陳貴宇，李春臣，辜春霞，楊晨，江蘭，羅濤，梅雪，張建武*

腹瀉通常是由腸道疾病引起的癥狀，可由各種細菌（大腸埃希菌、志賀菌種、霍亂弧菌等）、病毒（諾如病毒、巨細胞病毒等）和寄生蟲引起［1］。腹瀉是嚴重影響人類健康和社會經(jīng)濟發(fā)展的多發(fā)病之一，盡管治療腹瀉的有效藥物較多，但中藥治療腹瀉具有療效迅速、不良反應少、費用低廉等優(yōu)勢［2］。因此，世界衛(wèi)生組織（WHO）仍鼓勵尋找傳統(tǒng)的抗腹瀉中藥［3］。

連翹是臨床常用中藥之一，為木犀科植物連翹Forsythia suspensa（Thunb.）Vahl的干燥果實，味苦、無毒、性微寒，具有清熱解毒、消腫散結(jié)的功效［4］，其藥理作用主要有抗菌、保肝、非特異性免疫、保護心臟、抗氧化等。有研究表明，連翹屬植物葉子與果實的成分和藥理作用有較好的一致性［5］，而連翹葉中的黃酮類化合物具有良好的抑菌活性［6］，更好地印證了其藥理作用。

本研究采用蓖麻油誘導的小鼠急性腹瀉模型，觀察連翹葉乙醇提取物（FS ext）對小鼠蓖麻油性腹瀉的影響，同時探討其對家兔離體空腸平滑肌自發(fā)性收縮的影響。

本研究創(chuàng)新點與不足：

（1）探究了連翹葉對腸平滑肌收縮的影響以及在腹瀉方面的應用，此前對于連翹葉這方面藥用價值的研究鮮少，豐富了其藥用方向，同時也為這方面的研究提供了一定的理論依據(jù)。（2）對于連翹葉在腹瀉方面的應用，沒有明確模型針對的是臨床上的何種腹瀉。

1 材料與方法

1.1 研究時間 2018年6—12月。

1.2 藥物提取 于四川省南充市采集連翹葉（CBY-2016-0003），經(jīng)川北醫(yī)學院藥學院梅雪老師鑒定。將連翹葉放在恒溫（60 ℃）電爐中干燥，粉碎成粗粉（粉碎機：FW177，泰斯特，天津），取50 g（使用電子分析天平：Mettle AE 240）放入1 L的圓底燒瓶中，用7倍于測量質(zhì)量的乙醇作為溶劑，回流、萃取3次，濾液回收溶劑（旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：RE-52AA，雅榮，上海）濃縮，在真空減壓干燥爐（ZK 6050B，Opson，武漢）中干燥得到FS ext，浸出率為24.55%。

1.3 植物化學分析

1.3.1 初步植物化學分析 對FS ext進行植物化學分析，以確定可能存在的苷類、多酚、黃酮類、多糖和有機酸［7］。水提液振蕩后形成泡沫，說明FS ext中有皂苷；加入FeCl3試劑出現(xiàn)藍綠色，說明FS ext中有酚類物質(zhì)；加入AlCl3試劑出現(xiàn)黃色，說明FS ext中有黃酮類物質(zhì)。

1.3.2 總黃酮含量測定 根據(jù)文獻［8］測定FS ext的總黃酮含量。將0.5 ml FS ext與1.5 ml乙醇（75%v/v）、0.1 ml氯化鋁（10% w/v）、0.1 ml乙酸鉀（1 mol/L）和2.8 ml雙蒸餾水混合，室溫下培養(yǎng)30 min，然后用1750紫外-可見分光光度計（日本島津）在435 nm處測量吸光度。用蒸餾水（0.1 ml）代替氯化鋁作空白。蘆丁有典型的黃酮類結(jié)構(gòu)和紫外特征，且易分離，作為對照品比較易得，故本研究以蘆丁作為標定曲線的標準對照，結(jié)果用蘆丁當量mg/g提取物表示。

