文 遙 ，李德亮 ，劉小燕，曾 聰

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.上海交通大學(xué) 海洋學(xué)院，上海 200240）

外來入侵物種是指無意或故意引入非自然分布環(huán)境中的動物和植物，并對新的生境造成嚴(yán)重的負(fù)面影響[1]。隨著15世紀(jì)末16世紀(jì)初大航海時代的開啟，不僅帶來了區(qū)域間密切的交流，也促進(jìn)了許多水生生物的擴(kuò)散。自上個世紀(jì)以來，人類活動全球化的加速，外來生物入侵被視為導(dǎo)致水域生態(tài)系統(tǒng)中生物多樣性喪失和退化的重要因素之一[2]。不同于陸地生態(tài)系統(tǒng)，水域生態(tài)系統(tǒng)的外來入侵物種入侵更具隱蔽性，由于水域生態(tài)系統(tǒng)具有很高的連通性，一旦入侵成功極易擴(kuò)張爆發(fā)，基本無法做到完全清除[3]。因此，有效地監(jiān)測取決于對入侵物種的早期發(fā)現(xiàn)和準(zhǔn)確識別。

目前，基于觀察法仍然是確定水域環(huán)境中是否存在外來入侵物種的主流方法，常見方法是根據(jù)目標(biāo)物種采用電擊、捕撈、視覺或聲學(xué)調(diào)查等方法[4-5]。但是，這些常規(guī)方法中的大多數(shù)對于檢測低豐度物種（例如入侵初期的入侵物種或少量重新引入物種）不是非常有效。此外，在收集到樣品后，還需要進(jìn)行分類鑒定，但這往往在本土物種和入侵物種形態(tài)相似的情況下變得更加棘手?，F(xiàn)階段常規(guī)的形態(tài)學(xué)鑒定已無法滿足對水生外來動物入侵的監(jiān)測，需要一種更快速、更準(zhǔn)確、更標(biāo)準(zhǔn)化的物種識別方法，以便在外來入侵物種引入或擴(kuò)散的初期階段及時進(jìn)行監(jiān)測，對外來入侵物種做到更具成本效益的根除和控制[6-7]。

近年來，隨著分子生物學(xué)研究手段的發(fā)展和成熟，一種基于環(huán)境DNA（eDNA）的非侵入性新檢測技術(shù)正逐步成為監(jiān)測水生生物的熱門手段[8-9]。eDNA是指脫離生物體本身，游離在環(huán)境中的DNA，主要來源于生物體脫落到環(huán)境中的組織碎屑和排泄物等，其原理是采集少量環(huán)境介質(zhì)（水或沉積物等），基于PCR擴(kuò)增技術(shù)識別環(huán)境樣品中入侵生物的DNA，最后通過高通量測序、熒光檢測或者凝膠電泳技術(shù)完成對調(diào)查區(qū)域內(nèi)入侵生物的識別和分析[10]。但目前基于環(huán)境DNA的檢測技術(shù)仍處于發(fā)展階段，很多方法仍在優(yōu)化和摸索中，本文搜集已發(fā)表環(huán)境DNA技術(shù)檢測或監(jiān)測水生外來動物入侵（不包括微生物和哺乳動物）的135個文獻(xiàn)（截止到2020年11月19），總結(jié)基于環(huán)境DNA檢測或監(jiān)測水生外來動物入侵的研究進(jìn)展，探討環(huán)境DNA技術(shù)在檢測或監(jiān)測水生外來入侵種方面未來的主要研究方向。希望本文的綜述能夠促進(jìn)環(huán)境DNA技術(shù)在檢測或監(jiān)測水生外來入侵種相關(guān)方面的發(fā)展，并為相關(guān)研究人員利用環(huán)境DNA技術(shù)提供參考。

1 環(huán)境DNA技術(shù)在水生外來動物入侵檢測中的應(yīng)用和發(fā)展

環(huán)境DNA起源于微生物領(lǐng)域，在2008年，F(xiàn)icetola等[11]運(yùn)用環(huán)境DNA技術(shù)在法國濕地成功檢測到入侵物種美國牛蛙，開啟了環(huán)境DNA在水生外來動物入侵研究和監(jiān)測上的運(yùn)用。此后幾年，環(huán)境DNA技術(shù)應(yīng)用于水生外來動物入侵的監(jiān)測和研究報道并不多見，直到2013年后關(guān)于監(jiān)測水生入侵物種的文章迅速增加?？傮w而言，環(huán)境DNA技術(shù)在研究水生外來動物入侵的相關(guān)文獻(xiàn)出版呈上升趨勢，并在近年保持相對穩(wěn)定趨勢（圖1）。

