閆航濱，趙維凡，湯夢(mèng)婷，周 育

黑茶茶湯中赭曲霉毒素A的提取與檢測(cè)方法

閆航濱，趙維凡，湯夢(mèng)婷，周 育*

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶樹(shù)生物學(xué)與資源利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 230036)

日常飲茶中，茶葉若因加工或貯藏不當(dāng)污染了一定量霉菌毒素，同時(shí)對(duì)于沖泡過(guò)程中的浸出率及實(shí)際的攝入量，仍欠缺深入了解。為建立茶湯中赭曲霉毒素A（OTA）的提取方法，為飲茶所攝入生物毒素的安全評(píng)估提供更合理的分析方法，研究使用乙腈作為提取溶劑提取茶湯中的OTA，然后加入鹽離子使乙腈和水相分層，去除雜質(zhì)后，以高效液相色譜法（HPLC）分析檢測(cè)，通過(guò)對(duì)比4種不同方法的準(zhǔn)確度、線性、精密度、靈敏度等指標(biāo)，選擇最合適于茶湯的檢測(cè)方法。結(jié)果表明，方法M4通過(guò)用含0.1%甲酸酸化乙腈提取，用氯化鈉和硫酸鎂使乙腈和茶湯分層，在準(zhǔn)確度、精密度、靈敏度等指標(biāo)上，均優(yōu)于其他3種方法。方法M4在茶湯中OTA添加濃度為1～45 μg·L-1時(shí)回收率為82.5%～99.8%，標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.4%～7.3%；該方法添加回收的回歸方程相關(guān)系數(shù)為0.9971。在日間和日內(nèi)驗(yàn)證試驗(yàn)中，高濃度毒素組日內(nèi)回收率為90.9%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.2%，日間回收率為87.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.2%；低濃度毒素組的日內(nèi)回收率為91.9%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.2%，日間回收率為92.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為6.7%；該方法的定量限為1.1 μg·L-1，檢出限為0.33 μg·L-1。不同類型黑茶茶湯驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該方法的回收率均高于88.65%。對(duì)比這4種方法，方法M4在分析結(jié)果上均好于其他3種方法，適合用于茶湯中OTA的檢測(cè)，該方法對(duì)于OTA在茶水沖泡過(guò)程中浸出情況及安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估有重要的參考意義。

茶湯；赭曲霉毒素；方法建立；高效液相色譜；方法驗(yàn)證

茶葉因富含茶多酚、茶氨酸等多種生物活性成分并具有較好的保健功效深受人們的喜愛(ài)。飲茶在我國(guó)，甚至世界上很多國(guó)家已經(jīng)成了一種健康的生活習(xí)慣[1-3]。后發(fā)酵黑茶加工過(guò)程離不開(kāi)微生物參與，尤其在渥堆發(fā)酵過(guò)程中來(lái)源于鮮葉及環(huán)境中的菌群對(duì)黑茶品質(zhì)及風(fēng)味的形成有重要作用。然而，這些土著微生物菌群對(duì)茶葉風(fēng)味形成具有重要貢獻(xiàn)的同時(shí)是否存在有害微生物及霉菌毒素的污染，也是一個(gè)值得關(guān)注的問(wèn)題。我國(guó)的茶葉加工企業(yè)具有數(shù)量多、規(guī)模小、生產(chǎn)質(zhì)量良莠不齊等鮮明特征。在一些中小企業(yè)，生產(chǎn)過(guò)程中因環(huán)境衛(wèi)生條件不適宜、渥堆發(fā)酵條件控制不當(dāng)或者生產(chǎn)、銷售過(guò)程中因貯藏條件不當(dāng)?shù)纫蛩卦斐傻挠泻ξ⑸镂廴倦y以避免[4-5]。發(fā)酵茶葉為一類次生代謝產(chǎn)物含量豐富的基質(zhì)，霉菌毒素污染問(wèn)題并不像花生、大米和玉米（富含脂肪、淀粉和蛋白質(zhì)）等農(nóng)產(chǎn)品那樣突出，但作為一種由自然發(fā)酵食品（飲品），其微生物的安全問(wèn)題仍需要高度重視[6]。

