秦豪男，劉星婧，丁其瑞，馬 成，魏易凡，任永信*

1南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院骨科，江蘇 南京 210029；2東南大學附屬中大醫(yī)院內(nèi)分泌科，江蘇 南京 210009

實驗動物既是生命科學研究的對象和模型，又是生命科學研究的材料和支撐，無論是在基礎理論研究、臨床試驗，還是在新藥和生物制品的生產(chǎn)與檢定中都處于不可替代的位置［1］。常用的實驗動物有小鼠、大鼠、兔子、犬等，這其中以小鼠應用最為廣泛。小鼠通常性情溫馴，但被抓取時會反抗，實驗者被小鼠抓傷、咬傷情況時有發(fā)生，為保證實驗者安全，常需要固定裝置予以輔助。尾靜脈注射、斷尾采血、肌肉及膝關節(jié)腔內(nèi)注射是小鼠實驗中常用的操作技術［2-4］，對小鼠進行有效的固定是操作成功的前提之一。目前，市場上小鼠固定裝置多用金屬或有機玻璃制成，個人加工制作不易，購買成本較高，且體積較大，重量較重，攜帶不便。以往文獻報道的自制小鼠固定裝置或制作較為復雜、易于損壞［5］，或無法滿足同時固定多只小鼠的需求［6-9］。因此，本課題組自制了一種簡易、多用途的小鼠固定裝置并應用于實驗，發(fā)現(xiàn)該固定裝置制作簡單、實用性強，在操作中對小鼠實現(xiàn)了較好的固定?，F(xiàn)將制作及使用方法介紹如下。

1 材料和方法

1.1 材料

60 只8 周齡的SPF 級健康雄性C57BL/6J 小鼠，體重21～23 g，購于常州卡斯文實驗動物有限公司［SCXK（蘇）2016?0010］，飼養(yǎng)于南京醫(yī)科大學實驗動物中心［SYXK（蘇）2016?0015］。將60 只小鼠隨機分為對照組及研究組，每組30 只，對照組采用傳統(tǒng)固定器固定，研究組則采用自制固定裝置固定，先后對小鼠進行尾靜脈注射、斷尾采血及膝關節(jié)腔內(nèi)注射實驗。實驗獲本校倫理委員會批準（1903009），并按實驗動物使用的3R 原則給予人道的關懷。

廢棄50 mL 離心管（賽默飛世爾科技公司，美國），4 mL離心管（無錫耐思），15 mL離心管（康寧公司，美國），28 孔多用試管架（深圳南實地科技有限公司），手術刀柄及刀片、酒精燈、1 mL 一次性無菌注射器（江蘇蘇云），10 μL微量注射器（上海高鴿），0.9%氯化鈉注射液（批號19092842，天津中國大冢制藥有限公司），濃度1%的甲苯胺藍染液（廣州勞斯生物科技有限公司），外科顯微鏡、康尼D7100 單反相機。

1.2 方法

1.2.1 固定裝置的制作

①取洗凈的廢棄50 mL 離心管，在其底端和管蓋正中分別開一直徑約5 mm 的小孔，打磨平滑；底端小孔以作小鼠呼吸之用，管蓋小孔以作小鼠尾部操作中鼠尾通道之用（圖1A）。50 mL離心管質(zhì)地較硬，切割前可先用酒精燈行局部加熱以降低硬度便于切割。②根據(jù)小鼠體重大小，在管壁合適刻度間切割出兩個關于離心管中心軸線相對稱的直徑約為14 mm的圓孔（或正六邊形），以能恰好通過4 mL離心管為準（圖1B）。本研究采用的是在20～25 mL刻度線之間切割，可同時滿足下肢和尾部相關操作的固定要求。③配合4 mL離心管、15 mL離心管、28孔多用試管架（倒置），實驗者可根據(jù)實驗需求組裝成“一拖二”、“一拖五”等多種組合的小鼠固定裝置（圖1C～F）。