圖1 環(huán)境DNA技術(shù)在水生外來動物入侵檢測的應(yīng)用情況

從研究生態(tài)系統(tǒng)來看，主要集中在淡水生態(tài)系統(tǒng)中（90%），進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)大多數(shù)入侵物種研究主要集中于航運(yùn)交通要道或復(fù)雜的水域環(huán)境地帶，這可能是在貿(mào)易過程中商業(yè)船舶壓載水將入侵物種不小心攜帶入境有關(guān)。從研究報道的分布來看，研究基本都集中在發(fā)達(dá)國家，其中大部分研究來自于美國（49%），其后依次為西班牙（10%）、澳大利亞（8%）、英國（6%）以及日本（5%）等國家，而在水生外來動物入侵相對較為嚴(yán)重的中國，相關(guān)案例報道卻仍比較少見（3%），這可能是由于環(huán)境DNA技術(shù)在國內(nèi)起步晚，除了方法需要在國內(nèi)研究地進(jìn)一步優(yōu)化之外，也與國內(nèi)對環(huán)境DNA研究技術(shù)接受和認(rèn)可度有關(guān)[12]。

在研究對象上，魚綱入侵（53%）是最受人們關(guān)注的，其次是雙殼綱（12%）和甲殼綱（12%）居多，其中入侵美國五大湖區(qū)的鰱和鳙是目前備受矚目的研究對象。從研究內(nèi)容來看，目前大部分研究集中在方法摸索上，包括建立方法（26.12%）和不同方法間的比較（44.78%）（圖1）。這是由于利用環(huán)境DNA技術(shù)對水生外來動物入侵進(jìn)行調(diào)查的實驗操作及后續(xù)的生物信息學(xué)分析等流程的實施還沒有成熟的技術(shù)體系，各個環(huán)節(jié)仍處于在各種實踐探索中不斷完善并逐步達(dá)成共識的狀態(tài)[13-14]。

2 環(huán)境DNA技術(shù)對水生外來動物入侵檢測的方法

目前，不同研究所采用的方法都不盡一致，為此本文結(jié)合環(huán)境DNA的技術(shù)流程，包括樣品搜集、環(huán)境DNA富集、DNA提取、特異性引物設(shè)計和結(jié)果檢測等環(huán)節(jié)，梳理對水生外來動物入侵研究的主要方法，并分析各個方法的優(yōu)勢和缺點。

2.1 樣品采集

在搜集到的研究中，基本以采集水樣獲取動物入侵物種的DNA。水樣采集量一般為15mL-100L不等，最常見的采樣體積是1L（23.08%）和2L（21.54%），在對海水和淡水生態(tài)系統(tǒng)采樣比較顯示，兩者采樣體積不存在差異。從已發(fā)表的文獻(xiàn)來看，采樣體積過小，會對檢測結(jié)果有一定的影響，但體積超過1L后則不存在明顯差異。除搜集水體之外，也有極少數(shù)研究報道采用沉積物作為樣品采集，一般為底泥的表層（圖2）。另外，少部分研究認(rèn)為樣品采集和隨后環(huán)境DNA的捕獲和提取過程中需設(shè)置陰性對照組，以保證結(jié)果的可靠性[15]。

圖2 不同采樣與富集環(huán)境DNA在水生動物入侵研究中的比較

2.2 環(huán)境DNA富集

對生物入侵環(huán)境DNA的搜集方法，與其他環(huán)境DNA研究手段基本相同，通常是通過物理方法富集環(huán)境樣品中的DNA，主要有抽濾法、沉淀法、離心法獲取。不同于其他環(huán)境DNA研究，生物入侵的研究首先關(guān)注的是入侵范圍，由于環(huán)境DNA檢測物種有/無的靈敏度高，因此采樣通常不受到體積的限制，所以三種方法在水生外來動物入侵研究上均有運(yùn)用，但最常見的還是抽濾法（圖2）。

