李蔣偉，王志有，侯生珍，雷云，賈建磊，周力，桂林生

（青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，青海西寧810016）

反芻動物瘤胃內(nèi)微生物主要由細(xì)菌、原蟲和厭氧真菌以及少量的噬菌體組成，其中細(xì)菌的種類和數(shù)量最高，根據(jù)功能差異可分為纖維降解菌、蛋白質(zhì)降解菌、脂肪降解菌、半纖維素降解菌、乳酸菌和淀粉降解菌，在瘤胃各項功能中扮演著重要角色［1］。瘤胃中，不同種類菌群之間都處于動態(tài)平衡，它們互相依存又互相制約。宿主為瘤胃微生物提供適宜的生存環(huán)境，同時為其增殖提供必要的營養(yǎng)成分；而瘤胃微生物能夠消化宿主無法利用的植物性飼料，由此可見宿主與瘤胃微生物之間屬于共生關(guān)系［2］。

反芻動物瘤胃微生物區(qū)系的變化受諸多因素的影響，如動物年齡、品種、飼料、健康狀況等，其中日糧組成對其影響最為顯著。反芻動物對粗飼料的需求很大，粗飼料中含有大量的纖維素，這些纖維物質(zhì)主要靠瘤胃細(xì)菌中纖維降解菌的作用分解消化［3］。在高粗飼料日糧的飼喂下，反芻動物瘤胃中優(yōu)勢菌群為革蘭氏陰性菌，纖維素分解菌中白色瘤胃球菌和黃化瘤胃球菌最具優(yōu)勢，隨日糧精料的添加，革蘭氏陰性菌的數(shù)量逐漸降低，革蘭氏陽性菌的比例漸漸升高［4］。Mackie 等［5］利用選擇性培養(yǎng)基滾管計數(shù)得到低精料日糧飼喂下，淀粉分解菌的比例為1.6%，乳酸利用菌比例為20%，當(dāng)迅速轉(zhuǎn)為高精料時，淀粉分解菌增加到21.2%，乳酸利用菌比例上升到22.3%，由此現(xiàn)象可知，淀粉分解菌受日糧影響顯著，而乳酸利用菌相對不明顯。王海榮［6］發(fā)現(xiàn)日糧精粗比對真菌數(shù)量影響差異不顯著，隨精粗比例增加纖毛蟲數(shù)量增加。

16S rDNA 高通量測序技術(shù)利用其在不同菌種中序列的多樣性進(jìn)而鑒定菌種的類別［7］，而使用高通量測序技術(shù)測定不同精粗比日糧對藏羊瘤胃組織形態(tài)及微生物菌群分布鮮有報道。本試驗旨在探究早期斷奶藏羔羊育肥期日糧適宜的精粗配比，測定藏羊瘤胃組織形態(tài)的變化規(guī)律和微生物分布特征，分析不同精粗比日糧對育肥藏羊瘤胃發(fā)育及菌群定植的影響，為藏羊日糧的合理配制和科學(xué)飼養(yǎng)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗時間和地點(diǎn)

2019 年5 月15 日-8 月25 日，在青海省海南州共和縣切吉鄉(xiāng)哇合村青海香咔梅朵牧業(yè)有限公司進(jìn)行動物飼養(yǎng)試驗；2019 年9 月16 日瘤胃樣品交由百邁克生物科技公司進(jìn)行瘤胃微生物16S rDNA 基因的測序工作。

1.2 試驗設(shè)計及飼養(yǎng)管理

選擇健康、體況相近的早期斷奶藏羊母羔共 210 只［（22.18±1.03）kg］，隨機(jī)分成 7 組，每組 30 只。7 組羔羊分別飼喂精粗比為 20∶80（A 組）、30∶70（B 組）、40∶60（C 組）、50∶50（D 組）、60∶40（E 組）、70∶30（F 組）和 80∶20（G組）的日糧；日糧精粗比為干物質(zhì)比，各組精飼料完全一致，粗飼料由燕麥（Avena sativa）青干草與燕麥青貯按干物質(zhì)比例1∶1 混合而成。飼養(yǎng)試驗預(yù)飼期為10 d，正試期為90 d。因藏羊未有現(xiàn)行飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)，故參考NY/T 816-2004 中國肉羊飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)［8］進(jìn)行日糧配制，精飼料組成及營養(yǎng)水平如表1。