1.3.3 高效液相色譜法鑒別FS ext中的化學成分 采用高效液相色譜法對FS ext中的化學成分進行鑒別和檢測，色譜柱為Aglient-ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈-水溶液為流動相，采用梯度洗脫（流動相A為水，流動相B為乙腈，梯度洗脫條件見表1），結(jié)合波長切換技術于20 min將檢測波長從330 nm切換為277 nm進行化學成分檢測，流速為0.6 ml/min，柱溫 28 ℃，進樣量 5 μl。

表1 梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution condition

1.3.3.1 對照品溶液制備 取連翹苷和連翹酯苷A對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解，制成每 1 ml含0.265 mg連翹苷和0.373 mg連翹酯苷A的混合對照品溶液，混勻，過0.22 μm微孔濾膜，備用。

1.3.3.2 供試品溶液制備 取FS ext 0.105 50 g，加甲醇定容至1 ml容量瓶中，搖勻，過0.22 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

1.4 實驗藥品及試劑 碳酸氫鈉、氯化鉀、硫酸鎂、葡萄糖、磷酸二氫鈉、氯化鈉、氯化鈣、氯化鐵、氯化鋁、醋酸鉀〔成都市科隆化學品有限公司〕，氯乙酰膽堿〔成都華夏化學試劑有限公司（中國成都）〕，蓖麻油（河南省華龍藥業(yè)有限公司），維拉帕米〔Medchemexpress有限公司（美國）〕，洛哌丁胺〔西格瑪化學公司（美國圣路易斯）〕，色譜乙腈（成都市科隆化學品有限公司），純化水（杭州娃哈哈集團有限公司），鹽酸〔成都市科隆化學品有限公司〕、氯化鐵、甲醇（重慶騰華化工有限公司）、醋酸鉀和氯化鋁用于粗提物的植物化學分析。蒸餾水（四川優(yōu)普超純科技有限公司）用于制備標準溶液、稀釋液和生理鹽溶液（Tyrode溶液）。

1.5 儀器 家兔類通用實驗器械，HW-400E恒溫平滑肌槽（四川成都泰盟公司），BL-420F生物機能實驗系統(tǒng)（四川成都泰盟公司），F(xiàn)T-100生物張力傳感器（四川成都泰盟軟件有限公司），優(yōu)普純水/超純水制造系統(tǒng)（四川優(yōu)普超純科技有限公司），HH600-2B三用恒溫水浴箱（金壇市科析儀器有限公司），電熱恒溫鼓風干燥箱（YDYQ，101-2A），粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司，F(xiàn)W177），電子分析天平（Mettle AE 240），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠，RE-52AA），真空減壓干燥箱（武漢奧普森試驗設備有限公司，ZK 6050B）。

1.6 實驗動物 選取110只健康昆明雌雄小鼠（18～22 g）以及42只健康家兔（2.0～2.5 kg），由川北醫(yī)學院動物中心提供〔許可證編號：SYXK（chuan）2013-076〕，小鼠和家兔飼養(yǎng)于23～26 ℃、濕度適宜的實驗室環(huán)境，12 h光照黑暗循環(huán)，期間可自由進食和飲水。本實驗符合中國動物保護委員會的管理，并遵循動物倫理和實驗準則。

1.7 實驗方法

1.7.1 FS ext的急性毒性 取60只禁食4 h（可自由飲水）的小鼠隨機分為0.5 g/kg FS ext試驗組、1.0 g/kg FS ext試驗組、2.0 g/kg FS ext試驗組、4.0 g/kg FS ext試驗組、8.0 g/kg FS ext試驗組、16.0 g/kg FS ext試驗組，每組10只，分別給予0.5 g/kg、1.0 g/kg、2.0 g/kg、4.0 g/kg、8.0 g/kg、16.0 g/kg的FS ext進行灌胃，處理后的小鼠可自由飲水進食，記錄14 d內(nèi)小鼠的死亡情況和毒性跡象，建立相應的劑量-效應曲線，從而確定FS ext的半數(shù)致死劑量（LD50），以確定其安全性［9］。