沉淀法是指在水樣中加入乙醇、異丙醇或者乙醇-醋酸鈉等，利用相似相溶原理將DNA從液相中分離出來，從而達(dá)到富集的目的[16]。通常該方法只適用于小體積水樣（＜30mL），因為在處理過程中一般需要加入等體積或者大于樣品體積的沉淀劑，如果樣品體積過大則不便于后期處理。當(dāng)然，因樣品體積過小可能會降低環(huán)境DNA檢測的概率，特別是對于入侵物種等低濃度目標(biāo)物種的檢測，易造成假陰性現(xiàn)象[17]。

離心法是指通過高速離心使DNA從液相中分離開從而達(dá)到富集的目的，通常采用體積為50mL，從已發(fā)表的結(jié)果來看一般采用轉(zhuǎn)速4000rpm。由于設(shè)備的限制，離心體積通常不會過大，因此該方法也面臨與沉淀法類似的局限[18]。

抽濾法是指水樣通過小孔徑的濾膜將DNA富集至膜上，是富集環(huán)境DNA最常用的方法。不同于前兩者的局限，抽濾法通常不受采樣體積的限制，可以實現(xiàn)環(huán)境DNA富集量的最大化，這也是最常見的富集手段[19-20]。但抽濾法同樣存在影響富集的因素，首先過濾器孔徑的選擇會對環(huán)境DNA的富集產(chǎn)生重大影響。大部分水生外來動物入侵研究所采用的孔徑為1.5和0.45μm（圖2），但過濾器的最佳孔徑選擇在很大程度上取決于調(diào)查水域的水濁度和生物密度條件等。當(dāng)水樣中存在大量懸浮物（如藻類或泥沙）時，孔徑較小則易發(fā)生堵塞，進(jìn)而大大延長抽濾時間，一般可采用大孔徑濾膜進(jìn)行預(yù)處理。因此，有必要預(yù)先了解所調(diào)查水域的水質(zhì)情況來選擇適合的孔徑[21]。另一方面，富集DNA的載體也會影響環(huán)境DNA的富集，常用的過濾膜一般為玻璃纖維、硝化纖維、聚碳酸酯和聚醚砜等材質(zhì)（圖2），由于玻璃纖維具有將DNA吸附到其表面的化學(xué)特性，這可能提高環(huán)境DNA的富集效率[17]。例如，有研究表明采用0.7μm玻璃纖維過濾能獲得更好的環(huán)境DNA富集效果，但這還需要更多的實驗結(jié)果來支撐[22]。

目前，對于哪種富集方法更優(yōu)的結(jié)論尚未統(tǒng)一。部分研究表明乙醇沉淀法的環(huán)境DNA產(chǎn)量明顯優(yōu)于抽濾法[23-24]，另一部分研究表明使用0.2μm的混合纖維素抽濾器和0.7μm的玻璃纖維抽濾器的環(huán)境DNA富集量更佳[25]，但也有學(xué)者認(rèn)為兩種富集方法不存在明顯的差異[26]。從目前已有結(jié)果顯示，無論哪種富集方式均能成功檢測到入侵動物的DNA。

2.3 環(huán)境DNA提取方法與比較

環(huán)境DNA的檢測效果，往往與提取方法有著緊密的關(guān)系[27-28]。環(huán)境DNA富集后，由于其具有很高的靈敏度，大部分研究都選用操作簡單且回收率較高的DNA提取商業(yè)試劑盒，一般采用細(xì)菌DNA（40%）和動物組織（43%）DNA提取試劑盒。Amberg[29]等對DNeasy Blood and Tissue（Qiagen）試劑盒與 PowerWater微生物（Qiagen）試劑盒效果對比時，表明用DNeasy Blood and Tissue（Qiagen）試劑盒提取環(huán)境DNA的回收率明顯高于 PowerWater（Qiagen）試劑盒。Eichmiller[30]等對六種不同的商業(yè)試劑盒進(jìn)行測試，發(fā)現(xiàn)Fast DNA SPIN與Qiagen PowerSoil試劑盒受到PCR抑制劑等影響較小，具有較高的回收率，適用于物種檢測或定量。除此之外，液相分離法（十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）和苯酚-氯仿-異戊醇（PCI））方法也常用于環(huán)境DNA的提取。此外，在環(huán)境DNA提取方案中加入適量蛋白酶K，可有效提高環(huán)境DNA的產(chǎn)量，這些可能更加適用于對DNA質(zhì)量需求高的高通量測序[31]，如圖3所示。