表1 精飼料組成及營養(yǎng)水平Table 1 Composition and nutrition level of refined feed（%）

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗羔羊全舍飼分欄飼養(yǎng)，分別于早晨8：30 和下午16：30 飼喂羔羊兩次，日糧自由采食，自由飲水，每天飼喂前清掃殘留飼料并稱重。每天中午12：30 定期清掃羊舍，保持羊舍衛(wèi)生、通風(fēng)和干燥，每周對羊舍和運(yùn)動場進(jìn)行兩次消毒殺菌。試驗期對羔羊進(jìn)行羊四聯(lián)、小反芻獸、口蹄疫和羊痘等疫苗的免疫注射，分別用伊維菌素和溴氰菊酯淋浴進(jìn)行內(nèi)外寄生蟲防治。

1.4 樣品采集和處理

飼養(yǎng)試驗結(jié)束后，每組中隨機(jī)抽取3 只羔羊于清晨空腹屠宰，采集瘤胃背囊組織5 cm2，投入10%甲醛溶液固定；在不同位點(diǎn)取瘤胃液于50 mL 離心管中，混勻、過濾后將濾液3500 r·min-1離心15 min，投入液氮，于實驗室-80 ℃冷凍保存。

1.5 瘤胃組織分析方法

從采集的瘤胃組織中取材，經(jīng)30%葡萄糖溶液脫水24 h，OCT 包埋劑包埋后用低溫恒溫冷凍切片機(jī)（25 mL香柏油中性樹膠，上海）進(jìn)行冷凍，切10 μm 厚度切片，于陰涼干燥處晾干24 h，用蘇木精-伊紅（hematoxylin-eo?sin，HE）染色，完成后用中性樹膠固封，于陰涼干燥處晾干24 h，制成組織切片。以O(shè)lympusCX51 顯微鏡（日本）、OlympusDP21 圖像采集和Image-Pro Plus 5.1 圖像分析系統(tǒng)觀察測量瘤胃角化層、肌肉層厚度，乳頭長度、寬度及密度。

1.6 瘤胃液細(xì)菌微生物分析方法

本試驗16S rDNA 高通量測序部分交由百邁客生物科技有限公司測定，對采集到的21 個瘤胃液樣品基于Il?lumina HiSeq 測序平臺，采用雙末端測序（Paired-End）的方法，構(gòu)建小片段文庫進(jìn)行測序，進(jìn)一步對Reads 拼接過濾，OTUs 聚類分析，物種注釋及豐度分析。使用DNA 提取試劑盒（Invitrogen?，USA）提取瘤胃微生物基因組DNA，根據(jù)保守區(qū)設(shè)計得到引物，其中通用引物正向：5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′，反向：3′-GGAC?TACHVGGGTATCTAAT-5′。在引物末端加上測序接頭，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增并對其產(chǎn)物進(jìn)行純化、定量和均一化形成測序文庫，建好的文庫先進(jìn)行文庫質(zhì)檢，質(zhì)檢合格的文庫進(jìn)行高通量測序，進(jìn)而得到原始圖像數(shù)據(jù)文件。PCR 擴(kuò)增步驟為：模板 DNA 經(jīng)加熱至 98 ℃左右持續(xù) 2 min，輪回 30 次循環(huán)，依次經(jīng)過 98 ℃×30 s、50 ℃×30 s、72 ℃×1 min，最后于72 ℃下延長7 min。

1.7 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 整理初始數(shù)據(jù)，用SPSS 20.0 中的One-way ANOVA 進(jìn)行單因素方差分析，檢測結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SE）的形式表示。差異顯著的評斷標(biāo)準(zhǔn)為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 日糧精粗比對藏羊瘤胃組織形態(tài)的影響

