張迪 ，任立飛 ，劉廣彬 ，羅伏青 ，張文浩 ，王天佐 *

（1. 中國科學院植物研究所，北京100093；2. 中國科學院大學生命科學學院，北京100049；3. 青島科技大學機電工程學院，山東青島266061；4. 袁隆平農(nóng)業(yè)高科技股份有限公司，湖南長沙410001）

隨著我國居民生活水平的提高，肉蛋奶等動物性食品消費不斷增加，畜牧業(yè)迎來了快速發(fā)展。然而，我國現(xiàn)有的飼草產(chǎn)量遠遠不能滿足需求，大力發(fā)展優(yōu)質(zhì)牧草人工草地是推動草牧業(yè)發(fā)展的當務之急，亟需優(yōu)質(zhì)牧草種子作為基礎(chǔ)［1］。苜蓿屬（Medicagosp.）牧草營養(yǎng)豐富、產(chǎn)量較高，在世界范圍內(nèi)廣泛種植，被稱為“牧草之王”［2］。一般而言，田間收獲的苜蓿種子濕度較大，含水量約在20%～40%［3］。根據(jù)國家牧草種子標準，苜蓿屬牧草種子入庫前含水量不應超過13%［4］，否則將影響種子活力。因此，苜蓿種子收獲后的干燥處理十分關(guān)鍵。目前，我國苜蓿種子干燥主要采用自然晾曬的方式，效率低，容易受天氣影響。近年來發(fā)展起來的機械設備干燥支持連續(xù)烘干，干燥效率高，受天氣影響小，可以極大程度地降低種子新陳代謝速度，從而能較長時間地保持種子品質(zhì)和活力，同時在烘干過程中還能促使種子后熟［5-6］。然而，設備干燥也存在烘干溫度控制復雜，容易影響種子發(fā)芽率的缺點［7-9］。

隨著現(xiàn)代分析技術(shù)及生物信息學的發(fā)展，組學技術(shù)已經(jīng)成為分析生物學問題的有效手段［10］。代謝組學通過利用先進的分析檢測儀器，結(jié)合模式特征識別等分析方法對代謝產(chǎn)物進行定性和定量分析，來監(jiān)測代謝物隨時間變化的規(guī)律［11］。代謝物反映了植物系統(tǒng)末端的生化活動，揭示了已經(jīng)發(fā)生的生物學事件。相對其他組學技術(shù)而言，代謝組學更能反映植物體的生理和生化狀態(tài)。因此，代謝組學被廣泛應用于植物生物學及其相關(guān)領(lǐng)域的研究中［12］。許慶方等［13］利用代謝組學分析測定了苜蓿青貯過程中的有機酸，證實了高效液相色譜法測定的實用性與快捷性。Zhang 等［14］利用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜對苜蓿中的阿特拉津進行了分析，表明其可以通過不同的途徑降解。范文強等［15］利用類似方法分析了不同生育時期苜蓿葉片中代謝物的變化，發(fā)現(xiàn)了27 個差異代謝物，得出中花期收獲的苜蓿更宜青貯，而現(xiàn)蕾期收獲的苜蓿更宜調(diào)制干草的結(jié)論。然而，運用該方法分析苜蓿種子干燥過程中代謝物變化的相關(guān)研究還未見報道。本研究采用非靶向代謝組學方法，利用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS）技術(shù)，研究了不同干燥方式處理下苜蓿種子中代謝物的變化，以揭示高溫造成種子發(fā)芽率降低的原因，以期為優(yōu)質(zhì)苜蓿種子生產(chǎn)提供科學的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及干燥方式

本研究使用的苜蓿材料為中國科學院植物研究所培育的中科1 號黃花苜蓿（Medicago falcata）新品系。

本研究涉及數(shù)種苜蓿種子材料，分別為新鮮種子、自然干燥種子、不同溫度干燥的種子。新鮮種子為新采集的苜蓿種子，含水量為25%；自然干燥采用傳統(tǒng)的自然晾曬的方式進行露天干燥；不同溫度干燥采用設備進行熱風干燥，風速0.5 m·s-1，相對濕度20%；不同的干燥方式均將新鮮種子干燥至10%含水量。