圖3 不同的提取方法和擴(kuò)增長度分布

2.4 特異性引物標(biāo)記的選擇

基于環(huán)境DNA入侵物種檢測的準(zhǔn)確性和有效性在很大程度上取決于引物標(biāo)記的特異性。低分辨率引物與目標(biāo)物種DNA的結(jié)合會出現(xiàn)非目的性擴(kuò)增情況，易造成假陰性或假陽性現(xiàn)象[32]。

對現(xiàn)有基于擴(kuò)增或測序的水生外來動物入侵物種環(huán)境DNA檢測引物進(jìn)行了文獻(xiàn)檢索，該研究僅限于對檢測水生外來動物入侵而設(shè)計的引物，共117篇。由于水環(huán)境中環(huán)境DNA的濃度含量較低，再加上水生動物入侵早期種群密度小，受各種降解因素的影響極易斷裂成小的DNA片段；為提高檢測目標(biāo)物種的成功率，一般選擇的引物片段不會超過 200bp（圖 3）。COI、Cytb、D-loop、16S和12S等線粒體基因是水生入侵物種檢測最為常見的擴(kuò)增區(qū)域（圖4），其中COI在不同入侵物種環(huán)境DNA研究中使用最為廣泛，主要是具有長度適中（50-200bp），引物通用性好和易于擴(kuò)增等優(yōu)勢[33]。但有時單一的引物標(biāo)記對于目標(biāo)物種的檢測并不是唯一的選擇，通過使用多對引物集可有效提高分辨率，提高檢測結(jié)果可信度?？傮w而言，線粒體 DNA（mtDNA）拷貝數(shù)高于核 DNA（ncDNA），具有更高的PCR檢測率，大多數(shù)入侵物種的環(huán)境DNA分析都以mtDNA作為引物標(biāo)記[34]。但mtDNA標(biāo)記存在拷貝數(shù)可變、母系遺傳等缺陷，用來估計入侵物種生物量或生物體豐度存在一定的難度。有研究表明核糖體RNA基因（rDNA）的多個拷貝且固定拷貝數(shù)存在于核基因組中，在估計種群遺傳多樣性和定量入侵的種群動態(tài)具有更高的特異性和精確性[35]。

圖4 水生入侵動物DNA的研究物種類別和引物基因類型使用頻率

現(xiàn)階段，大部分開發(fā)的特異性引物都是針對單一水生動物入侵的研究，對于同時監(jiān)測多個物種的報道仍比較少見。利用多重PCR等手段對多個物種同時檢測可以更加有效降低成本和提高效率，值得進(jìn)一步探索。

2.5 環(huán)境DNA的檢測方法

水生外來動物入侵監(jiān)測研究，一般關(guān)注檢測點是否存在入侵或者入侵的生物量，而針對不同的目的，環(huán)境DNA的檢測方法也可分為定性和定量檢測。定性檢測是指借助PCR技術(shù)，通過特異性引物在環(huán)境DNA樣品中進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果判斷物種的存在與否。定量檢測則是通過擴(kuò)增產(chǎn)物的量來反映環(huán)境DNA中模板的濃度，最終確定動物入侵的相對量。

無論是定性還是定量檢測，其檢測手段又可分為基于凝膠電泳、熒光強(qiáng)度和高通量測序。凝膠電泳檢測手段是指利用常規(guī)PCR進(jìn)行特異性擴(kuò)增后，利用凝膠電泳將PCR所得的產(chǎn)物可視化，當(dāng)正確長度的PCR凝膠條帶出現(xiàn)時表明檢測為陽性，即檢測到入侵動物的存在[36]。該檢測方法具有成本低且操作方便等優(yōu)勢，還可以利用多重PCR等手段同時檢測多物種，提高檢測效率?；跓晒鈴?qiáng)度的檢測，主要包括熒光定量PCR（qPCR）和微滴度PCR（ddPCR）[37-38]。qPCR具有高特異性、敏感性以及定量等功能，也是檢測由定性向定量的過渡。ddPCR屬于最新的檢測技術(shù)，有研究將該技術(shù)與常規(guī)PCR和RT-qPCR用于同一入侵物種檢測，比較發(fā)現(xiàn)ddPCR能更精準(zhǔn)地定量目標(biāo)物種的環(huán)境DNA濃度，且分析誤差小。但該檢測技術(shù)因成本過高，使用該檢測技術(shù)的仍不多見[38]。無論是基于常規(guī)PCR還是其他擴(kuò)增儀器的檢測方法，時間和經(jīng)濟(jì)成本均相對較低，但這些方法主要針對單一水生動物入侵的檢測。雖然多重qPCR可用于多物種的檢測，但一般實際運(yùn)用中也僅能檢測2-5類物種[17]。