赭曲霉毒素A（OTA）是食物中最常見(jiàn)的霉菌毒素之一，它是由幾種曲霉菌（spp.）和青霉（spp.）產(chǎn)生[7]。有害霉菌的生長(zhǎng)及毒素產(chǎn)生，取決于許多因素，包括菌株生長(zhǎng)的溫度、濕度、食品基質(zhì)、含水量以及后續(xù)食品加工和儲(chǔ)存環(huán)境等[8-9]。赭曲霉毒素A已被國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)列為2B類致癌物（即可能對(duì)人類有致癌），同時(shí)也具有神經(jīng)毒性、腎毒性和免疫抑制作用[10]。研究顯示，發(fā)酵茶在不適當(dāng)?shù)募庸ず唾A藏環(huán)境有可能會(huì)有產(chǎn)毒曲霉和OTA的污染[11-15]。從現(xiàn)有的檢測(cè)結(jié)果來(lái)看，各類霉菌毒素在茶葉中的檢出率及陽(yáng)性樣品污染濃度呈“雙低”特點(diǎn)。關(guān)于茶葉中霉菌毒素檢測(cè)方法研究，主要集中于從干茶中直接提取霉菌毒素，并未考慮各類霉菌毒素水溶性和泡茶浸出率問(wèn)題。然而，茶葉有別于其他食品基質(zhì)，不直接食用。因此，研究茶湯中霉菌毒素的提取及檢測(cè)方法，對(duì)研究不同類型霉菌毒素在茶葉沖泡過(guò)程中的提取率及膳食攝入水平具有重要意義。QuEChERS（quick、easy、cheap、effective、rugged和safe）是近年來(lái)發(fā)展的一種用于農(nóng)藥快速提取方法，其原理為樣品經(jīng)乙腈或酸化乙腈提取后，采用鹽離子鹽析分層，以PSA（乙二胺-N丙基硅烷）和PVPP（聚乙烯吡咯烷酮）等試劑除去基質(zhì)中有機(jī)酸、色素、酚類等干擾物，以達(dá)到凈化目的[16-18]。本研究依據(jù)QuEChERS原理，對(duì)茶湯中OTA的不同提取方案進(jìn)行對(duì)比分析，建立茶湯中OTA最佳分析方法，以期為茶葉中OTA的膳食風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)、評(píng)估做技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料

黑茶茶樣：普洱熟茶（散茶）、六堡茶、安化黑茶、青磚茶、康磚茶和茯磚茶的茶樣均采購(gòu)自國(guó)內(nèi)的茶葉專門(mén)店或網(wǎng)上專賣店，每種茶樣收集均超過(guò)1.0 kg，常溫保存于干燥環(huán)境中。

1.2 試劑與儀器

本試驗(yàn)主要試劑包括：色譜純乙腈（純度>99.9%，美國(guó)TEDIA公司）；色譜純甲酸、乙酸（純度>98.0%，上海阿拉丁公司）；蒸餾水（香港屈臣氏公司）；氯化鈉（純度> 99.0%）、硫酸鎂（純度>98.0%）、檸檬酸鈉（純度> 98.0%）均購(gòu)買于上海生工生物公司；乙二胺-N丙基硅烷（PSA，純度> 98.0%）、聚乙烯吡咯烷酮（PVPP，純度> 98.0%）均為德國(guó)CNW Technologies公司產(chǎn)品。赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)品（20 μg·mL-1于甲醇，純度> 99.0%）為美國(guó)維康公司產(chǎn)品。

主要儀器包括：渦旋震蕩儀（德國(guó)依卡有限公司），微量移液器（德國(guó)Eppendorf公司），低溫高速離心機(jī)（美國(guó)sigma公司），離心濃縮儀（上海般諾），高效液相色譜儀（美國(guó)waters公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 茶湯的準(zhǔn)備 取5 g普洱（熟茶）茶樣于500 mL錐形瓶中，加入250 mL沸水浸泡5 min，冷卻至室溫，隨后用玻璃纖維濾紙過(guò)濾除去茶渣，取茶湯（每份20 mL）加入OTA渦旋混勻以備提取分析使用。