D 組瘤胃角化層（除B 組外）和乳頭密度均顯著高于其余各組（P＜0.05）；B 組瘤胃肌肉層顯著高于（除C、E組外）其余各組（P＜0.05）；B 組乳頭高度顯著低于 E 和 G 組（P＜0.05），F(xiàn)、G 組乳頭寬度顯著高于 A、C、D 組（P＜0.05）（表2）。圖1 展示了各組瘤胃組織的切片顯微結(jié)果。

表2 日糧精粗比對藏羊瘤胃組織形態(tài)的影響Table 2 Effect of dietary concentrate to forage ratio on rumen morphology of Tibetan sheep

圖1 日糧精粗比對藏羊瘤胃組織形態(tài)的影響Fig.1 Effect of dietary concentrate to forage ratio on rumen morphology of Tibetan sheep（40×）

2.2 日糧精粗比對早期斷奶藏羔羊瘤胃細(xì)菌微生物的影響

2.2.1 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評估 由表3 可知，參與測序樣品共產(chǎn)生1057550 條Clean tags，每個樣品至少產(chǎn)生40189 條 Clean tags，平均產(chǎn)生 50360 條 Clean tags，質(zhì)控有效數(shù)據(jù)量達(dá)47991。所有樣品測序覆蓋率均在99%以上，本試驗測序深度能夠準(zhǔn)確反映瘤胃細(xì)菌的組成。

2.2.2 不同精粗比日糧對羔羊瘤胃細(xì)菌多樣性的影響 從圖2 可以看出，在97%的物種相似度水平下，7 組檢測樣本共得到 299 個 OTUs，其中有 259 個為 7 組共有OTUs，占 OTUs 總數(shù)的86.6%，獨(dú)有的OTUs 分別為 0、10、1、1、6、14 和 8 個，占 OTUs 總數(shù)的比例較小，表明各組OTUs 組成差異很小，相似度較高；其中F 組瘤胃細(xì)菌特有OTUs 最高，總共有273 個OTUs，B 組次之，OTUs 共 269 個，A 組 OTUs 最少為259 個。

Rank-abundance 曲線可解釋7 組樣品多樣性的豐富程度和均勻程度，在橫軸上的寬度代表物種豐富程度，曲線的形狀則表示物種的均勻程度，曲線平坦，表示樣品中瘤胃微生物均勻度較高。圖3 中，每條曲線對應(yīng)一個樣品，用不同顏色標(biāo)記?？梢钥闯觯弘S著精粗比例的增加，曲線寬度逐漸增加，即隨著日糧精粗比例的升高，瘤胃微生物菌群組成豐度逐漸增加；且圖中曲線都較平坦，其中D 組曲線波動較大。

Alpha 多樣性分析可以反映測定樣品瘤胃微生物群落豐富度和多樣性，其中Chaol 指數(shù)和ACE 指數(shù)越大表明群落豐富度越大；Simpson 指數(shù)越大反映群落多樣性越低；Shannon 指數(shù)越大群落多樣性越高。由表 4 可知，Shannon 指數(shù)，A、B、C 組間無顯著性差異（P＞0.05），但均顯著低于其余各組（P＜0.05），F(xiàn) 組最高；Simpson 指數(shù)，E、F 組無顯著性差異（P＞0.05），但均顯著低于A 和 C 組（P＜0.05），A 組最高（P＜0.05）；Ace 指數(shù)和Chao1 指數(shù)，F(xiàn) 組均顯著高于A、B、C、D 組（P＜0.05）。

