李清月，龔治忠，劉 剛

（安徽醫(yī)科大學 生命科學學院，安徽 合肥230032）

鳥類腸道寄生蟲是最常見、對其威脅最為明顯的病原體之一。研究表明，寄生蟲不僅可以感染鳥類，而且還可以感染哺乳動物甚至人類，具有重要的公共衛(wèi)生意義[1]。幾乎所有的野鳥和家養(yǎng)鳥類都能感染球蟲病，球蟲病的病原體主要是艾美爾球蟲屬（Eimeria）[2-3]。艾美爾球蟲是一種專性細胞內(nèi)原生寄生蟲，主要寄生在鳥類的小腸壁，生命周期較復雜，可以通過“糞-口”傳播方式在動物間傳播[4-5]。人類感染艾美爾球蟲早期癥狀不明顯，嚴重時會出現(xiàn)胃腸道不適或者慢性腹瀉、厭食、倦怠等癥狀；有時可引起發(fā)熱、持續(xù)性或者脂肪性腹瀉等急性感染癥狀，甚至會導致死亡[6]。

傳統(tǒng)的形態(tài)學方法鑒定寄生蟲存在一定的局限性，尤其是某些相似或近緣物種較為困難；此外，在鏡檢時球蟲的卵囊必須從糞便中分離出來且進行孢子的孵育，處理過程十分繁瑣，不適合規(guī)模化檢測[7]。目前，關(guān)于艾美球蟲屬物種的分子鑒定及其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系研究相關(guān)工作還比較有限且存在爭議，部分學者推測艾美爾球蟲屬具有單起源特性[8-10]，也有學者認為艾美爾球蟲可能存在多種起源[11]。如，18S rDNA 基因構(gòu)建的兔球蟲進化樹顯示，外殘體可以反映球蟲系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系，其他形態(tài)學特征對球蟲進化關(guān)系的確定影響不明顯[12]；有研究人員發(fā)現(xiàn)地域的差異性對于印度雞球蟲的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系影響不大[6]；國內(nèi)學者研究發(fā)現(xiàn)寄生于腸道的兔艾美爾球蟲親緣關(guān)系近，而寄生于肝臟的球蟲則形成單獨的進化枝[13]。目前，國內(nèi)外對于遷徙鳥類艾美爾球蟲物種鑒定和分類還存在一些爭議，系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系尚不明確。

本課題組專注于長江中下游越冬白額雁（Anser albifrons）腸道寄生蟲流行病學研究，前期研究發(fā)現(xiàn)在白額雁越冬地濕地的周邊有大量的家禽養(yǎng)殖場，常出現(xiàn)飼養(yǎng)家禽和白額雁在相同水域混群覓食的現(xiàn)象，這種混群行為增加了寄生蟲相互傳播的機會（尚未發(fā)表），大量研究表明，候鳥和飼養(yǎng)家禽在寄生蟲的傳播中起著重要的作用，造成寄生蟲疾病在家禽、候鳥之間周期性的暴發(fā)和循環(huán)感染[14-16]，因此候鳥攜帶的腸道寄生蟲可能帶來嚴重的公共衛(wèi)生風險。由于傳統(tǒng)分類方法對于寄生蟲的物種鑒定還存在一定難度，因此，遷徙鳥類的腸道寄生蟲鑒定需要更迅速、準確和效率更高的鑒定方法，大量研究表明ITS（internal transcribed spacer)基因序列具有較高的穩(wěn)定性和種間特異性[17-19]，可以作為研究屬、種分類階元的理想遺傳標記[20-21]。設(shè)計ITS 基因特異性引物，不僅用來鑒定寄生蟲的種類，而且可以研究寄生蟲物種間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，ITS 基因序列正在成為寄生蟲學研究的主要標記基因[20-21]。本研究擬通過分子生物學方法，鑒定升金湖和菜子湖越冬白額雁腸道內(nèi)攜帶的艾美爾球蟲種類，并闡明艾美爾球蟲屬部分物種間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