1.3.2 茶湯中赭曲霉毒素A的提取 依據(jù)QuEChERS方法原理，并參考Juan等[19]果汁中AFs（黃曲霉毒素）、OTA、AOH（交鏈孢酚）、AME（交鏈孢酚單甲醚）等霉菌毒素提取分析方法，設(shè)計(jì)并對(duì)比以下4種茶湯中OTA提取與檢測(cè)方法。

方法1（M1）：取20 mL茶湯，加入20 mL乙腈和3.0 g檸檬酸鈉，渦旋1 min，以5 000 r·min-1離心10 min，取上清，重復(fù)提取2次，合并上清，再加入0.8 g 檸檬酸鈉，0.8 g硫酸鎂，以5 000 r·min-1離心10 min，取上清10 mL，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至1.0 mL，用0.22 μm有機(jī)系濾膜過(guò)濾，然后經(jīng)HPLC檢測(cè)。

方法2（M2）：同M1處理，將檸檬酸鈉替換為氯化鈉。

方法3（M3）：取20 mL茶湯，加入20 mL乙腈和3.0 g氯化鈉，渦旋1 min，5 000 r·min-1離心10 min，取上清，重復(fù)提取2次，合并上清，再加入0.8 g 氯化鈉，0.8 g硫酸鎂，3 g PVPP，1.2 g PSA，5 000 r·min-1離心10 min，取上清10 mL，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至1.0 mL，用0.22 μm有機(jī)系濾膜過(guò)濾，然后經(jīng)HPLC檢測(cè)。

方法4（M4）：取20 mL茶湯，然后加入20 mL乙腈、20 μL甲酸和3.0 g氯化鈉，渦旋1 min后5 000 r·min-1離心10 min，取上清，重復(fù)提取2次，合并上清，再加入0.8 g 氯化鈉，0.8 g硫酸鎂，5 000 r·min-1離心10 min，取上清10 mL，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至1.0 mL，用0.22 μm有機(jī)系濾膜過(guò)濾，然后經(jīng)HPLC檢測(cè)。

1.3.3 HPLC檢測(cè)條件 色譜柱型號(hào)為ACE C18柱，250 mm × 4.6 mm，5 μm；流動(dòng)相：乙腈:2%乙酸水（50:50，）；進(jìn)樣量：5 μL；柱溫：38 ℃；流速：0.8 mL·min-1；熒光檢測(cè)器(FLD)：激發(fā)波長(zhǎng)：333 nm；發(fā)射波長(zhǎng)：460 nm。

1.3.4 檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 以HPLC流動(dòng)相配置1～100 μg·L-1標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行HPLC檢測(cè)，以O(shè)TA檢測(cè)濃度為x，以色譜峰峰面積為y，進(jìn)行線性擬合獲取OTA檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以及相關(guān)系數(shù)的平方（R2），以此標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各檢測(cè)樣本OTA檢測(cè)濃度。

1.4 方法學(xué)驗(yàn)證

方法驗(yàn)證所考慮的參數(shù)為：方法線性、靈敏度（檢測(cè)限和定量限）、準(zhǔn)確度（回收率）和精密度（重復(fù)性和重現(xiàn)性）。

（1）方法線性。取20 mL空白茶湯6份，分別加入OTA，使茶湯中毒素的終濃度為45、20、10、5、1和0 μg·L-1。每個(gè)濃度做6個(gè)重復(fù)，經(jīng)由4種方法提取檢測(cè)后，以O(shè)TA檢測(cè)濃度為x，以色譜峰峰面積為y，進(jìn)行線性擬合獲取檢測(cè)方法的線性方程，以及相關(guān)系數(shù)（R2），以相關(guān)系數(shù)來(lái)判斷檢測(cè)方法的線性關(guān)系，R2的值越接近1則方法的線性越好[18]。