表3 測序質(zhì)量Table 3 Sequencing quality

圖2 OTUs 花瓣圖Fig.2 Petals of OTUs

圖3 Rank-abundance 曲線Fig.3 Rank-abundance curve

表4 阿爾法多樣性指數(shù)Table 4 Alpha diversity index

2.3 不同精粗比日糧對羔羊瘤胃細(xì)菌分布的影響

2.3.1 門水平下瘤胃細(xì)菌分布分析 對門水平下豐度較高的5 種細(xì)菌進(jìn)行顯著性分析如表5 所示。A、B、C、D 組的優(yōu)勢菌群都是Firmicutes（厚壁菌門），豐度分別為85%、79%、75%、39%；E 組優(yōu)勢菌群為Bacteroidetes（擬桿菌門），豐度為36%；F 和G 組優(yōu)勢菌群均為Proteobacteria（變形菌門），豐度分別為51%和34%。Firmicutes（厚壁菌門）：A 組顯著高于 D、E、F、G 組（P＜0.05），但與 B、C 組差異不顯著（P＞0.05）；F 組 Acidobacteria（酸桿菌門）顯著高于A、B、C 組（P＜0.05）；Proteobacteria（變形菌門）F 組顯著高于A、B、C、D、E 組（P＜0.05），但與G組差異不顯著（P＞0.05）。

表5 門水平下細(xì)菌相對含量Table 5 Relative content of bacterial at phylum level

2.3.2 科水平下瘤胃細(xì)菌分布分析 對科水平下豐度較高的5 種細(xì)菌進(jìn)行顯著性分析，從表6 可以看出，A 和B 組優(yōu)勢菌群均為Lachnospiraceae（毛螺菌科），豐度分別是30%、28%；C 組優(yōu)勢菌群為Ruminococcaceae（瘤胃球菌科），豐度大于22%，且Ruminococcaceae（瘤胃球菌科）在各精粗比日糧飼喂下無明顯差異；D 組優(yōu)勢菌群Veillonellaceae（韋榮氏球菌科），豐度為16%；E 組優(yōu)勢菌群為Prevotellaceae（普雷沃氏菌科），豐度為16%；F 組優(yōu)勢菌群為Prevotellaceae（普雷沃氏菌科），豐度大于1%；G 組優(yōu)勢菌群為Christensenellaceae（克里斯滕森菌科），豐度大于 8%。Lachnospiraceae（毛螺菌科）A 組顯著高于 D、E、F、G 組（P＜0.05），與 B 和 C 組差異不顯著（P＞0.05）；Christensenellaceae（克里斯滕森菌科），B 與 C 組差異不顯著（P＞0.05），但顯著高于其余各組（P＜0.05）。

表6 科水平下細(xì)菌相對含量Table 6 Relative content of bacterial at family level

2.4 KEGG 分析

根據(jù)KEGG 分類柱狀圖（圖4）可得出，7 組羔羊瘤胃細(xì)菌共有25 個基因功能家族，占比在前5 的瘤胃細(xì)菌的功能，7 組均集中在一般功能基因（11%以上）、碳水化合物運(yùn)輸和代謝（9%以上）、氨基酸運(yùn)輸和代謝（7.8%以上）、轉(zhuǎn)錄（7.3%以上）、復(fù)制重組與修復(fù)（5.2%以上）上。且在碳水化合物運(yùn)輸和代謝以及轉(zhuǎn)錄類細(xì)菌隨著精粗比的遞增有減小的趨勢；關(guān)于氨基酸運(yùn)輸與代謝類細(xì)菌與日糧精粗比呈正相關(guān)；其余3 類功能細(xì)菌含量各處理組間無較大差異。F 組細(xì)菌功能在細(xì)胞活性、能源生產(chǎn)和轉(zhuǎn)換、脂質(zhì)運(yùn)輸和代謝及總體功能上表現(xiàn)相較各試驗組均為最高，在細(xì)胞周期控制、細(xì)胞分裂、染色體分區(qū)、翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物轉(zhuǎn)化等方面功能細(xì)菌含量較少。