于2018 年11 月，采取無創(chuàng)采樣技術(shù)采集來自安徽省升金湖王壩村（30°16'58.89''N，117°0'14.64''E）和菜子湖羅嶺鎮(zhèn)（30°75'00.11.44''N，117°08'64.25.78''E）越冬白額雁的糞便樣本。在采集糞便樣品前，用雙筒或單筒望遠鏡觀察覓食雁群至少1 h，確定周圍沒有其他鳥群活動，或與其他集群有明顯的障礙物（如田埂、河溝等）間隔后方能采集，根據(jù)白額雁的足跡或覓食坑，確定為覓食地點。戴一次性PE 手套仔細辨別并采集新鮮糞便樣本，每采集一份更換一次手套，去除接觸地面的部分后，將糞便樣本放置于50 mL 無菌離心管中，貼上標簽，放于冰盒中運回實驗室，根據(jù)采集地來源及采集時間整理分裝，短期內(nèi)不能檢測的樣本放置于-20 ℃冰箱保存。

1.2 DNA 提取、PCR 擴增及球蟲鑒定

采集的白額雁糞便樣品共700 份左右，根據(jù)測序結(jié)果選出具有代表性的3 種艾美爾球蟲序列：升金湖S49 樣品，升金湖S5 樣品，以及菜子湖C70 樣品。為保證環(huán)境對寄生蟲的影響，樣品均為越冬前期所采集的白額雁糞便。采用來自TIANamp Stool DNA 試劑盒（Tiangen Biotech CO，LTD）從糞便樣品中提取總DNA，根據(jù)文獻報道的艾美爾球蟲屬ITS 基因序列設(shè)計引物，上游引物：5’-AAG TTG CGT AAA TAG AGC CCT C-3’，下游引物：5’-CAA GAC ATC CAT TGC TGA AAG T-3’。PCR 擴增體系：10×PCR Buffer 5 μL，MgCl2（25 mmol/L）4 μL，dNTP mixture（2.5 mmol/L）各4 μL，引物各（10 μmol/L）1 μL，rTaq DNA 聚合酶0.5 U，模板DNA 2 μL，滅菌雙蒸水32.5 μL，總體積50 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35 個循環(huán)后，72 ℃終延伸10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)純化后送通用生物系統(tǒng)有限公司（安徽）進行雙向測序。對獲得的ITS 基因序列進行BLAST 搜索，參考置信區(qū)間為100%的序列，推斷3 種球蟲的物種。

1.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

下載NCBI 上已釋放的艾美爾球蟲屬ITS 基因序列如表1。

表1 22 種艾美爾球蟲ITS 序列的GenBank 登錄號

以Isospora anthochaerae（GenBank 登錄號為KF766051）為外群，用CLUSTALX 2.1 軟件對序列進行比對，同時用DNAStar 軟件對不同序列進行相似性分析。用Mega 5.0 軟件對比對后的序列進行修剪并轉(zhuǎn)換成.nex 格式備用。用Mega 5.0軟件對形成的.nex 格式文件進行數(shù)據(jù)模型選擇，最終選取AIC 模式下的模型，將其應(yīng)用于系統(tǒng)樹的構(gòu)建。最大似然（maximum likelihood，ML）法構(gòu)建的系統(tǒng)樹采用PAUP 4.10 軟件，建樹前先使用Modeltest v 3.7 選擇最優(yōu)模型，然后將所得最優(yōu)模型寫入PAUP 4.10 軟件命令行中，進行最大似然法（ML 樹）建樹，建樹執(zhí)行快速支持度分析并在一次單獨的程序運行中搜索最佳分值的ML 樹的方法，自舉檢驗100 次。貝葉斯推論（Bayesian inference，BI）法構(gòu)建的系統(tǒng)樹（用MrBayes 3.1.2 軟件建立，建樹前使用Modeltest v3.7 選擇最優(yōu)模型，運行4 個馬爾可夫鏈，運行100 萬代，直至標準誤差小于0.01，每2 500 代抽樣一次，舍棄老化樣本構(gòu)建一致樹。