1.2.2 固定裝置的使用方法

1.2.2.1 小鼠尾靜脈注射給藥、斷尾采血

圖1 小鼠固定裝置實物及其實際應用Figure 1 The fixation device and its practical application

將固定裝置管蓋旋開平置于實驗臺上，從籠盒中取出小鼠，按標準方式左手抓取，然后右手持固定裝置（圖2A），左手持小鼠身體送入固定裝置并用右手順勢封住管口并捏住鼠尾（圖2B～C），左手再持離心管蓋，將鼠尾由通道中穿出，并旋緊管蓋（圖2D～E）。隨后將固定裝置安裝至倒置的試管架上（圖2F），即可進行小鼠尾靜脈注射給藥或斷尾采血等操作。部分實驗如葡萄糖刺激胰島素分泌實驗（glucose?stimulated insulin secretion，GSIS）［10］、葡萄糖耐受試驗（glucose tolerance test，GTT）和胰島素耐受試驗（insulin resistance test，ITT）［11］等，需要短時間內(nèi)對較多小鼠按時間點行多次斷尾采血，則可采用“一拖五”自制小鼠固定裝置（圖1D、F），采樣前提前固定小鼠，屆時只需依次采血即可。

1.2.2.2 小鼠膝關節(jié)腔內(nèi)注射

以膝關節(jié)腔內(nèi)注射為例：右手封住離心管雙側圓孔，左手持已麻醉好的小鼠送入離心管并推至底端（注意將小鼠鼻腔對準管底小孔），旋緊管蓋（圖3A～C）；持鑷子輕輕將小鼠下肢從側壁圓孔中牽出，用拇指和食指固定，并充分屈曲膝關節(jié)，定位膝關節(jié)腔位置，即可進行膝關節(jié)腔內(nèi)注射（圖3D～F）。如需雙側注射，則將已注射下肢回納，同樣方法注射另一下肢。此外，對于單人徒手行小鼠肌肉注射有困難的實驗人員，可借助本固定裝置輔助固定，方法同上，但由于肌肉注射無需麻醉，右手封住雙側圓孔處應墊硬紙板以保護手指防止咬傷抓傷。

圖2 小鼠固定裝置使用流程Figure 2 Instruction for use of the fixation device

圖3 膝關節(jié)腔內(nèi)注射固定方法Figure 3 Procedure of intra?articular injection

1.2.3 觀察指標

1.2.3.1 操作時間

從將小鼠取出鼠籠開始計時，至注射或采血完成將小鼠放回籠內(nèi)為止，計時每只小鼠操作時間（尾靜脈注射組：注射生理鹽水0.3 mL/只；斷尾采血組：采血量為0.3 mL/只；膝關節(jié)腔內(nèi)注射組：注射甲苯胺藍染液10 μL/關節(jié)腔，計時注射雙側膝關節(jié)總時間，預先麻醉過程及注射后按壓時間不計入操作時間內(nèi)）。

1.2.3.2 成功率

尾靜脈注射及斷尾采血組：以一次性完整完成上述操作為成功標準；膝關節(jié)腔內(nèi)注射組：以關節(jié)囊內(nèi)軟骨組織明顯藍染、且甲苯胺藍染液無溢出及異位染色為成功標準，成功率以關節(jié)計數(shù)。成功率=成功注射或采血小鼠數(shù)量/該組實驗小鼠總數(shù)量×100%。

1.2.3.3 膝關節(jié)腔內(nèi)注射的穩(wěn)定性及可重復性

采用甲苯胺藍染液進行膝關節(jié)腔內(nèi)注射，對比傳統(tǒng)單純手法固定與該自制固定裝置固定，染料在關節(jié)腔內(nèi)的分布情況，驗證自制固定裝置關節(jié)腔內(nèi)微量注射的穩(wěn)定性與可重復性［12］。麻醉小鼠后備皮消毒，采用相應固定方法予以固定，用拇指和食指固定并充分屈曲膝關節(jié)，定位膝關節(jié)腔位置，應用微量注射器以髕韌帶內(nèi)緣中點為進針點，順關節(jié)間隙方向約1.5 mm 深度注射甲苯胺藍染液入關節(jié)腔，拔針后稍用力加壓針眼處2 min。取膝關節(jié)正中縱向皮膚切口，長約2 cm，暴露關節(jié)囊觀察染液充盈情況。處死小鼠后，切開關節(jié)囊，切斷前后交叉韌帶，充分暴露關節(jié)面，觀察軟骨組織染色情況。

