劉亞男，陳 蘭，丁 勇

參與氣孔大小發(fā)育和干旱脅迫應(yīng)答

劉亞男，陳 蘭，丁 勇*

(中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命與醫(yī)學(xué)部，中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，合肥微尺度國家物理科學(xué)實驗室分子細胞生物物理研究所，合肥 230027)

植物在受到外界環(huán)境干旱脅迫時，會啟動一系列的生理反應(yīng)，包括氣孔的關(guān)閉和ABA的產(chǎn)生，然而，植物如何平衡干旱脅迫和生命周期，并不清楚。編碼C末端結(jié)構(gòu)域(C-terminal domain , CTD)的磷酸化酶，抑制擬南芥()的開花時間。研究發(fā)現(xiàn)72參與擬南芥的干旱脅迫應(yīng)答，SSU72定位于細胞核中，功能缺失的SSU72失水速率快、氣孔大，并且氣孔的關(guān)閉對ABA不敏感；進一步檢測下游的基因,,和的表達水平，表明參與ABA和非ABA途徑干旱基因的激活。因此，很可能是對環(huán)境適應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子，平衡非生物脅迫和生長周期。

基因；氣孔；干旱脅迫；ABA

植物生長在外界環(huán)境中，易受到多種環(huán)境因素的影響，其中干旱脅迫是植物生長發(fā)育過程中最重要的脅迫之一，也是作物減產(chǎn)的重要危害[1]。在干旱過程中，植物通過關(guān)閉氣孔，增加次生物質(zhì)合成減少對細胞的傷害，同時通過激活下游干旱應(yīng)答基因來減少對個體的脅迫傷害[2-3]。脫落酸（ABA）參與植物各個生長階段的生長和發(fā)育過程，包括種子發(fā)育、休眠、發(fā)芽和幼苗生長在內(nèi)的多個過程[4-6]。在ABA缺乏的時候，信號蛋白Sucrose nonfermenting 1 (SNF1)-related protein kinase 2 (SnRK2)的活性受PP2C磷酸酶抑制[7-8]。ABA存在時， PYR / PYL / RCAR受體感知并結(jié)合ABA，改變其構(gòu)象，解除PP2C對SnRK2s蛋白的抑制，SnRK2s被激活，促進氣孔關(guān)閉，并激活下游應(yīng)答基因的表達水平[9-10]。

RNA聚合酶II（RNA Pol II）最大亞基Rpb1的C末端結(jié)構(gòu)域(C-terminal domain , CTD)與RNA聚合酶II的功能至關(guān)重要。CTD 由七肽Y1S2P3T4S5P6S7的串聯(lián)重復(fù)組成[11-12]。 CTD序列的數(shù)量隨著生物體的復(fù)雜性而變化，從芽殖酵母中的26個到人類中的52個不等[11,13]。在轉(zhuǎn)錄起始時，第5位的絲氨酸被磷酸化，RNA聚合酶II被激活。當RNA聚合酶II離開啟動子后，出現(xiàn)了短暫的停留過程，在這個過程中，第5位絲氨酸磷酸化被去除[14]，第2位絲氨酸被磷酸化，轉(zhuǎn)錄進入延伸狀態(tài)。因此，CTD的磷酸化和去磷酸化對轉(zhuǎn)錄至關(guān)重要[12]。SSU72編碼一個去磷酸酶，從酵母至哺乳動物中都很保守。在酵母中SSU72主要去除轉(zhuǎn)錄過程中第5位CTD的磷酸化[14]。此外，還可以去除第7位CTD的磷酸化[15]。但在植物中，的研究較少。Tian等在2019年的研究結(jié)果表明，可以反向調(diào)節(jié)FCA與長非編碼RNA的結(jié)合，抑制位點的H3第27位甲基化的形成，抑制擬南芥()開花時間[16]。本研究以擬南芥為供試材料，通過模擬干旱條件，利用分子生物學(xué)等技術(shù)方法，研究在干旱脅迫應(yīng)答中的功能，以期了解植物在干旱脅迫時如何平衡干旱脅迫和生命周期。

1 材料與方法

1.1 材料

(SALK_120634) 和(SAILseq_ 588_A01.1)突變體來自于ABRC突變體庫, 擬南芥生長于22 oC中，光周期為16 h光照/8 h黑暗的溫室。

1.2 方法

1.2.1 葉片失水觀察 培養(yǎng)3～4周的擬南芥，取第5片葉20片，放在不同的稱量紙上，正面朝上10片，反面朝上10片，前1小時每15 min記錄1次葉片的重量，第2 至第3小時每隔30 min記錄1次，第4小時末記錄1次。將每次的稱重與新鮮葉片重量對比后，繪制葉片失水曲線。實驗設(shè)計3個重復(fù)。

1.2.2 氣孔開張度觀察 葉片氣孔觀察：20 mmol·L-1KCl，100 mmol·L-1CaCl2，100 mmol·L-1Mes-KOH按照193:2:5的比例配置氣孔buffer，將葉片朝上放置在氣孔buffer中，強光下照射2 h，隨后在不同氣孔buffer樣品內(nèi)加入不同濃度的ABA，繼續(xù)強光下照射2 h；用鑷子撕取表皮并在顯微鏡下進行觀察。