（2）基質(zhì)效應(yīng)。取20 mL空白茶湯，分別用4種方法提取后，獲得每種方法提取后的茶湯基質(zhì)，分別用該方法提取的茶湯基質(zhì)配制OTA基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)照組用乙腈配制相同濃度的OTA溶劑標(biāo)準(zhǔn)?；|(zhì)標(biāo)準(zhǔn)和溶劑標(biāo)準(zhǔn)配制毒素濃度分別為100、50、20、10、5 和1 μg·L-1?；|(zhì)標(biāo)準(zhǔn)組和溶劑標(biāo)準(zhǔn)組均做3個(gè)重復(fù)。經(jīng)HPLC檢測(cè)后，以濃度為x，以色譜峰平均面積為y，建立回歸方程。基質(zhì)效應(yīng)以茶湯基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)方程的斜率與乙腈配制的溶劑標(biāo)準(zhǔn)方程的斜率比值，即公式（1）?；|(zhì)效應(yīng)結(jié)果在85%～115%，則可以認(rèn)為該基質(zhì)對(duì)目標(biāo)物的檢測(cè)無(wú)顯著性影響[19-21]。

基質(zhì)效應(yīng)(ME%)=(基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)方程的斜率/乙腈配制的溶劑標(biāo)準(zhǔn)方程的斜率)×100 （1）

（3）靈敏度。在20 mL空白茶湯中加入OTA至終濃度為5 μg·L-1，分別采用4種方法提取，以流動(dòng)相梯度稀釋，經(jīng)HPLC檢測(cè)后，以O(shè)TA信號(hào)響應(yīng)值和噪音值的比值來(lái)計(jì)算定量限（LOQ）和檢出限（LOD）。LOQ以O(shè)TA響應(yīng)值∶噪音值=10:1，LOD以O(shè)TA響應(yīng)值∶噪音值=3:1計(jì)算，LOQ和LOD越低，則該方法的靈敏度越高[20- 21]。

（4）準(zhǔn)確度。取20 mL空白茶湯5份，分別加入OTA，使茶湯中OTA的終濃度為45、20、10、5和1 μg·L-1，每個(gè)濃度做6個(gè)重復(fù)?；厥章视霉剑?）計(jì)算。

=(1×)/2（2）

式（2）中：—回收率；1—經(jīng)液相檢測(cè)的濃度（μg·L-1）；2—添加到茶湯中的濃度（μg·L-1）；—稀釋倍數(shù)。

（5）精密度。精密度驗(yàn)證試驗(yàn)中，設(shè)置高濃度（45 μg·L-1）和低濃度（5 μg·L-1）2個(gè)組的添加回收實(shí)驗(yàn)。每個(gè)濃度組每天做6個(gè)重復(fù)，且不連續(xù)重復(fù)5 d。根據(jù)實(shí)驗(yàn)日內(nèi)回收率和日間回收率以及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）的比值進(jìn)行比較分析，以此驗(yàn)證各方法的重復(fù)性和再現(xiàn)性。RSD的值越小，方法越可靠性越高（<15%為可接受范圍）[20-22]。

（6）方法適用性檢測(cè)。取不同類型黑茶茶樣，包括（六堡茶、安化黑茶、青磚茶、康磚茶和茯磚茶），用方法1.3.1獲得茶湯。取制備好的茶湯樣品20 mL，添加OTA使其茶湯中毒素濃度分別達(dá)到45 μg·L-1（高濃度組）和5 μg·L-1（低濃度組）并分別設(shè)置6個(gè)重復(fù)。以最佳提取檢測(cè)方法，驗(yàn)證該方法對(duì)各類型黑茶茶湯的適用性。

2 結(jié)果與分析

2.1 4種方法的線性分析

以普洱（熟茶）為研究材料的添加回收實(shí)驗(yàn)，4種不同方法（M1—M4）從普洱茶湯中提取的OTA經(jīng)HPLC分離，發(fā)現(xiàn)茶葉基質(zhì)中的同步提取物主要在2～6 min洗脫下來(lái)，而本研究中的OTA洗脫時(shí)間約為13 min。因此，4種方法的茶葉同步提取物與OTA可以較好分開(kāi)，不對(duì)OTA的定性及定量分析產(chǎn)生影響（圖1）。