圖4 KEGG 功能注釋圖Fig.4 KEGG function annotation diagram

3 討論

3.1 日糧精粗比對藏羔羊瘤胃組織形態(tài)的影響

瘤胃是反芻動物斷奶后機(jī)體營養(yǎng)物質(zhì)主要消化場所，其內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定平衡是藏羔羊生產(chǎn)潛力發(fā)揮和生產(chǎn)性能提高的重要基礎(chǔ)。Suárez 等［9］研究發(fā)現(xiàn)，日糧中粗飼料能有效降低瘤胃乳頭結(jié)塊并緩解瘤胃黏膜發(fā)育不良，表明適宜的精粗比和優(yōu)質(zhì)的粗飼料可維持瘤胃乳頭正常形態(tài)。本試驗結(jié)果表明，隨著精飼料比例增加，瘤胃乳頭長度和寬度有增加趨勢，但瘤胃乳頭密度顯著降低；精粗比例的變化使角化層和肌肉層產(chǎn)生顯著差異，說明粗飼料具有粗糙性和研磨值，其高粗纖維含量日糧對瘤胃具有物理刺激作用，一定程度上能夠增加瘤胃蠕動，同時促進(jìn)肌層發(fā)育，且適宜的粗飼料可對瘤胃角化層的消磨及死亡上皮細(xì)胞的清除有積極作用，保證瘤胃上皮的完整性。本試驗結(jié)果符合上述規(guī)律，但粗飼料體積較大和精粗比例過低使飼料適口性受到影響，進(jìn)而影響采食量，導(dǎo)致羔羊攝取營養(yǎng)水平降低，對瘤胃組織發(fā)育造成負(fù)面影響。

3.2 日糧精粗比對藏羔羊瘤胃微生物豐度的影響

日糧類型、結(jié)構(gòu)及飼喂方式能夠顯著影響反芻動物瘤胃微生物種類與數(shù)量［10］。曾鈺等［11］研究發(fā)現(xiàn)，在舍飼牦牛飼料中添加酵母培養(yǎng)物會影響瘤胃細(xì)菌的豐富度，但是對細(xì)菌多樣性沒有影響。占今舜等［12］研究日糧精粗比對湖羊瘤胃發(fā)酵和菌群結(jié)構(gòu)的影響后發(fā)現(xiàn)，高精粗比日糧對湖羊瘤胃細(xì)菌豐富度和多樣性及瘤胃的發(fā)酵具有促進(jìn)作用。本研究發(fā)現(xiàn)，不同精粗比飼喂下各處理組之間OTUs 組成無較大差異，但隨著日糧精粗比例的增加瘤胃菌群的多樣性有升高的趨勢，其菌群物種豐富度和均勻度也有變高的趨勢；且精粗比例為70∶30 的處理組細(xì)菌豐度和均勻度以及物種多樣性表現(xiàn)較好，與上述研究結(jié)果相似。日糧結(jié)構(gòu)是影響瘤胃微生物數(shù)量、豐度等的重要因素之一，而精粗比例是日糧構(gòu)成的基礎(chǔ)要素，適當(dāng)?shù)木直龋軌蛱岣叻雌c動物消化代謝功能，優(yōu)化瘤胃內(nèi)環(huán)境，有效提高飼料利用率［13］。當(dāng)前，藏羊的養(yǎng)殖方式從傳統(tǒng)的放牧飼養(yǎng)+補(bǔ)飼到全舍飼養(yǎng)殖，其逐漸適應(yīng)了全舍飼養(yǎng)殖模式，且一定比例的精粗飼料混合飼喂可使瘤胃微生物的生長分布表現(xiàn)最佳，有效縮短了藏羊的育肥周期，降低了草場季節(jié)性變化帶來飼草資源短缺的影響。

