王坤芳，祝娜，沙子珺，朱彥，梁志剛，牛文晶，楊育同

1.山西中醫(yī)藥大學(xué)，山西 晉中 030619；2.中央民族大學(xué)，北京 100081；3.中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)藥信息研究所，北京 100700；4.山西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山西 太原 030024

癲癇是由多種病因引起的一種慢性腦部疾病，是腦內(nèi)神經(jīng)元過度放電導(dǎo)致的反復(fù)性、發(fā)作性、短暫性的中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能異常［1］。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，我國癲癇患病率在7‰，約有900萬癲癇患者，且每年有40萬的新發(fā)患者［2］。癲癇的反復(fù)發(fā)作嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。癲癇患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)為一般人的2～3倍［2］。目前，癲癇治療仍以藥物控制發(fā)作為主，共開發(fā)了7種傳統(tǒng)的抗癲癇藥（antieptic drugs，AEDs），以卡馬西平、丙戊酸為代表藥及多種新型的AEDs，以拉莫三嗪、奧卡西平、托吡酯等為代表藥。但很多AEDs均會產(chǎn)生嚴(yán)重程度不一的不良反應(yīng)，如認(rèn)知障礙、嗜睡、頭暈、共濟(jì)失調(diào)、記憶下降等中樞神經(jīng)系統(tǒng)不良反應(yīng)，還會出現(xiàn)白細(xì)胞下降、皮疹等其他系統(tǒng)表現(xiàn)。

癲癇屬于中醫(yī)“癇病”“癇癥”范疇。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，癲癇病因與七情失調(diào)、先天因素、腦部外傷有關(guān)。病因中尤以痰邪作祟最為首要，痰濁內(nèi)阻、陰陽偏盛、神機(jī)受累、元神失控是病機(jī)關(guān)鍵所在［3］。中藥治療癲癇已有多年的歷史，同時抗癲癇有低毒長效的優(yōu)勢［4］。石菖蒲（Acorustatarinowii Schott）為天南星科植物石菖蒲的干燥根莖，具有開竅醒神、化濕和胃、寧神益智的功效。《神農(nóng)本草經(jīng)》記載石菖蒲能“開心孔，補(bǔ)五臟，通九竅，明耳目，出音聲”；《本草綱目》中記載該藥可治中惡卒死、客杵癲癇、下血崩中等。現(xiàn)代藥理研究證實(shí)，石菖蒲有抗癲癇的作用［5］。許多典籍中記載的含石菖蒲方劑，其中蘊(yùn)含了大量的有效中藥藥對或組合，對石菖蒲配伍規(guī)律及組合物的挖掘，有利于石菖蒲抗癲癇新藥的發(fā)現(xiàn)。本研究擬采用關(guān)聯(lián)規(guī)則數(shù)據(jù)挖掘結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，從“中藥-化學(xué)成分-疾病-靶標(biāo)-通路”角度進(jìn)行分析，探究石菖蒲及其配伍組合治療癲癇的分子作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 處方來源與納入標(biāo)準(zhǔn)在中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)藥信息研究所中國中醫(yī)藥數(shù)據(jù)庫方劑數(shù)據(jù)庫中以“石菖蒲”為主題詞［6］，對含石菖蒲的方劑進(jìn)行檢索。納入標(biāo)準(zhǔn)：1911年前古代醫(yī)籍所記載的方劑。根據(jù)《古代經(jīng)典名方目錄制定的遴選范圍與遴選原則》第一條，關(guān)于古代醫(yī)籍的遴選范圍界定為：1911年前出版的古代醫(yī)籍。

排除標(biāo)準(zhǔn)：非內(nèi)用方劑、單味藥方劑、方劑中藥物組成不確切的方劑。參考《中華人民共和國藥典》《中藥大辭典》對中藥名稱進(jìn)行規(guī)范化處理，篩除劑量、藥物炮制信息、描述性前綴詞，保留個別炮制信息。