OTA濃度為45 μg·L-1。

Figure 1 OTA chromatograms by four different extraction methods from Pu’er tea infusion

圖2 4種提取方法的線性回歸方程

Figure 2 The regression equations of four different OTA determination methods

表1 4種方法的線性

注：y：峰面積；x：濃度。

在樣本添加濃度為0～45 μg·L-1范圍以內(nèi)，以4種提取檢驗(yàn)方法的檢測(cè)值，計(jì)算獲得的回歸曲線及線性關(guān)系，結(jié)果如表1和圖2所示。方法M1—M4的相關(guān)系數(shù)的平方值（R2）分別為0.999 7、0.999 6、0.994 1和0.997 1。添加回收實(shí)驗(yàn)的分析結(jié)果顯示，4種不同方法添加回收率的線性關(guān)系值均大于0.99，即在0～45 μg·L-1濃度范圍內(nèi)，4種提取分析方法均具有良好的線性相關(guān)性，其中以方法M1和M2最佳[18]。

2.2 4種方法的基質(zhì)效應(yīng)與靈敏度

基質(zhì)效應(yīng)是指基質(zhì)對(duì)目標(biāo)分析物產(chǎn)生的干擾，從而影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。茶葉中含有大量的次級(jí)代謝產(chǎn)物如茶多酚、酚酸、色素等，這些物質(zhì)可以隨著OTA同步被提取出來(lái)，從而干擾OTA分析的準(zhǔn)確性。本試驗(yàn)中，茶湯提取物對(duì)4種方法的OTA檢測(cè)基質(zhì)效應(yīng)分別為94.3%、91.1%、95.4%和95.9%（表2），均在標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法可接受范圍[20-22]。同時(shí)，基質(zhì)效應(yīng)測(cè)試結(jié)果表明，方法M3和M4的茶湯機(jī)制效應(yīng)較小。

表2 4種方法提取基質(zhì)和乙腈配制的OTA標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

注：y：峰面積；x：濃度；STD，表示以乙腈配置的OTA標(biāo)準(zhǔn)品，ME，基質(zhì)效應(yīng)。

表3 4種方法添加不同濃度OTA的回收率（n=6）

表4 4種方法的日間精密度（n=30）和日內(nèi)精密度（n=6）

方法學(xué)測(cè)試結(jié)果顯示：方法M1—M4的LOD分別為0.44、0.39、0.38和0.33 μg·L-1；M1—M4的LOQ分別為1.48、1.31、1.27和1.10 μg·L-1。從4種方法檢出限來(lái)看，方法M4的檢出限與定量限最低，具有最高的方法靈敏度。Haas等[13]以HPLC方法檢測(cè)普洱茶葉中OTA含量，該方法中的LOD為0.5 μg·kg-1，稍高于本研究中的M4；Monbaliu等[23]以UPLC-MS/MS方法檢測(cè)茶葉中OTA含量，該方法中的LOD為2.6 μg·kg-1。然而，以HPLC方法檢測(cè)大米及其副產(chǎn)品中OTA含量，LOD僅為0.06 μg·kg-1[8]。以上分析顯示，液相色譜法檢測(cè)茶葉中 OTA的靈敏度高于液質(zhì)方法，但與大米等食品基質(zhì)相比，茶葉中OTA檢測(cè)靈敏度顯然偏高，該結(jié)果與茶葉或茶湯基質(zhì)效應(yīng)關(guān)系密切。