2 結(jié)果

參考GenBank 上釋放的艾美爾球蟲屬各球蟲置信區(qū)間最高的ITS 序列，推斷出3 種艾美爾球蟲分離株的物種：菜子湖C70 株為橢圓艾美爾球蟲（E.alabamensis），升金湖S49 株為柔嫩艾美爾球蟲（E.tenlla），升金湖S5 株為和緩艾美爾球蟲（E. mitis）。三條序列上傳至Genbank，登錄號為MN598760～MN598762。橢圓艾美爾球蟲（E.alabamensis）擴增出ITS 基因片段長度為419 bp，柔嫩艾美爾球蟲（E. tenlla）ITS 基因片段長度為271 bp，和緩艾美爾球蟲（E.mitis）ITS 基因片段長度為344 bp。另外，E. alabamensis 堿基AT 含量為64.0%，GC 含量為36.0%，E.tenlla 堿基AT 含量為60.2%，堿基GC 含量為39.8%，E.mitis 堿基AT 含量為55.3%，GC 含量為44.7%，本研究中22種艾美爾球蟲分離株堿基AT 含量最高為67.8%，堿基GC 含量最高為53.8%，堿基AT 平均含量（58.4%）略高于GC 平均含量（41.5%）如表2。

表2 22 種艾美爾球蟲分離株ITS 序列的堿基含量

3 種艾美爾球蟲ITS 序列中堿基A+T 含量為59.83%，G+C 含量為40.16%，與大多數(shù)艾美球蟲ITS 序列堿基組成含量相似如表2。

遺傳距離分析表明，E. alabamensis 菜子湖C70 株與Genbank 中的家鵝分離出的E.stigmosa和博金斯牛E. subspherica 基因型（登錄號AB769806）遺傳距離為0.15，遺傳差異較小，親緣關(guān)系最近，E. tenlla 升金湖S49 株與Genbank 中的穴兔分離出的E.magna 遺傳距離0.85，親緣關(guān)系相對較遠，E.mitis 升金湖S5 株與Genbank 中的家鵝分離出的E. hermani 以及穴兔分離出的E.magna 基因型遺傳距離為0.21，親緣關(guān)系最近如表3。3 種球蟲ITS 序列種間差異性較大，ITS序列可作為這3 種白額雁球蟲鑒別的分子標記。

表3 22 種艾美耳球蟲ITS 基因序列的遺傳距離

構(gòu)建的ML 和BI 系統(tǒng)進化樹具有相似的拓撲結(jié)構(gòu)和較高的支持率，其中ML 樹分為3 枝，第1 枝包括分離自羊的E.arloingi，分離自博金斯牛的E.bovis，E.cylindrica 和E.canadensis。第2 枝包含分離自家鵝的E. hermani，分離自白額雁的E.tenlla，E.alabamensis 和E.mitis，分離自火雞的E. dispersa，分離自家鵝的E. fulva，E. anseris 和E. stigmosa。第3 枝由分離自雞的E. media，E.maxima，E. necatrix，分離自牛的E. wyomingensis 及 分 離 自 兔 的E.flavescens，E.piriformis 組成，該進化枝的宿主均為哺乳動物，形成了一個高度支持值的分枝。此外，艾美爾球蟲菜子湖C70株（E.alabamensis）與Genbank 中的家鵝分離出的E. stigmosa（KP789173）和博金斯牛分離出的E.subspherica（AB769806）親緣關(guān)系較近，在進化樹中處于同一進化枝（自舉值為99%）；艾美爾球蟲升金湖S49 株（E.tenlla）形成單獨的分枝；艾美爾球蟲升金湖S5 株（E.mitis）與Genbank 中的家鵝分離出的E.hermani（KF977223）以及穴兔分離出的E.magna（JX406876）親緣關(guān)系較近，在進化樹中處于同一進化枝上（自舉值為99%）見圖1。BI樹的拓撲結(jié)構(gòu)與ML 樹相似見圖2，3 種來自白額雁的艾美爾球蟲均與家鵝中的艾美爾球蟲親緣關(guān)系較近，共同匯聚成一大進化枝，并且與寄生于哺乳動物如兔，山羊等艾美爾球蟲物種距離較遠。ML 樹和BI 樹的結(jié)果表明，艾美爾球蟲ITS 基因序列在系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系上也表現(xiàn)出較低的種內(nèi)變異性和較高的種間變異性。

圖1 最大似然法（ML）構(gòu)建的艾美爾球蟲屬部分物種系統(tǒng)發(fā)育樹

圖2 貝葉斯法（BI）法構(gòu)建的艾美爾球蟲屬部分物種系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論