1.2 種子萌發(fā)試驗

將種子置于濾紙上測定萌發(fā)率。培養(yǎng)條件為20 ℃恒溫，每天16 h 光照，光照強度150 μmol·m-2·s-1，胚根突破種皮與種子直徑長相等時判定為萌發(fā)。每天記錄發(fā)芽種子數(shù)，培養(yǎng)12 d 后，結(jié)束發(fā)芽試驗。試驗設置4 個重復，每個重復50 粒種子。種子萌發(fā)率=發(fā)芽種子數(shù)/種子總數(shù)×100%。

1.3 代謝組材料處理及代謝物提取

將新鮮種子、自然干燥種子、39 ℃干燥種子和65 ℃干燥種子4 組樣品用液氮研磨，使用50%甲醇緩沖液在室溫下提取10 min，將提取混合物在-20 ℃下儲存過夜，以5000 r·min-1離心20 min 后，將上清液轉(zhuǎn)移至新的96 孔板中。取等量制備好的試驗樣本混合物10 μL 來制成質(zhì)控樣品［16］。進行HPLC-MS 分析之前，將樣品存儲在-80 ℃。該試驗于2019 年完成，設置6 個重復。

1.4 液相色譜-質(zhì)譜分析

使用高效液相色譜系統(tǒng)的ACQUITY UPLC T3 色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm，Waters，UK）進行反相分離。柱箱保持在35 ℃，流速為 0.4 mL·min-1，流動相由溶劑A（水，0.1%甲酸）和溶劑B（乙腈，0.1%甲酸）組成。梯度洗脫條件設定為：0～0.5 min，5%溶劑B；0.5～7 min，5%至100%溶劑B；7～8 min，100%溶劑B；8～8.1 min，100%至5%溶劑B；8.1～10 min，5%溶劑B；流動相剩余部分為溶劑A。每個樣品的進樣量為4 μL。樣品經(jīng)HPLC 分離后，利用高分辨率串聯(lián)質(zhì)譜儀（TripleTOF 5600 plus，美國AB Sciex 公司）檢測從色譜柱洗脫的代謝物。

1.5 數(shù)據(jù)處理

利用 ProteoWizard 軟件將原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成mzML 格式后，采用XCMS 程序進行峰對齊、保留時間校正和峰面積提取，利用開源軟件metaX 對檢測到的代謝物的一級質(zhì)荷比進行KEGG（kyoto encyclope?dia of genes and genomes，京都基因與基因組百科全書）數(shù)據(jù)庫匹配，得到一級鑒定結(jié)果；再利用代謝物二級質(zhì)譜圖譜庫，與樣品的代謝物二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行匹配，得到二級質(zhì)譜代謝物鑒定結(jié)果。

使用檢測到的代謝物含量和試驗所用的樣品重量計算樣品中的各種代謝物濃度，進行聚類分析和主成分分析。取偏最小二乘回歸分析法得到的變量權(quán)重值VIP＞1，并結(jié)合T檢驗（P＜0.05）來篩選差異表達代謝物。試驗的比較組設置如表1 所示。

表1 比較組設置Table 1 Comparison groups

2 結(jié)果與分析

2.1 不同干燥方式對苜蓿種子萌發(fā)率的影響

不同干燥方式處理下苜蓿種子萌發(fā)率如圖1 所示，與自然干燥相比，39 ℃干燥并沒有影響種子萌發(fā)率，但隨著干燥溫度的升高苜蓿種子發(fā)芽率呈顯著下降趨勢，65 ℃干燥可使苜蓿種子萌發(fā)率下降到50%左右。

2.2 代謝物鑒定

一級質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫里存在很多同分異構(gòu)體，即一級鑒定結(jié)果存在多個相同質(zhì)荷比對應多個代謝物的情況。因此，本分析利用代謝物二級質(zhì)譜圖譜庫，與樣品的代謝物二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行匹配，同時對所檢測到的特征代謝物進行歸類，統(tǒng)計結(jié)果如表2。結(jié)果表明，檢測到最多的代謝物為脂類及類脂分子，其他依次為有機酸及其衍生物、苯丙酸和聚酮、有機雜環(huán)化合物、有機氧化合物、苯環(huán)型化合物、核苷、核苷酸及類似物、有機氮化合物、生物堿及其衍生物和磺胺嘧啶，另有59 種代謝物未能分類。