1.7.2 對蓖麻油性腹瀉的影響 另取50只小鼠隨機分成陰性組、陽性組、0.25 g/kg FS ext試驗組、0.50 g/kg FS ext試驗組、1.00 g/kg FS ext試驗組，每組10只，陰性組給予0.9%氯化鈉溶液（20 ml/kg）灌胃，陽性組給予洛哌丁胺（4 mg/kg）灌胃，0.25 g/kg FS ext試驗組、0.50 g/kg FS ext試驗組、1.00 g/kg FS ext試驗組分別給予0.25、0.50、1.00 g/kg FS ext。給藥30 min后，小鼠均給予蓖麻油0.4 ml灌胃，然后將每只小鼠放入單獨的籠子中，地板襯有吸墨紙，將線網(wǎng)放置在離底部3 cm的籠中以使小鼠與吸墨紙隔開。觀察4 h內(nèi)以下指標：初始半固體糞便時間，固體、半固體、液體糞便數(shù)量。采用腹瀉指數(shù)（EI）評估腹瀉的嚴重程度［10］。EI=固體糞便數(shù)量×1+半固體糞便數(shù)量×2+液體糞便數(shù)量×3。

1.7.3 離體標本制備 選取健康家兔，實驗前禁食24 h，自由飲水。用木槌擊致頭昏，解剖家兔，以胃幽門與十二指腸交界處為起始部，取空腸并立即放入通有95% O2和5% CO2混合氣的臺氏液中，將內(nèi)容物沖洗干凈并剪去腸系膜，剪成1.5～2.0 cm數(shù)段，一端用線結(jié)扎固定于通氣溝，另一端固定于張力換能器。給予前負荷1 g，浴槽內(nèi)溫度維持在（37.0±0.5）℃，通氣溝以每秒1～2個氣泡的速度持續(xù)通入混合氣，待基線穩(wěn)定后開始實驗［11］。

1.7.4 FS ext對家兔離體空腸平滑肌自發(fā)性收縮的影響 待空腸平滑肌張力穩(wěn)定后，單劑量加入FS ext（0.01、0.03、0.10、0.30、1.00、3.00、10.00 mg/ml，這些濃度是累加所得，即后一個的濃度由前一個濃度累加，主要目的是為了觀察家兔離體空腸平滑肌自發(fā)性收縮隨FS ext的濃度變化而變化的趨勢），以給藥前的張力為100%，記錄給藥后空腸平滑肌自發(fā)性收縮的張力變化。按照上述方法，用維拉帕米（0.01、0.03、0.10、0.30、1.00、3.00、10.00 μmol/L）處理家兔離體空腸平滑肌作為對照，記錄給予維拉帕米后家兔離體空腸平滑肌自發(fā)性收縮的張力變化。

1.7.5 FS ext對由乙酰膽堿（ACh）和KCl誘導的家兔離體空腸平滑肌自發(fā)性收縮的影響 待空腸平滑肌張力穩(wěn)定后，分別加入ACh（10 μmol/L）和KCl（60 mmol/L）預處理，出現(xiàn)最大波峰后，立即用臺氏液沖洗腸管，等其穩(wěn)定后，再次分別加入ACh（10 μmol/L）和KCl（60 μmol/L），15 min后，加入FS ext使其終濃度分別達0.01、0.03、0.10、0.30、1.00、3.00、10.00 mg/ml，并記錄空腸平滑肌自發(fā)性收縮穩(wěn)定時的張力變化。按照上述方法，用維拉帕米（0.001、0.010、0.100、1.000、3.000 μmol/L）處理家兔離體空腸作為對照，重復上述步驟，并記錄此時空腸平滑肌自發(fā)性收縮穩(wěn)定時的張力變化。