1.3 統(tǒng)計學方法

應用SPSS21.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料以均值±標準差（）表示，采用獨立樣本t檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 自制小鼠固定裝置相關參數(shù)

本自制小鼠固定裝置主要取材于50 mL 離心管，其質(zhì)量為12 g，長約11.6 cm，直徑約3.4 cm；全套“一拖五”小鼠固定裝置（圖1D）總質(zhì)量為164 g，大小為20.5 cm×10.0 cm×9.4 cm；制作采用廢棄離心管，成本為0；全套制作時間約15 min。

2.2 操作時間、成功率、實驗人員受傷及小鼠意外死亡情況

在整個實驗過程中，小鼠平靜、無激惹，未發(fā)生小鼠意外傷殘、窒息死亡等情況；實驗人員沒有發(fā)生被咬傷抓傷等情況。具體各組尾靜脈注射、斷尾采血及膝關節(jié)腔內(nèi)注射操作時間及成功率見表1。

2.3 甲苯胺藍染液膝關節(jié)腔內(nèi)注射

小鼠正常膝關節(jié)囊及膝關節(jié)解剖如圖4A～B所示，關節(jié)囊薄而柔潤，關節(jié)腔內(nèi)分泌有透明蛋清樣滑液。成功注射甲苯胺藍染液可見關節(jié)囊內(nèi)充盈藍染，切開關節(jié)囊后軟骨組織明顯藍染（圖4C、D）。相對于傳統(tǒng)單純手法固定組，自制固定裝置固定組的關節(jié)囊內(nèi)軟骨組織藍染更加充分，甲苯胺藍染液溢出、異位染色等情況發(fā)生率更低，膝關節(jié)腔內(nèi)注射成功率更高（表1）。

表1 對照組與研究組完成注射或采血的操作時間及成功率Table 1 Operation time and success rate of injection or blood collection in control and study groups

3 討論

良好的固定是進行動物實驗的基礎，也是眾多科研工作的前提。在大多無需麻醉的實驗中，小鼠活動性較強，會對操作產(chǎn)生一定的干擾，常需要固定裝置予以輔助固定。但市售的傳統(tǒng)固定裝置存在以下幾個缺點：①購買價格較高，增加實驗成本；②多為金屬或有機玻璃制成，制作過程復雜，個人制作不易；③市售“一拖五”固定器架體積重量較大，占據(jù)空間，攜帶不便?；谝陨系囊恍┰颍簧賹嶒炚咴趯嶒炦^程中摸索出了一些實用的固定方法，但依舊存在著制作過程較為復雜、裝置易于損壞，或無法滿足同時固定多只小鼠的需求等不足。為此，有必要設計一種制作簡單、固定牢靠、方便易攜、用途多樣，且可同時固定多只小鼠的固定裝置。在實踐過程中，利用實驗室中廢棄的離心管，配合閑置的試管架，進行了如上設計。為了檢驗自制小鼠固定裝置的安全性和實用性，本課題組進行了相關實驗研究。

圖4 小鼠膝關節(jié)腔內(nèi)注射Figure 4 Intra?articular injection of mouse knee

在小鼠尾靜脈注射及斷尾采血實驗中，發(fā)現(xiàn)對照組和研究組的注射及采血成功率均達到100%，相對于對照組，研究組的注射及采血操作時間相對較少。對于小鼠尾靜脈注射，李軼倞等［13］采用籠蓋壓制法在一定程度上解決了小鼠的固定問題，但由于小鼠在鼠籠里活動范圍廣，實驗過程中小鼠容易因外界環(huán)境以及人為操作發(fā)生激惹而影響操作，實驗人員需要較高的熟練度才能順利快速完成注射；同時，籠蓋壓制法固定效果有限，小鼠尾部受壓較嚴重，且小鼠身體相較尾部體位更低，無法應用于小鼠斷尾采血實驗。而本固定裝置對小鼠固定牢靠，可根據(jù)實驗需要隨意調(diào)整固定器位置，滿足了小鼠尾靜脈注射及斷尾采血操作的固定要求，尤其在采血小鼠數(shù)量較多、采血時間點有要求的情況下，配合實驗助手及備用固定器（圖1B），采用“一拖五”組合（圖1D），可以更好地提高實驗效率，保障實驗數(shù)據(jù)的準確性。