面對多個物種入侵或者研究動物入侵對本土動物的影響時，大多學(xué)者則采用高通量測序方法檢測。該檢測方法主要使用通用引物對環(huán)境DNA樣品進(jìn)行擴(kuò)增，獲得該樣品中某一類生物的特定DNA片段后，通過高通量的擴(kuò)增子測序和數(shù)據(jù)庫比對，從而得到物種組成信息和入侵物種的種類及數(shù)量信息[39]。不同于前面的檢測方法，高通測序的檢測不僅可以對多種入侵物種進(jìn)行定性研究，還可以通過測序得到的片段數(shù)量分析生物量來預(yù)測入侵的程度及動物入侵對本地種群的影響。隨著高通量技術(shù)的發(fā)展，測序成本的快速下降，則可能促進(jìn)該方法的廣泛運(yùn)用。當(dāng)然，多種方法聯(lián)合使用也能夠確保結(jié)果的置信度[40]。

3 環(huán)境DNA的優(yōu)勢

對比傳統(tǒng)調(diào)查方法，環(huán)境DNA技術(shù)更加依賴實驗室內(nèi)工作，大幅壓縮了野外調(diào)查和取樣的工作。不僅如此，環(huán)境DNA在成本和檢測效果方面有著更大優(yōu)勢（見表1）。

表1 環(huán)境DNA檢測技術(shù)與傳統(tǒng)調(diào)查方式的對比

3.1 成本優(yōu)勢

由于水域生態(tài)系統(tǒng)具有很高的連通性，連接著多樣的陸地生態(tài)系統(tǒng)，水生外來動物入侵調(diào)查面臨著調(diào)查范圍大以及多樣的地形地貌等挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)的調(diào)查方法需要濕地調(diào)查和記錄，需要大量的時間、設(shè)備和人力保障野外調(diào)查。環(huán)境DNA則不存在這方面的限制，只需在調(diào)查區(qū)域搜集水樣，在較難達(dá)到的采樣區(qū)域，可以通過無人機(jī)或者無人采樣船完成。隨著測序成本的下降，后續(xù)分析和檢測的成本也在不斷降低，環(huán)境DNA的成本優(yōu)勢也得到了進(jìn)一步體現(xiàn)[41]。

3.2 檢測效果優(yōu)勢

動物入侵的早期檢測非常重要，直接決定了后續(xù)控制和消滅的成本。但在早期，水生動物入侵?jǐn)?shù)量少而且水域生態(tài)系統(tǒng)多樣的遮蔽物直接導(dǎo)致傳統(tǒng)方法的發(fā)現(xiàn)率極低，特別是對個體較小的動物。例如，Dejean[42]等在比較了傳統(tǒng)調(diào)查法（基于聽覺與視覺調(diào)查）與環(huán)境DNA技術(shù)對入侵法國西南部美國牛蛙的檢測靈敏度時，發(fā)現(xiàn)環(huán)境DNA技術(shù)調(diào)查共在38處采樣地發(fā)現(xiàn)了美國牛蛙的存在，而傳統(tǒng)調(diào)查法僅有7處，可見傳統(tǒng)調(diào)查法嚴(yán)重低估了美國牛蛙的分布情況。類似的結(jié)果，在調(diào)查了美國五大湖中鰱和鳙的入侵區(qū)域分布時也發(fā)現(xiàn)了[43]。

3.3 其他

傳統(tǒng)的調(diào)查方式如捕撈或電擊調(diào)查等進(jìn)行監(jiān)測時，監(jiān)測方式自身對環(huán)境就具有高度破壞性，甚至對本土物種也有損傷。環(huán)境DNA只需采集水樣，對生境本身以及系統(tǒng)內(nèi)的生物并無影響。另外，隨著社會和科技的發(fā)展，勞動力和分類學(xué)家的減少，環(huán)境DNA有望通過分子探針和無人設(shè)備等完成自動化分析、監(jiān)測和預(yù)警，這也是傳統(tǒng)調(diào)查方法無法比擬的[41]。