2.3 代謝物定量

使用不同處理下代謝物濃度差異進行樣品間相似性聚類，結(jié)果發(fā)現(xiàn)39 ℃干燥和自然干燥造成的變化最相近，其次是新鮮種子，65 ℃干燥造成的代謝變化與其他3 組差異最大（圖2a）。通過對代謝物的主成分分析可知，本試驗的4 組材料的6 個重復分布相對集中，說明本試驗重復性好，試驗數(shù)據(jù)準確，此外主成分分析也得出了類似的結(jié)果，即39 ℃干燥和自然干燥相似性最高，與65 ℃干燥差異最大（圖2b）。

表2 識別到的代謝物分類Table 2 Classification of identified metabolites

圖2 4 組苜蓿種子代謝物差異強度（a）及主成分分析（b）Fig.2 Heatmap of differential metabolites（a）and principal component analysis（b）

2.4 差異代謝物識別

該試驗采用單變量分析差異倍數(shù)和T檢驗進行BH 校正得到q 值，結(jié)合多變量統(tǒng)計分析偏最小二乘回歸分析法得到的VIP 值，來篩選差異表達的代謝物。差異代謝物需同時滿足ratio≥2 或者 ratio≤1/2；q≤0.05；VIP≥1。最終鑒定到的差異代謝物數(shù)目如圖3所示，65 ℃干燥相對新鮮種子差異代謝物最多，為30種。此外，65 ℃干燥處理相對自然干燥和39 ℃干燥分別產(chǎn)生了22 和21 種差異代謝物。其他比較組識別的差異代謝物較少。

圖3 差異代謝物數(shù)目Fig.3 Number of differential metabolites

進一步分析各比較組中差異代謝物的種類，并進行特異和共有差異代謝物的分析（表3）。在自然晾曬過程中（A 比較組），種子代謝物中的有機雜環(huán)物質(zhì)、脂類和類脂分子、苯基丙烷和聚酮化合物發(fā)生了變化。39 ℃干燥使種子代謝物產(chǎn)生的變化與自然干燥較為類似，除上述物質(zhì)發(fā)生變化外，又產(chǎn)生了有機酸及衍生物的變化。然而，65 ℃干燥產(chǎn)生的差異代謝物較多，除上述種類的差異代謝物均被識別外，還發(fā)現(xiàn)了核苷、核苷酸及類似物的差異。從另一方面，相對自然干燥，39 ℃干燥僅產(chǎn)生了有機酸及衍生物的變化。而65 ℃干燥產(chǎn)生了有機雜環(huán)物質(zhì)、有機氧化物質(zhì)、有機酸及衍生物、脂類和類脂分子以及核苷、核苷酸及類似物的變化。

KEGG 通路富集分析是探究所研究的生物學過程中相關(guān)代謝通路的有效方法。分析發(fā)現(xiàn)，65 ℃干燥相對自然干燥對種子嘌呤代謝途徑影響最大，造成了10 個代謝物的含量變化，分別為腺苷、磷酸腺苷、3′-磷酸腺苷、2′，3′-環(huán)磷酸腺苷、脫氧腺苷、鳥苷、磷酸鳥苷、3′-磷酸鳥苷、2′，3′-環(huán)磷酸鳥苷、3′，5′-環(huán)磷酸鳥苷，其中除脫氧腺苷含量下降外，其他9 種代謝物含量均上調(diào)（圖4）。

3 討論

3.1 不同干燥溫度對種子發(fā)芽率的影響

合理的干燥溫度對種子烘干的質(zhì)量影響極大［17］。張銀［18］指出，在種子干燥過程中糧堆溫度大于34 ℃時，種子發(fā)芽率下降，并且干燥時間越長，發(fā)芽率越低。郭艷麗［19］在研究棉花（Gossypiumspp.）種子的烘干過程中發(fā)現(xiàn)，當種子溫度高于60 ℃后，溫度越高發(fā)芽率下降越多，爛種率也越高。王立超等［20］研究發(fā)現(xiàn)，青岡櫟（Cyclobala?nopsis glauca）種子在不同烘干溫度處理下發(fā)芽率差異顯著，隨著烘干溫度從30 ℃增加至150 ℃，青岡櫟種子發(fā)芽率從69.2% 降低到7.5%。使用過高的溫度干燥可使種子蛋白質(zhì)變性，造成種子的內(nèi)在傷害，種子活力下降［21-22］。本試驗研究結(jié)果與上述研究類似，當苜蓿種子的烘干溫度超過39 ℃時，種子發(fā)芽率明顯下降，而65 ℃烘干種子的發(fā)芽率只有50%左右。由此可見，高溫對于種子活力存在較大的負面影響，確定合理的烘干溫度對種子生產(chǎn)十分必要。