寄生蟲疾病已成為嚴重威脅野生動物和人類健康的全球性難題，研究表明，寄生蟲不僅可以感染野生鳥類和家禽，而且具有感染哺乳動物和人的能力，對人類的威脅也在不斷增加，具有重要的公共衛(wèi)生意義[22]。分子標記法是根據(jù)寄生蟲基因特征或者核苷酸序列的差異來確定物種和基因型，ITS 基因序列具有種間特異性和種內(nèi)多樣性，能精準反應(yīng)種間或群體間的進化關(guān)系，因此，ITS基因是目前寄生蟲鑒定的重要分子標記[23-24]。從基因水平證實艾美爾球蟲菜子湖C70 株為橢圓艾美爾球蟲（E. alabamensis），艾美爾球蟲升金湖S49 株為柔嫩艾美爾球蟲（E.tenlla），艾美爾球蟲升金湖S5 株為和緩艾美爾球蟲（E.mitis），3 株艾美爾球蟲的ITS 序列與GenBank 上釋放的其它球蟲物種的ITS 序列相比變異性較低，與很多學者研究中的ITS 序列具有較高的穩(wěn)定性和種間特異性的結(jié)論相一致[24-25]。利用ITS 基因進行分析，并且與GenBank 上已登錄的艾美爾球蟲序列相對比，發(fā)現(xiàn)與所獲得的序列同源性均很高，從生物信息學角度證明ITS 基因序列可以提供有效的遺傳數(shù)據(jù)，能夠解決與鳥類相關(guān)的艾美爾球蟲系統(tǒng)學和群體遺傳學中的進一步問題。豐富了遷徙鳥類球蟲的核糖體ITS 序列，為鳥類球蟲的分類鑒定、分子流行病學調(diào)查及相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

應(yīng)用ITS 基因不僅能夠鑒定球蟲的物種，還可以用來分析球蟲不同物種之間的親緣關(guān)系，為球蟲的分子遺傳學研究提供了理論基礎(chǔ)[26]。目前對于遷徙鳥類體內(nèi)球蟲物種的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系的研究不多，且艾美爾球蟲起源的也存在爭議，系統(tǒng)發(fā)育樹表明艾美爾球蟲E.mitis，E.tenella 和E.alabamensis 與家鵝體內(nèi)的艾美爾球蟲匯聚為一枝，親緣關(guān)系較密切，來自鳥類的E. mitis，E. tenella 和E.alabamensis 遠離宿主為哺乳動物的E.arloingi，E. bovis，E.Cylindrica 以及E.canaclensis，表明樹中所有艾美爾球蟲均來自同一祖先，因此，本研究支持艾美爾球蟲為單起源的觀點[8-10]。其中一些物種聚集成與寄生蟲宿主相關(guān)的進化枝（例如，從鳥糞便中分離的物種），且宿主為鳥類的球蟲物種均匯聚為一大進化枝，而寄生于哺乳動物的球蟲物種則形成一個單獨的進化枝，并且發(fā)現(xiàn)寄生蟲與宿主的進化程度也很相似，因此艾美爾球蟲物種與宿主之間存在協(xié)同進化關(guān)系。

4 小結(jié)

本研究鑒定出越冬白額雁體內(nèi)3 種艾美爾球蟲并對其進行基因序列特征和部分物種的關(guān)系進行了分子系統(tǒng)學分析，證實了ITS 基因序列可作為鳥類艾美耳球蟲鑒定可靠的遺傳標記，也為寄生蟲的物種鑒定及流行病學研究提供了重要的理論依據(jù)。同時我們利用生物信息學構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹表明所有艾美爾球蟲均來自同一祖先，支持艾美爾球蟲為單起源觀點。此外，本研究以糞便為非損傷取樣，對糞便學的研究結(jié)果起到了補充作用。總之，研究野生越冬鳥類寄生蟲具有重要的公共衛(wèi)生意義，尤其是隨著研究的不斷深入，一些新的寄生蟲將不斷的被發(fā)現(xiàn)，而寄生蟲各個蟲種或基因型分子特性以及生物學特性的不斷闡明，將有助于人獸共患寄生蟲病互傳機制的研究，從而為預(yù)防人寄生蟲疾病乃至治療人寄生蟲疾病奠定必要的基礎(chǔ)。