4 限制環(huán)境DNA檢測的因素

利用環(huán)境DNA對水生動物檢測，雖然相較傳統(tǒng)調(diào)查方法有諸多優(yōu)勢，但是由于入侵生境的不同和生物之間的差異，仍有一些因素會影響后續(xù)對目標(biāo)物種的檢測概率。

4.1 環(huán)境DNA降解

環(huán)境DNA的質(zhì)量直接關(guān)系到后續(xù)的檢測效果，如果環(huán)境DNA發(fā)生降解導(dǎo)致擴(kuò)增失敗，則可能直接導(dǎo)致誤判。環(huán)境DNA從動物體內(nèi)脫離后就開始降解，一般而言環(huán)境DNA脫落到水環(huán)境中可持續(xù)幾小時到45天不等，而其持續(xù)時間受水溫、紫外線、pH、鹽度和底層基質(zhì)等因素的影響[44-46]。有研究表明，水溫不僅會影響環(huán)境DNA的釋放，還影響其降解的速率。水溫適宜的水域的環(huán)境DNA濃度一般較高，但水溫過高會使得微生物代謝間接加速環(huán)境DNA的降解[47]。此外，紫外輻射也會加快環(huán)境DNA的降解[48]。與淡水系統(tǒng)相比，海洋系統(tǒng)具有更高的鹽度和pH值以及更穩(wěn)定的水溫等，這些特征都更有利于環(huán)境DNA的保存[49]。到目前為止，淡水系統(tǒng)中具有最快降解速率的水環(huán)境是pH偏酸性的河流（半衰期為0.7-1.2h）[50]。海水中環(huán)境DNA的衰變率保持在6.9-71.1h之間。沉積物中含有的環(huán)境DNA保存更為持久且覆蓋物種豐富，目前已被證實環(huán)境DNA在沉積物中的持續(xù)時間可達(dá)132天[51]。

4.2 環(huán)境DNA遷移

由于水體有流動性，環(huán)境DNA在從動物體內(nèi)脫落后，會隨著水體發(fā)生擴(kuò)散或者遷徙，如果設(shè)置采樣點間距過近，則有可能因為遷移出現(xiàn)假陽性。動態(tài)水環(huán)境（河流、溪流、海洋等）中環(huán)境DNA的遷移須考慮環(huán)境DNA的生態(tài)學(xué)特征（起源、狀態(tài)、運(yùn)輸、衰變）。檢測到環(huán)境DNA的下游遷移距離隨水文條件和底層基質(zhì)而變化，也可能因物種和密度而變化[52-53]。例如，有研究發(fā)現(xiàn)溪鱒的環(huán)境DNA的遷移距離超過0.24km[54]，大西洋鮭的能達(dá)到0.96km[55]，部分淡水魚類可以達(dá)到2-3km[56]。淡水貝類環(huán)境DNA的遷移距離可能更大，如河蚌可達(dá)10km[57]。除此之外，物種密度還可能影響環(huán)境DNA的下游遷移，物種密度越高，檢測到的物種遷移距離越遠(yuǎn)[54]。

4.3 檢測抑制劑

環(huán)境DNA樣品中除了目標(biāo)物種的DNA，其他混合物會影響檢測結(jié)果，易導(dǎo)致假陰性的出現(xiàn)[53]。在環(huán)境DNA的檢測分析時，抑制劑最常見的是抑制PCR擴(kuò)增的物質(zhì)。目前減輕PCR抑制的常用方法是添加緩沖液或稀釋樣品，但目標(biāo)物種濃度過低時不提倡，或者添加制劑輔料血清白蛋白或Dax-8等[58]。盡管這些方法都能減輕潛在抑制劑的影響，但具體哪種最適用則根據(jù)樣品基質(zhì)（例如水樣或土壤樣品）而定。