1.2 含石菖蒲高頻藥對的數(shù)據(jù)挖掘運(yùn)用統(tǒng)計(jì)分析軟件R（V3.4.0）語言的arules包，對含石菖蒲的方劑進(jìn)行關(guān)聯(lián)規(guī)則（association rules）分析，以獲得石菖蒲高頻對藥。結(jié)果按支持度、置信度降序排列，設(shè)置篩選條件：提升度≥1、支持度≥0.3、置信度≥0.9，認(rèn)為同時滿足支持度≥0.3、置信度≥0.9的高頻對藥具有強(qiáng)關(guān)聯(lián)規(guī)則性［6］。

1.3 含石菖蒲及其高頻藥對網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

1.3.1 化學(xué)成分的獲取與篩選 分別以“石菖蒲”“遠(yuǎn)志”“人參”和“茯苓”為關(guān)鍵詞，通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺（traditional chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）和中國科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所化學(xué)專業(yè)數(shù)據(jù)庫搜集石菖蒲及其高關(guān)聯(lián)對藥所含化學(xué)成分。利用Pubchem數(shù)據(jù)庫獲得化合物的Canonical SMILES格式。將化合物的SMILES格式文件導(dǎo)入SwissADME平臺，設(shè)置胃腸道吸收性（GI absorption）以及血腦屏障滲透性為High，Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge類藥性（Druglikeness）預(yù)測結(jié)果中有2個或以上為“YES”的化學(xué)成分為潛在活性成分。

1.3.2 抗癲癇靶點(diǎn)預(yù)測 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫搜集化合物作用的靶點(diǎn)；通過Swiss Target Prediction平臺，導(dǎo)入篩選所得化合物的SMILES格式文件，設(shè)置屬性為“homo sapiens”，預(yù)測化合物作用的潛在靶點(diǎn)。以“epilepsy”關(guān)鍵詞，通過OMIM 與DrugBank疾病靶點(diǎn)網(wǎng)站進(jìn)行檢索，獲得癲癇的疾病靶點(diǎn)，并應(yīng)用UniProt數(shù)據(jù)庫對疾病靶點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。將藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)分別剔除重復(fù)項(xiàng)后，通過STRING數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/）分別構(gòu)建化合物對應(yīng)靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)及疾病對應(yīng)靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)。應(yīng)用Cytoscape3.7.0軟件“Merge”功能獲取藥物-疾病交集靶點(diǎn)，將其作為石菖蒲及其藥對抗癲癇的潛在作用靶點(diǎn)。

1.3.3 生物過程與通路富集分析 將交集靶點(diǎn)提交DAVID數(shù)據(jù)庫，設(shè)置為“Homo sapiens”，設(shè)置“COUNT”為2，“EASE”為0.05，進(jìn)行GO注釋分析和KEGG通路富集分析。

1.3.4 抗癲癇“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建 采用Cytoscape3.7.0軟件構(gòu)建石菖蒲及其對藥抗癲癇的“活性成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)模型，網(wǎng)絡(luò)包括潛在活性成分、靶點(diǎn)或作用通路3類節(jié)點(diǎn)，并以淺相連。

2 結(jié)果

2.1 關(guān)聯(lián)分析從806首含石菖蒲方劑中篩選出743首符合要求的標(biāo)準(zhǔn)方劑，同時符合提升度、支持度、可信度關(guān)聯(lián)規(guī)則篩選條件的對藥共4對，與石菖蒲密切相關(guān)的中藥依次是遠(yuǎn)志、人參、甘草、茯苓，且遠(yuǎn)志＝＞石菖蒲、人參＝＞石菖蒲、甘草＝＞石菖蒲、茯苓＝＞石菖蒲均具有強(qiáng)關(guān)聯(lián)規(guī)則性，見表1。

2.2 石菖蒲及其高頻對藥活性成分篩選結(jié)果通過TCMSP數(shù)據(jù)庫和化學(xué)專業(yè)數(shù)據(jù)庫共收集到295個石菖蒲及其高頻對藥相關(guān)化合物，通過胃腸道吸收性、類藥性篩選的化合物為159個，同時還具有血腦屏障滲透性的化合物為112個。其中包括50個石菖蒲相關(guān)成分、13個遠(yuǎn)志相關(guān)成分、44個人參相關(guān)成分和5個茯苓相關(guān)成分，見表2，圖1。