相對于小鼠尾靜脈注射，小鼠膝關節(jié)腔內(nèi)注射精確度要求更高、難度更大，通常需要預先麻醉小鼠。傳統(tǒng)固定器因體積較大、筒壁較厚，導致手持不便、小鼠下肢暴露不充分，不適合作為小鼠膝關節(jié)腔內(nèi)注射的固定器；而傳統(tǒng)單純手法固定無法實現(xiàn)小鼠的充分固定，小鼠常因麻醉效果欠佳及疼痛刺激而產(chǎn)生抵抗活動，不僅會影響操作的流暢性、增加注射失敗率，還存在實驗人員被抓傷咬傷的風險。目前市面上及以往文獻報道中，還未出現(xiàn)針對于小鼠膝關節(jié)腔內(nèi)注射的固定器。為了研究該自制固定裝置關節(jié)腔內(nèi)微量注射的穩(wěn)定性與可重復性，分別采用傳統(tǒng)單純手法固定與自制固定裝置固定的方法，進行小鼠膝關節(jié)腔內(nèi)注射甲苯胺藍染液實驗。實驗發(fā)現(xiàn)，相對于傳統(tǒng)單純手法固定，自制固定裝置組固定牢靠、小鼠膝關節(jié)暴露充分，操作時間更少，一人即可順利完成小鼠膝關節(jié)腔內(nèi)注射；同時，自制固定裝置組關節(jié)囊內(nèi)軟骨組織藍染更加充分，甲苯胺藍染液溢出、異位染色等情況發(fā)生率低，相對于傳統(tǒng)單純手法固定成功率更高。此外，對于徒手進行肌肉注射有難度的實驗人員，也可以利用本固定裝置，順利完成肌肉注射。

在全部實驗中，小鼠平靜、無激惹，未發(fā)生小鼠意外傷殘、窒息死亡等情況；同時，實驗人員也沒有發(fā)生被咬傷抓傷等情況，證明了該自制固定裝置對于小鼠及實驗人員都具有較高的安全性。整體而言，該自制固定裝置與傳統(tǒng)固定器及其他自制固定器對比，具有以下優(yōu)點：①取材于廢棄的50 mL離心管，材料易得，環(huán)保，且制作簡單、不易損壞、方便清洗消毒；②結構小巧，攜帶方便，可隨時組裝拆卸，按“一拖五”模式組裝可同時固定多只小鼠，提高工作效率；③一物多用，在滿足傳統(tǒng)固定器的小鼠尾靜脈注射、斷尾采血的固定要求基礎上，進一步滿足了小鼠肌肉及膝關節(jié)腔內(nèi)注射的固定要求；④裝置透明且無毒無害，利于隨時觀察小鼠狀態(tài)，保障小鼠安全；⑤操作方便，固定牢靠，很好地保證了實驗人員的安全。需要指出的是自制小鼠固定器的使用也與實驗人員的技術熟練程度有關，隨著熟練程度的增加，操作時間會隨之減少。由于本課題組實驗技術人員均能熟練地應用這種固定方法，因此在用時上較短。新的操作人員可能需要一定時間的練習才可在較短時間內(nèi)完成一系列注射操作。此外，實驗人員可以根據(jù)自己的操作習慣尋找適宜自己的固定步驟，如利用小鼠的鉆孔習性，操作者可右手提起待操作小鼠尾巴，使其頭部對準離心管開口處，順勢將小鼠裝進離心管內(nèi)而代替抓取步驟等。這里將最常使用的傳統(tǒng)固定器與本實驗自制小鼠固定器固定法從安全性、觀察性、消毒性、適用范圍、費用、便攜性、大批量操作方面進行了比較，供實驗人員參考。

綜上所述，該自制小鼠固定裝置及使用方法切實可行，具有實際應用價值，不僅可以代替市售的傳統(tǒng)固定器滿足小鼠尾靜脈注射、斷尾采血等操作固定要求，同時也為小鼠肌肉及膝關節(jié)腔內(nèi)注射提供了一種安全、有效的固定方法。