活動(dòng)正常有序進(jìn)行?？傊?施加化學(xué)/生物復(fù)合增脂劑的云南松MDA含量明顯減小,從而減少云南松膜系統(tǒng)受損并提高云南松對(duì)干旱、寒冷等不良?xì)夂虻目鼓嫘浴?/p>

3 結(jié) 論

3.1制備了兩種化學(xué)/生物型復(fù)合增脂劑,將其用于云南松的增脂,結(jié)果顯示兩種增脂劑均可增加云南松松脂的產(chǎn)量,平均增脂率分別為31.48%和20.20%,增脂劑1的增脂效果優(yōu)于增脂劑2。施用增脂劑后松脂的化學(xué)組成不變,松節(jié)油含量可以提高24.6%,流動(dòng)性增強(qiáng),松脂品質(zhì)更好。

3.2通過生理指標(biāo)分析發(fā)現(xiàn)：增脂劑可以提高云南松松針鮮質(zhì)量、干質(zhì)量，增加率最大值分別為34.57% 和37.89%。含葉綠素的量明顯增加(最高可增加59.94%),光合作用增強(qiáng)；提高可溶性糖(最高可增加25.88%)和可溶性蛋白的量(最高可增加42.85%)；增強(qiáng)SOD(最高可增加178.38%)、CAT(最高可增加137.60%)、POD(最高可增加42.86%)三大植物保護(hù)酶活性,提高植物的耐寒性和環(huán)境適應(yīng)能力；降低云南松MDA含量,減少干旱、寒冷等對(duì)生物膜的傷害,保障各項(xiàng)生命活動(dòng)正常有序進(jìn)行。

3.3施加化學(xué)/生物復(fù)合增脂劑可增加松脂產(chǎn)量,能提高采脂勞動(dòng)生產(chǎn)率,有利于云南松采脂的可持續(xù)性健康發(fā)展。