表1 含石菖蒲藥對關(guān)聯(lián)規(guī)則篩選結(jié)果

表2 含石菖蒲方劑活性成分

續(xù)表2 含石菖蒲方劑活性成分

圖1 含石菖蒲方劑活性成分BOILED-Egg圖

2.3 含石菖蒲及其藥對-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)利用TCMSP數(shù)據(jù)庫和Swiss Target Prediction平臺共獲取762個藥物潛在靶點(diǎn)。通過OMIM 與DrugBank數(shù)據(jù)庫共搜集到489個疾病相關(guān)靶點(diǎn)。分別構(gòu)建化合物對應(yīng)靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)及疾病對應(yīng)靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)，經(jīng)Cytoscape軟件“Merge”獲得石菖蒲方劑抗癲癇的特征性基因共89個，返回STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建“藥物-疾病”交集靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖，見圖2。

圖2 含石菖蒲及其藥對-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

圖3 含石菖蒲方劑抗癲癇特征性基因GO功能富集分析

2.4 基因功能和通路富集結(jié)果通過DAVID數(shù)據(jù)庫對石菖蒲方劑抗癲癇的特征性基因進(jìn)行GO功能富集分析，獲得生物過程（biological process，BP）相關(guān)條目227個，主要涉及信號傳導(dǎo)、離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、化學(xué)突觸傳遞、膽堿能突觸傳遞等方面；細(xì)胞組成（cellularcomponent，CC）相關(guān)條目47個，主要涉及質(zhì)膜、突觸后膜、樹突、線粒體等部位；分子功能（molecular function，MF）相關(guān)條目41個，主要涉及細(xì)胞外配體門控離子通道活性、GABA-A受體活性、苯二氮卓受體活性、G蛋白偶聯(lián)受體活性、乙酰膽堿受體活性等方面。GO功能富集分析結(jié)果中各分類Count值前10的相關(guān)條目，圖3。通過DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，石菖蒲及其高頻對藥抗癲癇的特征性基因共涉及36條通路，主要涉及神經(jīng)配體受體相互作用、GABA能突觸、鈣信號通路、cAMP信號通路、多巴胺能突觸、5-羥色胺能突觸等，見表3，圖4。

2.5 含石菖蒲及其高頻對藥抗癲癇“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖利用Cytoscape3.7.0軟件對石菖蒲及其高頻對藥的112個活性成分、具有抗癲癇作用的89個特征性靶點(diǎn)、Count值前10的信號通路進(jìn)行“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，見圖5。說明石菖蒲及其高頻對藥治療癲癇有“多成分-多靶點(diǎn)-多途徑”的作用特點(diǎn)。

表3 含石菖蒲抗癲癇特征性基因KEGG通路富集分析

圖4 含石菖蒲抗癲癇特征性基因KEGG通路富集分析

圖5 含石菖蒲方劑抗癲癇的“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖

3 討論

基于數(shù)據(jù)挖掘?qū)χ委煱d癇的118個方劑中所含157種藥物的用藥規(guī)律進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)石菖蒲使用頻次最高［7］。藥對又稱對藥，是臨床用藥中相對固定的兩味藥物的配伍形式，具有復(fù)方配伍的最基本特點(diǎn)［8］。藥對是臨床方劑應(yīng)用的靈魂，是方劑有效性的關(guān)鍵［9］。故采用數(shù)據(jù)挖掘及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)相結(jié)合的方法對石菖蒲抗癲癇高頻藥對及其可能作用機(jī)制進(jìn)行探討。