表3 不同比較組共有和特異的差異代謝物Table 3 The common and specific differential metabolites among comparison groups

續(xù)表3 Continued Table 3

3.2 差異代謝物的功能和變化的原因

正常情況下，植物體內(nèi)的各項代謝及生理生化過程處于穩(wěn)態(tài)，而當植物遭遇逆境脅迫時，植物體內(nèi)會發(fā)生一系列代謝活動的變化［23］。對于牧草種子生產(chǎn)而言，過高的溫度會對種子發(fā)芽率造成負面影響［24-25］，其原因可能為高溫影響了種子的新陳代謝［19］。

核苷酸是DNA 和RNA 合成的原料，核苷酸代謝在生命活動中發(fā)揮著重要作用［26］。Mittler 等［27］研究發(fā)現(xiàn)高溫脅迫下擬南芥（Arabidopsis thaliana）細胞中的核酸會發(fā)生不同程度降解。朱傳應等［28］研究高溫脅迫對荒漠植物花花柴（Karelinia caspica）大分子結(jié)構(gòu)的影響，發(fā)現(xiàn)45 ℃處理花花柴8 h 后RNA 開始降解，12 h 時花花柴DNA明顯降解。以上結(jié)果說明，高溫會造成植物細胞中核酸的降解。本研究發(fā)現(xiàn)核苷、核苷酸及類似物是高溫干燥造成的種子差異代謝物中最大的一類，KEGG 通路分析也顯示65 ℃高溫干燥對種子嘌呤代謝途徑影響最大。本研究推測高溫使苜蓿種子核酸降解，引起了核苷酸代謝的變化，進而影響了苜蓿種子活力。

高溫脅迫會打破植物體內(nèi)自由基的產(chǎn)生與消除的平衡，導致膜脂過氧化作用，進而引起膜脂的解體，對細胞造成傷害［29］。本試驗發(fā)現(xiàn)，相對新鮮種子，高溫干燥會使苜蓿種子的脂類及類脂分子發(fā)生變化，由此推測高溫干燥會對苜蓿種子細胞膜造成傷害進而影響種子活力。

脯氨酸是植物體內(nèi)的一種保護物質(zhì)，通常逆境脅迫下，植物體內(nèi)可通過脯氨酸的積累來抵抗外部的刺激［30］。 鄭婷［31］對植物藥薤白（Allium macrostemon）進行研究發(fā)現(xiàn)，相對于新鮮樣本，3 種干燥方式（曬干、凍干、陰干）干燥的材料中脯氨酸含量均有不同程度的增加。周中亮等［32］研究也發(fā)現(xiàn)，高溫脅迫處理下高羊茅（Festucaarundinacea）的游離脯氨酸含量明顯升高。以上結(jié)果表明，高溫脅迫下植物可以通過脯氨酸的積累響應逆境脅迫。本試驗研究結(jié)果與此類似，在本研究的3 個比較組C、E、F 中，含有脯氨酸的二肽（異亮氨酸-脯氨酸、苯丙氨酸-脯氨酸、纈氨酸-脯氨酸）增加，推測這些產(chǎn)生變化的物質(zhì)為苜蓿種子響應高溫所產(chǎn)生的保護物質(zhì)。

4 結(jié)論

本研究利用高效液相色譜串聯(lián)高分辨率質(zhì)譜儀，對不同干燥方式下的苜蓿種子進行了代謝組的檢測，探究了不同干燥方式處理對種子發(fā)芽率造成影響的原因。結(jié)果表明，較低的溫度干燥產(chǎn)生的苜蓿種子代謝物變化與自然干燥類似，過高的溫度干燥造成苜蓿種子代謝物發(fā)生較大變化，主要為核苷、核苷酸及類似物，脂類及類脂分子等，這可能是高溫造成種子萌發(fā)率降低的原因。本研究從代謝的角度解析了高溫造成種子活力降低的原因，為苜蓿種子干燥設備的設計提供了理論基礎(chǔ)。