4.4 檢測對象自身因素

目標(biāo)物種的個體大小、攝食及繁殖等活動都會影響環(huán)境DNA在水環(huán)境中的濃度。Klymus[59]等研究入侵物種鰱和鳙發(fā)現(xiàn)調(diào)查物種的環(huán)境DNA脫落率與生物量呈正相關(guān)，且攝食行為會增加它們的環(huán)境DNA脫落量。Nicholas[60]等研究生物量、性別比以及行為對美國小龍蝦環(huán)境DNA釋放量的影響時，發(fā)現(xiàn)美國小龍蝦在產(chǎn)卵期的環(huán)境DNA濃度顯著提高，其環(huán)境DNA檢出率可能較平常而言更高，這可能是調(diào)查物種在產(chǎn)卵期產(chǎn)生了大量的分泌物（配子、血液和排泄物等）釋放于水體所致，因此在進(jìn)行定量分析時采樣應(yīng)考慮目標(biāo)物種的繁殖周期，以最大限度地提高檢測和推斷目標(biāo)物種密度的準(zhǔn)確性。Maruyama[61]等研究表明藍(lán)鰓太陽魚的環(huán)境DNA釋放量與物種質(zhì)量呈正相關(guān)，但幼魚組的釋放率略高于成魚組，這可能是個體代謝率下降所致。此外，其他人類活動或食魚鳥類等也會導(dǎo)致水生生態(tài)系統(tǒng)中出現(xiàn)外來物種的DNA，從而影響環(huán)境DNA技術(shù)的檢測結(jié)果[62]。

5 環(huán)境DNA的未來發(fā)展方向

5.1 結(jié)合空間分析

在使用環(huán)境DNA技術(shù)調(diào)查水生外來動物入侵物種時，往往不僅關(guān)注其有無入侵和生物量，其空間分布范圍和潛在入侵地也通常受人關(guān)注。有研究表明，將環(huán)境DNA技術(shù)與統(tǒng)計模型結(jié)合可有效協(xié)助入侵物種環(huán)境DNA的調(diào)查。Riaz[63]等將環(huán)境DNA與物種空間分布預(yù)測模型相結(jié)合，精準(zhǔn)監(jiān)測了引入物種牛鱒的分布情況，同樣在泥鰍和小口黑鱸等入侵物種上也取得了不錯的效果[64-65]。此外，還可以結(jié)合遙感技術(shù)等，從更大尺度揭示入侵范圍或者潛在入侵。這些空間分析和模型能改進(jìn)環(huán)境DNA的可探測性，增加環(huán)境DNA技術(shù)檢測結(jié)果的精準(zhǔn)度，還能在空間上進(jìn)行預(yù)測和分析，是未來的一大研究方向。

5.2 檢測設(shè)備研發(fā)

隨著其他研究手段的發(fā)展和更新，便攜式的設(shè)備和更快速的檢測則可以有利于環(huán)境DNA技術(shù)的運(yùn)用和推廣。環(huán)境DNA小型便攜式儀器以及全自動化取樣和分析裝置是未來的一大發(fā)展方向。目前已有一些設(shè)備出現(xiàn)，例如便攜式qPCR儀和納米孔測序儀等，可用于環(huán)境DNA的現(xiàn)場分析，避免樣品在保存和帶回實驗室途中出現(xiàn)交叉污染以及環(huán)境DNA降解，也拓寬了環(huán)境DNA技術(shù)在復(fù)雜水域環(huán)境下的應(yīng)用[41]，但目前市面上還沒有一套完善的有針對性的檢測裝置。

跨學(xué)科技術(shù)結(jié)合也為監(jiān)測入侵物種開辟了新思路。例如，Egan[66]等利用 LTS（Light Transmission Spectroscopy）與環(huán)境DNA技術(shù)結(jié)合在美國印第安納港口附近檢測到了斑馬貽貝，實現(xiàn)了對壓艙水和港口水域中入侵物種的快速檢測。這些技術(shù)的結(jié)合，為環(huán)境DNA的檢測提供更多的可能。

6 結(jié)束語

環(huán)境DNA技術(shù)作為入侵物種早期檢測的工具十分靈敏且極具潛力，能在不干擾其他水生動物的情況下對入侵物種進(jìn)行有效跟蹤[67-68]。目前，環(huán)境DNA技術(shù)雖然已經(jīng)在該領(lǐng)域得到了一定發(fā)展，但仍需要更多地實踐以及其他技術(shù)的合作來提高環(huán)境DNA檢測的可靠性。未來，不僅在技術(shù)層面，需進(jìn)一步改進(jìn)環(huán)境DNA分析標(biāo)準(zhǔn)化（包括規(guī)范采樣方案，開發(fā)高分辨率引物，提高本地物種數(shù)據(jù)庫有效性和完整性等）；在研究手段上，也需要整合包括人工智能、大數(shù)據(jù)和遙感技術(shù)等跨學(xué)科研究手段，最終實現(xiàn)大尺度和智能化的檢測。