張旭 張權(quán)銘 董睿陶 王托

(1長春醫(yī)學高等專科學校臨床醫(yī)學部，吉林 長春 130013；2長春市十一高中；吉林大學 3生命科學學院；4藥學院)

痛風是一種關(guān)節(jié)炎癥疾病，伴隨有嚴重的關(guān)節(jié)紅腫、發(fā)熱和疼痛〔1〕。臨床上將血尿酸(UA)水平持續(xù)高于6.8 mg/dl定義為高尿酸血癥，也被認為是痛風發(fā)病的重要病理基礎(chǔ)〔1,2〕?；谕达L的病理特征，痛風的治療策略可分為解熱鎮(zhèn)痛和降低UA兩類〔3,4〕。解熱鎮(zhèn)痛作用藥物主要應(yīng)用于痛風性關(guān)節(jié)炎急性發(fā)作期，僅能暫時緩解或抑制痛風的癥狀〔5〕。持續(xù)降低UA水平可有效防止痛風性關(guān)節(jié)炎的發(fā)作，因此有研究者認為，降低UA才是痛風治療的根本〔6〕。目前市場上的痛風藥物，如秋水仙堿、別嘌呤醇等，均伴隨有惡心、嘔吐、腹瀉等毒副作用，且作用效果單一〔4,7,8〕。臨床治療中急需一種安全性高，且既能發(fā)揮解熱鎮(zhèn)痛作用又能降低UA水平的痛風治療手段。延胡索是植物延胡索的塊莖，其鎮(zhèn)痛作用已受到廣大醫(yī)者的認同〔9〕。目前從延胡索中分離得到了多種活性生物堿成分，包括延胡索乙素、去氫紫蓳堿等20多種，展現(xiàn)了鎮(zhèn)痛、抗菌、抗腫瘤等多種生物活性〔9〕。機體中黃嘌呤氧化酶(XOD)等催化嘌呤代謝產(chǎn)生UA的過程中，伴隨有大量活性氧(ROS)的產(chǎn)生。過量ROS不僅會引起組織氧化損傷，而且促進了痛風發(fā)作過程中的炎癥因子產(chǎn)生釋放過程〔10,11〕。目前關(guān)于延胡索在痛風疾病領(lǐng)域的應(yīng)用研究幾乎沒有，其降低血液UA的作用仍有待確定。本研究建立高尿酸血癥小鼠模型，擬分析延胡索提取物(YHS)降UA活性及其對痛風發(fā)作過程可能的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1動物 SPF級雄性BALB/c小鼠，8周齡，體重18～20 g，購自遼寧長生生物制品有限公司，許可證號：SCXK(遼)2015-0001。

1.2主要試劑 延胡索塊莖(河北省安國市瑞琪中藥材有限公司)，別嘌呤醇片(世茂天街藥業(yè)有限公司)，紅細胞裂解液和細胞染色緩沖液(賽默飛世爾公司)，UA測定試劑盒和XOD測定試劑盒(Sigma-Aldrich)，ROS，丙二醛(MDA)，超氧化物歧化酶(SOD)，谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)，過氧化氫酶(CAT)，白細胞介素(IL)-1β，腫瘤壞死因子(TNF)-α，IL-8，單核細胞趨化蛋白(MCP)-1等酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(江蘇科特生物科技有限公司)。

1.3主要儀器 可調(diào)式微量移液器(10～100 μl，100～1 000 μl，Eppendorf公司)；電子天平(BP221S，德國賽多利斯)； 多功能酶標(SynergyTM4，BioTek公司)；超凈工作臺(VS-1300V，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；恒溫水浴鍋(GSY-Ⅱ，北京市醫(yī)療設(shè)備廠)；大容量冷凍離心機(5810R，Eppendorf公司)；真空冷凍凍干機(HLPHA-1-4，Christ公司)；流式細胞儀(Cytoflex，貝克曼公司)。

1.4YHS給藥溶液制備 取延胡索干燥品經(jīng)初步粉碎產(chǎn)物100 g加入1 L去離子水混合均勻，100℃加熱2 h，6 000 r/min離心取上清，上清液經(jīng)冷凍干燥后即為YHS。2 g、4 g和8 g延胡索干燥品提取獲得的等量提取物分別溶于10 ml去離子水中即得YHS低劑量(L)、中劑量(M)、高劑量(H)給藥溶液。

1.5模型建立及給藥 60只雄性健康BALB/c小鼠，經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，隨機分為空白對照組、模型組、別嘌呤醇陽性組(AL)、YHS-L組、YHS-M組和YHS-H組各10只，AL小鼠給藥20 mg/kg別嘌呤醇，YHS-L、YHS-M和YHS-H小鼠分別給藥相應(yīng)給藥溶液(等同于2 g/kg、4 g/kg和8 g/kg延胡索)。對照組和模型組小鼠灌胃等體積去離子水。給藥方式為灌胃給藥，給藥體積為10 ml/kg，連續(xù)給藥14 d。在最后3 d灌胃給藥1 h前，除去對照組小鼠，其余小鼠腹腔注射氧嗪酸鉀生理鹽水溶液(300 mg/kg)進行高尿酸血癥建模，對照組小鼠注射等體積生理鹽水。

1.6小鼠外周血免疫細胞檢測 小鼠最后一次灌胃給藥2 h后，眼底靜脈叢取血，分取100 μl血液，加入紅細胞裂解液2 ml混合均勻避光5 min后，1 200 r/min離心5 min，棄上清，沉淀用200 μl細胞染色緩沖液重懸，進行流式細胞術(shù)測定。