2.3 4種方法準(zhǔn)確度分析

添加不同濃度的OTA測(cè)試4種方法的回收率及標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果（表3）顯示方法M1在5個(gè)不同添加濃度下，回收率在70.5% ～77.9%之間，該結(jié)果未達(dá)到單個(gè)化合物添加回收率在80%～115%之間的基本要求[21-22]。方法M2在添加毒素濃度為45、20和10 μg·L-1條件下，回收率分別為81.5%、85.3%和91.6%，符合回收率基本要求；但是，在添加低濃度為5 和1 μg·L-1時(shí)回收率均低于80%，也未達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)。方法M3在各個(gè)濃度下的添加回收率僅在63.1%～76.1%之間，不符合標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)方法要求。相比而言，方法M4在5個(gè)不同的添加濃度下，回收率在82.5%～99.8%之間，在各濃度條件下均符合標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)方法要求，顯著優(yōu)于其他3種方法。同時(shí)4種提取檢測(cè)方法的標(biāo)準(zhǔn)偏差最高值為7.2%（方法M4），最低值為1.4%（方法M1）均在可接受范圍內(nèi)。相比于其他3種方法，方法M4之所以有更高準(zhǔn)確度和穩(wěn)定的回收率，可能與OTA在酸性環(huán)境下更易溶于有機(jī)提取劑密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Malir 等研究，在酸性條件下（pH < 7）OTA易轉(zhuǎn)移于有機(jī)提取相，更少殘留于茶湯或果汁水相結(jié)果一致[24]。

圖3 使用方法4(OTA濃度為45 μg·L-1）提取不同黑茶茶湯的色譜圖

Figure 3 OTA Chromatograms from different tea infusions extracted by method M4 (OTA concentration: 45 μg·L-1)

表5 不同黑茶茶湯毒素提取結(jié)果（n=6）

2.4 4種方法的精密度分析

檢測(cè)方法另一個(gè)重要的指標(biāo)即方法的精密度，代表了該方法的重復(fù)性和再現(xiàn)性。4種方法的精密度測(cè)試結(jié)果顯示，M4 > M2 > M1 > M3（表4）。方法M4在高濃度毒素組和低濃度毒素組，測(cè)試的日內(nèi)和日間回收率結(jié)果分別為90.9%、87.5%，91.9%和92.4%，該結(jié)果均優(yōu)于其他3種方法，且完全符合單個(gè)污染化合物分析測(cè)試要求。

同時(shí)，方法M4在高濃度毒素組和低濃度毒素組分析過(guò)程中，日內(nèi)和日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差結(jié)果分別為2.2%、3.2%，5.1%和6.7%，均在正常范圍內(nèi)（<15%）。從以上分析結(jié)果來(lái)看，方法M4在精密度測(cè)試方法中顯著優(yōu)于其他3種方法，尤其是方法M1和M3。因此，根據(jù)精密度測(cè)試結(jié)果，M4最適合于提取茶湯中OTA。

2.5 方法的適用性分析

以普洱（熟茶）茶湯為基質(zhì)，建立4個(gè)提取分析方法，根據(jù)以上方法學(xué)評(píng)估對(duì)比分析結(jié)果，方法M4是最適宜于普洱茶茶湯中OTA的提取與檢測(cè)。在此基礎(chǔ)上，本研究又同時(shí)選取六堡茶、青磚茶、安化黑茶、茯磚茶和康磚茶為測(cè)試材料，以普洱茶為對(duì)照，評(píng)估M4在其他后發(fā)酵黑茶中的適用性。結(jié)果顯示，以M4從6種發(fā)酵黑茶茶湯中提取的OTA經(jīng)HPLC分離，均可以與各自茶湯中同步提取物很好的分離，不會(huì)對(duì)OTA定性及定量分析產(chǎn)生影響（圖3）。HPLC色譜圖顯示，雖然不同黑茶茶湯基質(zhì)不影響OTA檢測(cè)分析，但各茶湯基質(zhì)有明顯差異，茶湯基質(zhì)出峰時(shí)間集中在2 ～6 min；青磚茶雜質(zhì)峰面積最大，茯磚茶和康磚茶較為相似，六堡茶雜質(zhì)峰面積較小。根據(jù)6種發(fā)酵黑茶雜質(zhì)峰分析，不同黑茶茶湯基質(zhì)有明顯差別。6種不同黑茶茶湯添加回收結(jié)果（表5）顯示，高濃度組回收率為88.65%～93.26%，低濃度組回收率為89.49%～102.15%；所有添加回收試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于6.15%。本試驗(yàn)中6種茶湯基質(zhì)，對(duì)以M4為提取方法的OTA檢測(cè)未產(chǎn)生顯著性干擾，添加回收試驗(yàn)表明M4普遍適用于黑茶茶湯中OTA檢測(cè)。但是，不同類型發(fā)酵茶因其茶葉原料、發(fā)酵工藝及參與微生物菌群皆有顯著的區(qū)別，在使用本方法前仍需要做具體的分析和方法學(xué)驗(yàn)證。