1.7.6 FS ext對由CaCl2誘導的家兔離體空腸平滑肌自發(fā)性收縮的影響 為確定FS ext對Ca2+內(nèi)流的影響，首先讓腸管處于Tyrode溶液中，待其張力穩(wěn)定后，將Tyrode溶液換為含EDTA的無Ca2+高K+溶液，持續(xù)30 min以從組織中除去Ca2+。再將溶液換為不含EDTA的無Ca2+高K+溶液，持續(xù)15 min，然后再加入FS ext（0.3、1.0 mg/ml），構(gòu)建CaCl2（3×10-5～3×10-2mol/L）的量-效曲線，觀察給予不同劑量FS ext后家兔離體空腸平滑肌自發(fā)性收縮率的變化。在加入維拉帕米（1 μmol/L）的情況下，構(gòu)建CaCl2（3×10-5～3×10-2mol/L）的量-效關系曲線，觀察空腸平滑肌自發(fā)性收縮率變化。在沒有FS ext和維拉帕米預處理的情況下，將3×10-2mol/L CaCl2誘導的家兔離體空腸平滑肌自發(fā)性收縮率認為是100%［12］。

1.8 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以（±s）表示，組間比較用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 植物化學分析

2.1.1 初步植物化學分析 對FS ext的初步植物化學分析表明其含有酚類、皂苷類和黃酮類化合物。

2.1.2 總黃酮的含量 FS ext中黃酮含量的測定表明，黃酮含量為8.13 mg/g。

2.1.3 高效液相色譜法檢測FS ext中的化學成分 采用高效液相色譜法對FS ext中的化學成分進行檢測，結(jié)果顯示，F(xiàn)S ext中主要含連翹苷和連翹酯苷A。在上述1.3.3的色譜條件下，連翹苷和連翹酯苷A的分離度良好，空白、混合標準品、樣品的色譜圖見圖1。

圖1 空白（A）、混合標準品（B）、連翹葉乙醇提取物樣品（C）的HPLC色譜圖Figure 1 HPLC chromatograms of blank（A），reference substances（B），and sample（C）

2.2 FS ext的急性毒性 在測量LD50的實驗過程中，小鼠按不同劑量的FS ext進行灌胃后，在觀察期內(nèi)未出現(xiàn)任何死亡或毒性跡象。單次給予FS ext的劑量為16 g/kg，小鼠在觀察期內(nèi)未出現(xiàn)任何的死亡及行為變化。

2.3 FS ext對小鼠蓖麻油性腹瀉的影響 5組初始半固體糞便時間和EI比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。陽性組初始半固體糞便時間長于陰性組、0.25 g/kg FS ext試驗組、0.50 g/kg FS ext試驗組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；1.00 g/kg FS ext試驗組初始半固體糞便時間長于陰性組、0.25 g/kg FS ext試驗組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。陰性組EI高于陽性組、1.00 g/kg FS ext試驗組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；0.25 g/kg FS ext試驗組、0.50 g/kg FS ext試驗組EI高于陽性組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，見表2）。

表2 FS ext對小鼠蓖麻油性腹瀉的影響（±s）Table 2 Effect of ethanol extract from Forsythia suspensa （FS ext） on castor oil-induced diarrhea in mice

表2 FS ext對小鼠蓖麻油性腹瀉的影響（±s）Table 2 Effect of ethanol extract from Forsythia suspensa （FS ext） on castor oil-induced diarrhea in mice

注：FS ext=連翹葉乙醇提取物，EI=腹瀉指數(shù)；與陰性組比較，aP＜0.05；與陽性組比較，bP＜0.05；與0.25 g/kg FS ext試驗組比較，cP＜0.05

組別 只數(shù) 初始半固體糞便時間（min） EI陰性組 10 65.50±35.87 16.80±4.42陽性組 10 119.50±48.50a 8.40±5.61a 0.25 g/kg FS ext試驗組 10 54.90±23.30b 15.60±7.74b 0.50 g/kg FS ext試驗組 10 83.10±32.69 13.90±4.32 1.00 g/kg FS ext試驗組 10 104.00±40.99c 10.50±5.06 F值 4.610 3.582 P值 0.003 0.013