3.3 日糧精粗比對藏羔羊瘤胃微生物物種分布的影響

門水平下，藏羊瘤胃細(xì)菌優(yōu)勢菌群為厚壁菌門、變形菌門和擬桿菌門，與在牛、鹿以及山羊上的研究結(jié)果一致［14-16］。此外，日糧精料比例的降低有提高厚壁菌門相對豐度的趨勢，精粗比例小于60∶40 時，各試驗組瘤胃中的優(yōu)菌群均為厚壁菌門。前期，諸多研究證實，日糧的類型和組成對瘤胃中厚壁菌門具有一定程度的影響。李永洙等［17］發(fā)現(xiàn)早期飼喂代乳粉能夠?qū)е赂嵫蛄鑫钢袃?yōu)勢菌群由厚壁菌門變?yōu)閿M桿菌門。以陜北絨山羊為研究目標(biāo)，韓旭峰［18］證實，高精料組瘤胃中厚壁菌門的相對豐度顯著低于低精料日糧組。據(jù)研究，厚壁菌門多為革蘭氏陽性菌，其在反芻動物消化道微生物群落中廣泛分布，是促進(jìn)纖維分解的主要菌門，可將纖維降解為反芻動物可利用的短鏈脂肪酸以供宿主使用，所以厚壁菌門在瘤胃微生物中的群落分布理論上與粗飼料比例呈正相關(guān)?？扑较?，20∶80 組（A 組）的毛螺菌顯著高于 50∶50、60∶40、70∶30 和 80∶20 組（D、E、F 和 G 組）。與瘤胃球菌功能相似，毛螺菌能夠吸附并破除飼料中植物細(xì)胞壁，從而有效降解纖維素為單糖和短鏈脂肪酸。Wang 等［19］和Heinritz等［20］證實，日糧中精料能夠顯著降低荷斯坦奶牛瘤胃細(xì)菌中毛螺菌的相對豐度，本研究結(jié)果與其一致。結(jié)合毛螺菌的功能，本研究推測粗纖維構(gòu)成的日糧能夠為毛螺菌提供更多且更有效的結(jié)合基質(zhì)，進(jìn)而促進(jìn)其增殖。Kim等［21］研究認(rèn)為，隨日糧精粗比例升高，普雷沃氏菌科呈顯著增多的趨勢。張潔等［22］表示普雷沃氏菌豐度與日糧蛋白質(zhì)水平呈正相關(guān)。普雷沃氏菌科被認(rèn)為是一種多糖降解菌屬，有助于降解黏蛋白和植物碳水化合物，盡管無法直接降解纖維素，但可以通過共培體系與纖維降解菌利用木聚糖和果膠［23］，本試驗證實適量的精料可促進(jìn)普雷沃氏菌科生長，精粗比在60∶40（E 組）時普雷沃氏菌科相對豐度最高，可能是因為高精料日糧含有大量的低聚果糖和淀粉物質(zhì)需要被消化，相應(yīng)促進(jìn)普雷沃氏菌科的比例。但過高精料比例日糧則會導(dǎo)致瘤胃pH 值下降，反而抑制該菌的生長。

3.4 日糧精粗比對藏羔羊瘤胃微生物細(xì)菌功能的影響

瘤胃微生物菌群是一種微生物共生聯(lián)合體，微生物和宿主之間、微生物與微生物之間保持著相互依賴、相互制約的關(guān)系。掌握瘤胃代謝與微生物相互之間的關(guān)系，能夠為藏羊日糧的科學(xué)設(shè)計提供理論依據(jù)。通過對藏羔羊瘤胃微生物菌群進(jìn)行KEGG 通路的功能性注釋后得出，功能通路主要富集于通用功能預(yù)測、轉(zhuǎn)錄、碳水化合物代謝和氨基酸運(yùn)輸和代謝。本試驗發(fā)現(xiàn)隨著日糧中精料比例的增加，有促進(jìn)氨基酸的運(yùn)輸與代謝與能源生產(chǎn)和轉(zhuǎn)換通路富集的趨勢。結(jié)合這2 個通路的功能，即調(diào)控蛋白合成和能量代謝。本研究推測，精料能夠為瘤胃微生物的增殖提供更為豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)對應(yīng)功能的微生物菌落的相對豐度，如擬桿菌和普雷沃氏菌等，進(jìn)而體現(xiàn)在相關(guān)通路富集的差異性上。

4 結(jié)論

在本試驗條件下，當(dāng)日糧精粗比例為50∶50 時，早期斷奶藏羔羊育肥過程中瘤胃乳頭、角化層發(fā)育較好；精粗比為70∶30 時瘤胃微生物多樣性及豐富度較好；日糧精料比例的降低有提高厚壁菌門相對豐度的趨勢；適量的精料可促進(jìn)普雷沃氏菌科生長，精粗比在60∶40 時普雷沃氏菌科相對豐度最高，但過高的精粗比例會抑制該菌生長。綜合上述結(jié)果，精粗比為70∶30 時更適合藏羔羊短期育肥。