3 討論與結(jié)論

我國(guó)黑茶的消費(fèi)量?jī)H次于綠茶，且我們周邊國(guó)家（例如，蒙古國(guó)、俄羅斯、印度及東南亞）后發(fā)酵黑茶的消費(fèi)也十分的廣泛[16]。近幾年，由黑茶渥堆和貯藏過(guò)程中是否會(huì)發(fā)生有害微生物及霉菌毒素污染問(wèn)題引起了廣泛關(guān)注。這些問(wèn)題在引起老百姓飲茶憂慮同時(shí)，給發(fā)酵茶產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展也造成了一定影響[7-9]。我國(guó)并未發(fā)布茶葉、茶湯或茶飲料中OTA檢測(cè)方法，國(guó)標(biāo)GB 5009.96—2016中關(guān)于液體樣品檢測(cè)[25]，只包括植物油脂、醬油、醋、酒類的方法。2017年P(guān)allarés等通過(guò)分散液相微萃取方法，以液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC/MS-MS）檢測(cè)茶飲料中黃曲霉毒素和OTA等7種霉菌毒素[21]。Monbaliu等采用C18-SPE固相萃取柱凈化，建立草藥茶茶湯中霉菌毒素 UPLC-MS/MS檢測(cè)方法[23]。其他研究主要為干茶葉中霉菌毒素的提取分析，關(guān)于后發(fā)酵黑茶茶湯中OTA的檢測(cè)還未有所涉及[14-15, 20, 26]。

近年來(lái)，關(guān)于發(fā)酵黑茶中OTA污染研究也陸續(xù)開(kāi)展。陳秋娥等檢測(cè)分析了44種普洱茶樣品，均未檢出OTA的污染[11]；王鷺等檢測(cè)了市售20種各類茶葉樣品，也未檢出OTA污染[12]。Haas等檢測(cè)了36種普洱茶樣品，發(fā)現(xiàn)4份茶葉樣品檢出OTA，含量分別為0.65、0.65、14.8和94.7 μg·kg-1，參考我國(guó)食品中OTA限量范圍，其中兩份樣品含量超過(guò)可接受范圍[13]；Ye等檢測(cè)了108個(gè)發(fā)酵茶樣品，發(fā)現(xiàn)2份樣品檢測(cè)出OTA，含量分別為5.9和36.4 μg·kg-1，1個(gè)樣品超出食品中OTA污染可接受水平[14]；Cui等檢測(cè)了158種后發(fā)酵茶樣品，兩個(gè)樣品檢出黃曲霉毒素B1，濃度為2.07和1.24 μg·kg-1 [15]。Ye[14]和Cui[15]等根據(jù)所測(cè)定的樣品污染水平及膳食攝入數(shù)據(jù)，分別作了6大類霉菌毒素和4種黃曲霉毒素風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，結(jié)果顯示發(fā)酵黑茶的霉菌毒素膳食風(fēng)險(xiǎn)暫不構(gòu)成可以預(yù)見(jiàn)的食品安全風(fēng)險(xiǎn)。

從目前的研究報(bào)道來(lái)看，茶葉（主要為發(fā)酵黑茶）中OTA及其他霉菌毒素檢測(cè)結(jié)果，整體呈檢出率低及污染水平低的“雙低特點(diǎn)”，但是可靠的檢測(cè)方法才是檢測(cè)結(jié)果的基本保證。同時(shí)關(guān)于以上這些研究，一個(gè)值得注意的問(wèn)題是茶葉與其他食品基質(zhì)不同，茶葉攝入方式為茶湯飲用，茶葉本身直接攝入或與其他食品加工后直接食用比例很小。本實(shí)驗(yàn)及相關(guān)研究所涉及的赭曲霉毒素和黃曲霉毒素等水溶性較低，在茶葉沖泡過(guò)程中有多少毒素可以通過(guò)茶水沖泡浸出尚不清楚。因此，進(jìn)一步研究茶湯中各類霉菌毒素提取方法及在茶水沖泡過(guò)程中的浸出率，對(duì)充分了解發(fā)酵茶葉中霉菌毒素膳食風(fēng)險(xiǎn)有重要意義。