此次研究中，遠(yuǎn)志、人參、甘草、茯苓與石菖蒲關(guān)聯(lián)度最高，其中除甘草外，四味藥與《外臺秘要》中的定志丸相同。通過文獻(xiàn)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)以定志丸為基本方加減，常用于治療癲癇［10-11］。石菖蒲、遠(yuǎn)志合用祛痰化濕、開竅醒神益智，人參、茯苓合用益氣健脾、寧心復(fù)脈安神。癇證的中醫(yī)病理因素涉及風(fēng)、火、痰、瘀，其中尤以痰邪作祟最為重要，定志丸恰恰通過祛痰化濕、寧心安神治療癲癇。甘草與石菖蒲的強(qiáng)關(guān)聯(lián)性可被認(rèn)為是甘草常被作為使藥用于多數(shù)方劑的結(jié)果，故予以剔除。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果顯示，石菖蒲及其高頻對藥抗癲癇主要與膽堿能突觸傳遞、神經(jīng)配體受體相互作用、GABA能突觸、鈣信號通路、cAMP信號通路、多巴胺能突觸、5-羥色胺能突觸等生物過程及信號通路有關(guān)，涉及細(xì)胞外配體門控離子通道活性、GABA-A受體活性、苯二氮卓受體活性、G蛋白偶聯(lián)受體活性、乙酰膽堿受體活性等分子過程，主要作用于質(zhì)膜、突觸、線粒體等部位。癲癇的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前仍未完全闡明，普遍接受的學(xué)說是中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮與抑制的失衡。近年的研究表明，癲癇發(fā)病機(jī)制與離子通道、神經(jīng)突觸遞質(zhì)與受體、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞及一些免疫反應(yīng)等發(fā)生不平衡相關(guān)［12］。多數(shù)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，氨基酸類遞質(zhì)γ-氨基丁酸（GABA）和單胺類遞質(zhì)多巴胺、5-羥色胺能夠抑制癲癇發(fā)作，而乙酰膽堿則能促進(jìn)癲癇發(fā)作［13］。應(yīng)用基因芯片技術(shù)檢測難治性顳葉內(nèi)側(cè)型癲癇患者的硬化海馬組織與正常海馬組織基因差異表達(dá)，結(jié)果顯示，差異基因涉及的通路有神經(jīng)活性配體、受體相互作用通路和鈣離子信號通路［14］，與本研究結(jié)果相符，推測石菖蒲及其高頻對藥可能是通過作用于突觸來調(diào)控上述通路，從而發(fā)揮抗癲癇作用。

在CNKI中以“石菖蒲”和涉及的相關(guān)通路為主題詞檢索，發(fā)現(xiàn)“石菖蒲”與“GABA”檢索時所得文獻(xiàn)數(shù)量最多，為21篇。GABA是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，它參與人體多種代謝活動，具有較高的生理活性。當(dāng)人體內(nèi)GABA缺乏時，會產(chǎn)生焦慮、不安、疲倦、憂慮等情緒。相關(guān)研究表明，石菖蒲所含成分α-細(xì)辛醚可以通過調(diào)控GABA-A型受體來抑制小鼠嗅球內(nèi)僧帽細(xì)胞的自發(fā)放電，并能阻滯Nav1.2離子通道使膜電位超級化，從而緩解動物驚厥癥狀［15］。石菖蒲中的桉脂素（SCP15）能夠通過上調(diào)小鼠和大鼠腦部GABA-A型受體的表達(dá)而對抗電擊和戊四氮誘導(dǎo)的癲癇［16］。藥對配伍實(shí)驗(yàn)研究顯示，人參、石菖蒲配伍后安神益智的功效遠(yuǎn)勝于單用人參或石菖蒲，其機(jī)制與改善睡眠剝奪動物的腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)ACh、GABA有關(guān)［17］。故進(jìn)一步推測，含石菖蒲藥對抗癲癇的作用機(jī)制很有可能與調(diào)節(jié)GABA有關(guān)，為進(jìn)一步研究提供參考。

綜上所述，本文運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，從含石菖蒲方劑中獲取112個活性成分，挖掘出其治療癲癇的89個特征性基因靶點(diǎn)，涉及到多個信號通路及生物進(jìn)程，初步探索了含石菖蒲方劑治療癲癇的分子網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制，體現(xiàn)了含石菖蒲方劑通過多成分-多靶點(diǎn)-多通路治療癲癇癥狀的特點(diǎn)，該結(jié)果可為癲癇的防治提供研究思路，但其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。另外，由于數(shù)據(jù)檢索過程未考慮方劑中石菖蒲、遠(yuǎn)志、茯苓與人參的配比、用藥劑量、給藥途徑等問題，本文研究結(jié)果還有待開展藥效及分子機(jī)制實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。