2.4 FS ext對家兔離體空腸平滑肌自發(fā)性收縮的影響 臺氏液對家兔離體空腸平滑肌自發(fā)性收縮無明顯影響，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，見圖2）。FS ext對家兔離體空腸平滑肌表現(xiàn)出劑量依賴性解痙作用，即半最大效應濃度（EC50）=1.21 mg/ml（1.11～1.26 mg/ml，n=6），見圖3。圖形類似于維拉帕米（0.01～10 μmol/L），其 EC50 為 0.51 μmol/L（0.42～0.59 μmol/L，n=6），見圖4。

圖2 臺氏液對家兔離體空腸平滑肌自發(fā)性收縮的影響Figure 2 The effect of Tyrode's solution on the spontaneous contraction of rabbit isolated jejunal smooth muscle

圖3 不同濃度FS ext對離體空腸平滑肌自發(fā)性收縮的影響Figure 3 Effects of different concentrations of FS ext on the spontaneous contraction of rabbit isolated jejunal smooth muscle

圖4 不同濃度維拉帕米對家兔離體空腸平滑肌自發(fā)性收縮的影響Figure 4 Effects of different concentrations of verapamil on the spontaneous contraction of rabbit isolated jejunal smooth muscle

2.5 FS ext對ACh和KCl誘導的家兔離體空腸收縮的松弛作用 FS ext能濃度依賴性地抑制由ACh誘導的腸管 收 縮，EC50=0.99 mg/ml（0.91～1.02 mg/ml，n=6），最大抑制率為84.75%，其量-效關系曲線變化見圖5A。此外，F(xiàn)S ext也能夠以濃度依賴的方式抑制由KCl誘導的腸管收縮，EC50=0.63 mg/ml（0.58～0.67 mg/ml，n=6），最大抑制率為91.45%，其量-效關系曲線變化見圖5A。FS ext對ACh和KCl誘導的家兔離體空腸平滑肌收縮的松弛作用與維拉帕米在0.001～3.000 μmol/L時相似，EC50值分別為0.25 μmol/L（0.20～0.29 μmol/L，n=6） 和 0.041 μmol/L（0.033～0.047 μmol/L，n=6），其量-效關系曲線變化見圖5B。

圖5 不同濃度FS ext和不同濃度的維拉帕米對ACh（10 μmol/L）和KCl（60 mmol/L）誘導的兔離體空腸收縮的影響Figure 5 Effects of different concentrations of FS ext and verapamil on the contraction of rabbit isolated jejunum induced by ACh （10 μmol/L） or KCl （60 mmol/L）

2.6 FS ext對CaCl2誘導的空腸收縮的影響 FS ext以濃度依賴的方式抑制CaCl2誘導的腸管收縮，最大抑制率為52.13%，進一步研究發(fā)現(xiàn)，隨著FS ext劑量的增加，形成的CaCl2量-效關系曲線向右下方移動，這與維拉帕米引起的CaCl2量-效關系曲線變化類似，見圖6。

3 討論

在蓖麻油誘導的小鼠急性腹瀉模型中，蓖麻油通過刺激小腸，損傷小腸黏膜細胞，促進炎性遞質(zhì)合成和釋放，導致腸腔內(nèi)積液而出現(xiàn)急性腹瀉；此外，蓖麻油能減少Na+和K+主動吸收，降低小腸和結(jié)腸Na+-K+ATP酶活性［13］。蓖麻油中含有的蓖麻油酸能夠引起局部刺激和腸黏膜炎癥，從而導致前列腺素釋放，增強胃腸動力［14］。蓖麻油誘導小鼠腹瀉實驗中，試驗組與陰性組相比，小鼠EI明顯降低，初始半固體糞便時間延長。根據(jù)植物化學分析，F(xiàn)S ext中含有黃酮類化合物［15］。因為萜烯、黃酮類化合物和萜類化合物可以抑制自體蛋白和前列腺素的釋放［16］，所以根據(jù)實驗結(jié)果推測，F(xiàn)S ext中可能含有抑制前列腺素釋放的物質(zhì)，從而抑制小鼠蓖麻油性腹瀉。