本研究依據(jù)QuEChERS基本原理，對(duì)普洱茶湯中4種OTA提取檢測(cè)方法完成對(duì)比分析。通過(guò)4種方法的線性、靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度同步比較，確定以含0.1%甲酸酸化乙腈提取、氯化鈉和硫酸鎂分層的方法M4為最佳提取檢測(cè)方法。不同茶湯基質(zhì)測(cè)試結(jié)果顯示，該方法在六堡茶、青磚茶、安化黑茶、茯磚茶和康磚茶等5種后發(fā)酵茶湯中也具有適用性。本方法可以對(duì)茶湯提取物進(jìn)行離心濃縮，檢測(cè)痕量的OTA污染，對(duì)后發(fā)酵黑茶茶湯OTA檢測(cè)，霉菌毒素在茶湯中浸出率研究及更準(zhǔn)確的膳食風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估有重要意義。

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Extraction and detection of ochratoxin A in dark tea infusions

YAN Hangbin, ZHAO Weifan, TANG Mengting, ZHOU Yu

(State Key Laboratory of Tea Plant Biology and Utilization, Anhui Agricultural University, Hefei 230036)

In daily tea drinking, the tea leaves may be contaminated with a certain amount of mycotoxins due to improper processing or storage, meanwhile, we still lack of understanding of the mycotoxin migration rate and actual intake during the tea brewing process. Therefore, we aim to establish a method for the extraction and detection of ochratoxin A (OTA) in tea infusions, so as to make an appropriate safety assessment of biotoxins ingested through tea infusion. In this study, acetonitrile was used as major solvent to extract OTA in tea infusions, and different salt ions were added to separate acetonitrile and aqueous phase. The supernatant was cleaned and analyzed by HPLC (high performance liquid chromatography), four extraction methods were established and compared, and the most appropriate method was selected by evaluation of the accuracy, linearity, precision, sensitivity and other indicators. As results, method 4, which was extracted with acetonitrile containing 0.1% formic acid and separated the acetonitrile and aqueous phase with sodium chloride and magnesium sulfate, obtained the best results. Method validation of method 4 showed that recovery was between 82.5% and 99.8%, the standard deviation was 1.4% - 7.3%, and the correlation coefficient of the determination method was 0.997 1. In high-concentration fortified group, the intra-day recovery was 90.9%, and the relative standard deviation (RSD) was 2.2%; the inter-day recovery was 87.5% and the RSD was 3.2%. In low-concentration fortified group, the intra-day recovery was 91.9% and the RSD was 5.2%; the inter-day recovery was 92.4% and the RSD was 6.7%. The limit of quantification of the method was 1.1 μg·L-1, and the detection limit was 0.33 μg·L-1. Evaluation results of different types of dark tea infusions showed that the recovery rates of the method were all higher than 88.65%. In conclusions, by comparison of the four developed methods, method 4 is better than the other three methods, and it is suitable for the detection of OTA in tea infusions. The method developed in this study is of great significance for OTA migration rate evaluation from dry tea to tea infusions and appropriate risk assessment.

tea infusion; ochratoxin A; method establishment; HPLC; method validation

TS272

A

1672-352X (2021)06-0997-08

10.13610/j.cnki.1672-352x.20220106.010

2022-1-6 18:03:02

[URL] https://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1162.S.20220106.1253.020.html

2021-03-16

安徽省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（202004h07020007）資助。

閆航濱，碩士研究生。E-mail：1072735383@qq.com

通信作者:周 育，教授，博士生導(dǎo)師。E-mail：microbes@ahau.edu.cn