1.2.3 蛋白定位 參照Yoo等[17]的方法構(gòu)建擬南芥葉肉原生質(zhì)體；將SSU72蛋白的CDS構(gòu)建到PUC19-GFP載體中，并得到純度較高的質(zhì)粒。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入擬南芥原生質(zhì)體，黑暗培養(yǎng)10～12 h，于共聚焦顯微鏡 (ZEISS Xradia 810)下觀察。

表1 PCR和qRT-PCR的引物序列

1.2.4 RNA提取以及定量PCR分析 取生長16 d的野生型和突變體整株幼苗，并將幼苗根部的土清理干凈，放置于培養(yǎng)皿中，于22 ℃溫室中強光照射，干旱處理2 h。將干旱處理后的葉片放置于研缽中，加入液氮研磨至發(fā)白將干，采用Trizol （TransGen Bio-tech）試劑提取植物葉片總RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以SYBR superMix試劑盒（TransGen Bio-tech），利用定量PCR儀器(Bio-Rad)上擴增，以UBQ為內(nèi)參，并通過2–??Ct計算相對表達量。

2 結(jié)果與分析

2.1 ssu72突變體葉失水速率更快

為了研究的功能，我們獲得了2個T-DNA插入的突變體，基因型分析結(jié)果顯示，T-DNA插入位于第1個外顯子上(圖 1A和B)。RT-PCR結(jié)果顯示，這2個突變體是功能缺失性的突變體 (圖 1C)，并且具有早開花的表型（圖 1D）。通過離體葉片失水實驗顯示，突變體的失水速率更快，野生型葉片在空氣中暴露3 h，葉片重量約為初始重量的70%，而突變體葉片僅占初始葉片重量的50%左右(圖 1E)，表明突變體可能具有更大的氣孔。

A. SSU72基因的結(jié)構(gòu)示意圖(外顯子用黑色框表示，內(nèi)含子用直線表示，T-DNA的插入用三角形表示，用于基因型的檢測的引物用箭頭表示)；B. ssu72突變體的基因型鑒定； C. ssu72突變體中SSU72的轉(zhuǎn)錄水平；D. 長日照下，33 d的ssu72突變體的開花表型；E. 不同時間下，ssu72突變體葉片含水量（在空氣干旱處理后，不同時間葉片的重量與初始時的比值，SEM = 3）。

Figure 1 The characterization ofmutants, expression ofand the change of water content

A. 不同ABA濃度處理下ssu72突變體的氣孔大小示意圖；B. ssu72突變體的氣孔密度示意圖；C. 單位視野里ssu72突變體的氣孔密度統(tǒng)計(n≥ 50)；D. 不同ABA濃度處理下的ssu72突變體的氣孔大小統(tǒng)計(n≥ 50)。

Figure 2 The stomata number and size in wild type andmutants

2.2 SSU72參與氣孔大小的形成

為了驗證這一結(jié)果，我們分別觀察野生型和突變體葉表皮的氣孔大小，發(fā)現(xiàn)突變體氣孔開張度比野生型大(圖 2A)，而氣孔的密度并沒有明顯的變化 (圖 2 B和C)。表明SSU72通過調(diào)節(jié)表皮氣孔開張度的大小，影響葉片水分蒸騰的速率。進一步用不同濃度ABA處理，發(fā)現(xiàn)野生型和突變體的氣孔，隨著ABA濃度的增加，氣孔開張度都在減小 (圖 2A和D)，而突變體的氣孔的減小，要比野生型慢，表明SSU72功能缺失導(dǎo)致擬南芥失去對ABA的正常反應(yīng)。

2.3 SSU72編碼一個核定位蛋白

SSU72編碼一個CTD去磷酸酶，與酵母、哺乳動物中相應(yīng)蛋白具有高度的同源性(圖 3A)。為了進一步研究其功能，將SSU72與GFP融合，并轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體，在激光共聚焦顯微鏡下進行觀察，發(fā)現(xiàn)SSU72定位與DAPI信號高度一致，表明SSU72定位于細胞核中（圖 3B至D）。該實驗表明SSU72蛋白功能可能是保守的，即很可能通過去除CTD的磷酸化和RNA聚合酶II活性，進而調(diào)節(jié)相應(yīng)基因表達。

A. 釀酒酵母、擬南芥、智人、水稻、小鼠的SSU72蛋白序列比較；B. 擬南芥原生質(zhì)體中的SSU72與GFP融合的信號；C. DAPI染色信號；D. 二者重疊后的信號（Bar =10 μm）。

Figure 3 Comparison of SSU72 proteins from Arabidopsis with other species and its localization to the nucleus