通過探究FS ext對家兔離體空腸平滑肌自發(fā)性收縮的影響，發(fā)現(xiàn)其表現(xiàn)出一定的劑量依賴性解痙作用，進一步印證FS ext可以抑制蓖麻油誘導的小鼠腹瀉。ACh是腸神經(jīng)系統(tǒng)中主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)［17］，可通過激活毒蕈堿受體（M受體）誘導平滑肌自發(fā)性收縮。腸神經(jīng)系統(tǒng)的副神經(jīng)系統(tǒng)和內(nèi)在神經(jīng)元通過釋放ACh、激動腸平滑肌細胞膜上的M受體而增加其收縮活性，促進腸道蠕動［18］。在FS ext對ACh誘導的家兔離體空腸平滑肌自發(fā)性收縮影響實驗中，F(xiàn)S ext試驗組空腸收縮變化率呈下降趨勢，與維拉帕米組的實驗結(jié)果一致，提示FS ext能夠舒張ACh誘導的離體空腸平滑肌自發(fā)性收縮，因此FS ext舒張腸平滑肌的作用可能與阻斷M受體有關。平滑肌的收縮取決于細胞質(zhì)中Ca2+的存在，細胞外的Ca2+通過細胞表面的L-型鈣離子通道進入細胞內(nèi)，或是通過細胞內(nèi)肌漿網(wǎng)釋放Ca2+，從而使得細胞內(nèi)Ca2+升高［19］。因此，鈣通道的阻斷或是細胞內(nèi)儲存的Ca2+釋放量減少均會減弱平滑肌的收縮。在細胞興奮過程中，L-型鈣離子通道可調(diào)節(jié)細胞內(nèi)Ca2+濃度保持在參考范圍，即鈣穩(wěn)態(tài)的主要離子通道［20］。由之前的文獻可知，高濃度的K+水平可打開電壓依賴性L-型鈣離子通道并允許細胞外Ca2+進入細胞內(nèi)，從而促進腸平滑肌的收縮［21-22］。FS ext可松弛高K+誘導的腸平滑肌自發(fā)性收縮，提示可能有鈣拮抗劑的存在［23］。因此，為驗證這一猜想，本實驗使用KCl溶液誘導腸管收縮，并將維拉帕米作為對照組，維拉帕米是一種L-型鈣離子通道阻斷劑［24］。實驗結(jié)果顯示，F(xiàn)S ext能松弛KCl誘導的家兔離體空腸平滑肌自發(fā)性收縮，且隨著FS ext濃度的增加，形成的CaCl2量-效關系曲線向右下方移動，這與維拉帕米引起的CaCl2量-效關系曲線變化類似。提示FS ext抑制家兔離體空腸平滑肌的收縮可能與阻斷L-型鈣離子通道有關。

綜上，F(xiàn)S ext有明顯的抗小鼠蓖麻油性腹瀉作用，可抑制家兔離體空腸平滑肌的自發(fā)性收縮和ACh和KCl誘導的空腸收縮，其機制可能與阻斷M受體和抑制L型-鈣離子通道有關。

作者貢獻：陳貴宇進行文章的構(gòu)思與設計，文獻資料收集、整理，撰寫論文，論文的修訂并對文章負責；李春臣進行數(shù)據(jù)的整理，文章中圖表的繪制，論文的修訂；辜春霞、楊晨、江蘭進行研究實施，數(shù)據(jù)收集；羅濤、梅雪進行數(shù)據(jù)提供，質(zhì)量控制；張建武負責文章的質(zhì)量控制與審校，對文章整體負責、監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。