1.7小鼠血液及組織采集 小鼠最后一次灌胃給藥2 h后，眼底靜脈叢取血，室溫放置30 min，3 000 r/min離心10 min取上清即得小鼠血清，取血后小鼠通過二氧化碳吸入法安樂死。收集小鼠腎臟和肝臟，小鼠腎臟用10%甲醛固定，肝臟和血清-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.8小鼠腎臟病理學檢測 小鼠腎臟固定7 d后，經(jīng)過50%、75%、80%、90%、100%乙醇溶液、二甲苯、二甲苯的順序進行脫水透明后，進行石蠟包埋。將小鼠腎臟石蠟塊切成5 μm的組織切片后，經(jīng)過100%、90%、80%、75%、50%乙醇復(fù)水處理后，進行蘇木素-伊紅(HE)染色，封片后在顯微鏡200倍放大倍數(shù)下進行觀察。

1.9小鼠血清UA及XOD測定 使用UA檢測試劑盒和XOD檢測試劑盒測定。

1.10小鼠氧化應(yīng)激相關(guān)因子及炎癥相關(guān)因子測定 使用ELISA測定小鼠血清和肝臟中ROS、MDA、SOD、GSH-Px和CAT含量，小鼠血清中IL-1β、TNF-α、IL-8、MCP-1含量。

1.11統(tǒng)計學方法 采用SPSS16.0軟件進行單因素方差分析(ANOVA)及Dunn多重比較檢驗。

2 結(jié) 果

2.1YHS對高尿酸血癥小鼠UA及XOD含量的影響 與對照組相比，模型組血清UA水平，血液和肝臟中XOD活性顯著升高(P<0.01)，AL組顯著降低(P<0.05)。與AL組比較，YHS給藥組UA水平和XOD活性顯著升高(P<0.05)，且YHS的作用效果呈現(xiàn)劑量依賴性增強。見表1。

表1 YHS對高尿酸小鼠血UA及XOD 的影響

2.2YHS對高尿酸血癥小鼠氧化應(yīng)激水平的影響 與對照組相比，模型組ROS水平顯著升高(P<0.01)，SOD和GSH-Px水平顯著降低 (P<0.05)。與模型組比較，YHS-H組ROS水平顯著降低，SOD、GSH-Px、CAT水平顯著升高(P<0.05,P<0.01)。AL組ROS水平顯著低于模型組(P<0.05)，見表2。

表2 YHS對高尿酸小鼠氧化應(yīng)激相關(guān)因子的影響

續(xù)表2 YHS對高尿酸小鼠氧化應(yīng)激相關(guān)因子的影響

2.3YHS對高尿酸血癥小鼠腎臟病理的影響 與對照組相比，模型組小鼠腎臟腎小球間隙明顯增大，腎小球出現(xiàn)一定程度的不規(guī)則形變。YHS-M、YHS-H組小鼠腎小球病例變化得到緩解，腎小球間隙明顯縮小。見圖1。

圖1 YHS對高尿酸小鼠腎臟病理學影響(HE，×200)

2.4YHS對高尿酸血癥小鼠炎癥相關(guān)因子的影響 與對照組相比，模型組血清中IL-1β和TNF-α水平顯著升高(P<0.01)。與模型組比較，YHS-H組IL-1β顯著降低，AL組、YHS-L、M、H組TNF-α水平顯著降低(均P<0.01)；YHS-L組IL-8水平顯著降低(P<0.05)，見表3。

表3 各組炎癥因子比較

2.5YHS對高尿酸血癥小鼠外周血細胞的影響 與對照組相比，模型組小鼠外周血中性粒細胞比例增加了15.0%以上，YHS-M、YHS-H組比例減少了13.0%以上。YHS降低高尿酸血癥小鼠外周血中中性粒細胞的作用效果呈現(xiàn)劑量依賴性增強。見圖2。

圖2 YHS對高尿酸小鼠外周血中中性粒細胞的影響(P2中性粒細胞，P3單核細胞，P4淋巴細胞)

3 討 論

天然產(chǎn)物以其生物相容性高、活性廣泛、毒副作用小等特點，成為新藥開發(fā)的重要來源，受到越來越多研究者的關(guān)注。延胡索是傳統(tǒng)中醫(yī)中藥中經(jīng)典的鎮(zhèn)痛作用藥物，現(xiàn)代藥學研究從延胡索中分離獲得的延胡索甲素、延胡索乙素等有效成分均顯示了很好的鎮(zhèn)痛作用〔9〕。高尿酸血癥作為痛風發(fā)病的基礎(chǔ)，其本身并不會有明顯的發(fā)病癥狀。高尿酸血癥的危害主要在于其引起的痛風、心腦血管疾病、腎臟損傷、糖尿病等并發(fā)癥，在這一過程中氧化應(yīng)激損傷起到了很大作用〔12〕。在痛風發(fā)作過程中，中性粒細胞的募集及炎癥因子IL-1β等的釋放使患者患處疼痛、發(fā)熱及炎癥反應(yīng)的生理生化基礎(chǔ)〔13,14〕，氧化應(yīng)激可有效激活NL3，促進IL-1β釋放〔15〕。通過抑制中性粒細胞數(shù)量，降低氧化應(yīng)激水平，抑制炎癥因子，可有效抑制痛風的發(fā)作。

本研究結(jié)果說明YHS不僅緩解了高尿酸血癥的癥狀，而且抑制了痛風發(fā)作過程中重要的生理生化變化。本文證實了延胡索具有成為痛風治療藥物的潛力，為延胡索作為抗痛風藥物的進一步開發(fā)提供科學基礎(chǔ)。