圖4 非干旱和干旱脅迫下相關(guān)基因表達水平的檢測

Figure 4 Related gene mRNA levels with or without dehydration stress

2.4 SSU72激活下游的干旱誘導(dǎo)基因

為了驗證是否激活下游基因的表達，我們分別將野生型和突變體通過2 h的空氣干旱處理，并提取RNA，檢測下游的基因表達水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在突變體中，ABA通路的、和基因，在干旱前后，表達水平都有所下調(diào)；而非ABA通路中的和基因，同樣在干旱前后都有所下調(diào)，表明可能參與了ABA通路和非ABA通路。我們進而檢測了信號通路上游的基因、和，未發(fā)現(xiàn)明顯的變化，可能是由于SnRK2.2、SnRK2.3和SnRK2.6蛋白的活性，大多數(shù)情況下受翻譯后調(diào)控。此外，ABA合成的限速酶的表達水平也沒有發(fā)生明顯的變化（圖4）。

3 討論

植物為了有效地應(yīng)對干旱脅迫，啟動了一系統(tǒng)機制來適應(yīng)并逃避這一不利的局面，如合成多種次生物質(zhì)(脯氨酸)等，同時關(guān)閉氣孔并提前開花結(jié)實，維持下一代的繁衍[18]。前期研究顯示，擬南芥突變體具有早花的表型，SSU72抑制植物的開花時間；我們的研究則顯示突變體葉片失水速率更快且擁有更大的氣孔，在ABA脅迫下，SSU72促進氣孔的關(guān)閉。表明基因很可能是介導(dǎo)干旱脅迫和開花時間的重要調(diào)控因子，參與植物的開花時間和干旱脅迫途徑，從而增強對環(huán)境的適應(yīng)性。

SSU72磷酸酶在酵母到哺乳動物中都很保守，對于基因的轉(zhuǎn)錄是必需的，SSU72與轉(zhuǎn)錄因子IIB相互作用，轉(zhuǎn)錄因子IIB參與RNA聚合酶II前啟動復(fù)合物的形成[19-20]。在干旱脅迫過程中，一系列干旱應(yīng)答基因快速上調(diào)，而SSU72作為一個CTD磷酸化酶對RNA聚合酶II的延伸極為重要，我們的研究也證明擬南芥SSU72蛋白定位在細胞核中且與釀酒酵母、水稻和哺乳動物具有高度的同源性，表明擬南芥SSU72蛋白很可能與哺乳動物和酵母中的SSU72蛋白功能是類似的，但這一推測還需要更加復(fù)雜嚴謹?shù)膶嶒炞C實。我們還發(fā)現(xiàn)在突變體中，多個干旱基因在干旱脅迫過程中，轉(zhuǎn)錄水平不能有效地上調(diào)，很可能是由于的缺失而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄無法正常進行，但要證明這一點，還需要進一步解析如何特異地結(jié)合一系列干旱應(yīng)答基因，這需要進一步深入研究蛋白互作的網(wǎng)絡(luò)，找到將SSU72與干旱信號通路連接的蛋白。

ABA依賴的信號級聯(lián)由ABA受體對ABA的感應(yīng)引發(fā)，最廣泛的模型是PP2C和SnRK2激酶的相互作用，激活的SnRK2s磷酸化下游靶基因并觸發(fā)ABA誘導(dǎo)的生理反應(yīng)[21]。本研究結(jié)果表明，可能參與了ABA依賴的干旱信號通路，但同時在2.4結(jié)果中，非ABA信號通路的蛋白表達也有所下調(diào)，說明可能還參與了非ABA依賴的干旱信號通路。參與干旱通路可能是直接的也可能是間接的，還需要更多強有力的實驗證實。

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is involved in stomata development and dehydration stress

LIU Yanan, CHEN Lan, DING Yong

(School of Life Sciences, USTC Life Sciences and Medicine, Hefei National Laboratory for Physical Sciences at the Microscale, University of Science & Technology of China, Hefei 230027)

The plant physiological adaption including stomata closure and elevated ABA concentration is crucial for survival in response to dehydration stress, however, how plant balances the dehydration and life cycle remains unclear. Here, we reported thatencoding a C-terminal domain (CTD) phosphatase is involved in flowering time. The results showed that: under dehydration stress,, localized on the nucleus,was involved in dehydration stress, and the loss offunction displayed the larger stomata size and increase of the water loss. In addition, the stomata opening was hyposensitive to ABA treatment. The transcripts of dehydration response genes,,,and, were reduced inmutant with or without dehydration stress, indicatinmay activate drought stress response in ABA and non-ABA pathways. Together, our study provides a new insight thatmight be a novel factor involving in environmental adaptation, balancing abiotic stress and growth cycle.

; stomata; dehydration stress; ABA

Q945.78

A

1672-352X (2021)06-0873-05

10.13610/j.cnki.1672-352x.20220106.003

2022-1-7 8:01:56

[URL] https://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1162.S.20220106.1230.006.html

2021-04-08

安徽省大學(xué)協(xié)同創(chuàng)新計劃（GXXT-2019-033）和國家自然科學(xué)基金（32000242，32000241，31871278 和U19A2021）共同資助。

劉亞男，碩士研究生。E-mail：aianhong@163.com

通信作者:丁 勇，教授，博士生導(dǎo)師。E-mail：dingyong@ustc.edu.cn