劉助紅，張璜，唐玲，劉賢旭，林潔文，吳林

（1.廣東科貿(mào)職業(yè)學(xué)院，廣東 廣州 510430；2.廣州雙螺旋基因科技有限公司，廣東 廣州 510005；3.暨南大學(xué)，廣東 廣州 510632）

羅非魚（又名非洲鯽魚）蛋白質(zhì)含量高、少刺而深受消費者喜愛，被世界糧農(nóng)組織（FAO）稱作未來動物性蛋白質(zhì)的主要來源[1-3]，是世界水產(chǎn)業(yè)重點研究和養(yǎng)殖的淡水魚類之一。與其他魚類相比，羅非魚抗病力強(qiáng)，更容易養(yǎng)殖，自引入我國后，羅非魚的養(yǎng)殖業(yè)得到了飛速發(fā)展，養(yǎng)殖產(chǎn)量逐年增長，目前已成為世界羅非魚生產(chǎn)大國和出口大國[4,5]。

2009 年，由一種新型的病毒感染引起基內(nèi)雷特湖（Kinneret Lake）的羅非魚大量死亡，該病毒被命名為羅湖病毒（Tilapia lake virus，TiLV），這種病毒通過水源等介質(zhì)傳播[3,6]。2014 年，Marina Eyngo 等[6]通過cDNA 篩選文庫法確定了羅湖病毒（TiLV）的特異性序列（GenBank:KJ605629），長度為1 326 bp，在GenBank 的核酸序列數(shù)據(jù)庫中未發(fā)現(xiàn)同源性序列的存在。

近年來，這種新出現(xiàn)的RNA 病毒，使以色列、厄瓜多爾和埃及等國家養(yǎng)殖的羅非魚大面積死亡[6-8]。2015 年后泰國也大面積感染[9]。2017 年6月，我國臺灣地區(qū)、海南文昌地區(qū)也檢測出大量陽性樣本，羅非魚養(yǎng)殖業(yè)遭到重創(chuàng)[10]。

鑒于該病毒危害的嚴(yán)重性，全國水產(chǎn)技術(shù)推廣總站要求各級部門應(yīng)加強(qiáng)對羅湖病毒病的監(jiān)測，尤其是養(yǎng)殖場在采購羅非魚苗種時，一定要加強(qiáng)對苗種的檢驗檢疫，從源頭上控制羅湖病毒的爆發(fā)。Notomi于2000年發(fā)明了LAMP（Loop-mediated isothermal amplification）檢測技術(shù)，通過對目標(biāo)基因的6 個區(qū)域，設(shè)計4 對特異性引物，利用高活性的鏈置換DNA 聚合酶（Bst DNA polymerase）在60～65℃的恒溫條件下，經(jīng)過30～60 min 的反應(yīng)，即可完成病原的檢測[11,12]。該擴(kuò)增技術(shù)是一種新型核酸擴(kuò)增檢測技術(shù)，靈敏度、特異性等都有極大的提升，進(jìn)而保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，目前已廣泛應(yīng)用于動物疫病、食品安全等多方面的檢測[13-17]。本文通過對該檢測技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)，針對羅湖病毒特異性的靶基因設(shè)計引物，建立實時熒光RT-LAMP 檢測技術(shù)，可用于羅非魚苗種企業(yè)或養(yǎng)殖場羅湖病毒的檢測。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器設(shè)備與試劑

恒溫?zé)晒鈾z測儀（廣州雙螺旋基因科技有限公司），超微量分光光度計，冷凍離心機(jī)，PCR 擴(kuò)增儀，凝膠成像系統(tǒng)，電泳儀，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara 公司），Bst 2.0 WarmStartDNA Polymerase（New England Biolabs（Beijing）LTD），Premix TaqTMHot Start Version（Takara 公司），dNTP Mixture（10 mM each，Takara），TRIzol試劑（Thermo scientific 公司），質(zhì)粒提取試劑盒（Omega 公司），T-Vector pMDTM20（Takara 公司），DH5α（Takara 公司）等。

1.1.2 樣品來源

羅湖病毒（TiLV）、草魚呼腸孤病毒（Grass carp reovirus Virus，GCRV）、鯉春病毒血癥病毒（Spring Viremia of Carp Virus，SVCV）、病毒性出血性敗血癥病毒（Viral Hemorrhagic Septicemia Virus，VHSV）、傳染性造血組織壞死病毒（Infectious Hematopoietic Necrosis Virus，IHNV）核酸RNA 來自合作單位廣州雙螺旋基因技術(shù)有限公司。31 份實驗樣品采自廣東、海南地區(qū)相關(guān)的羅非魚養(yǎng)殖場，其中12 份來自廣東省高州市（3 份肝臟組織，2 份大腦組織，7 份腎臟組織），19 份來自海南省文昌市，均為腎臟組織。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計與合成

根據(jù)GeneBank 數(shù)據(jù)庫中登記的TiLV 毒株基因片段（GeneBank：KJ605629）的保守序列，利用LAMP 設(shè)計軟件設(shè)計引物（表1）。設(shè)計的引物交由上海生工生物工程有限公司合成與純化。

1.2.2 RNA 提取與cDNA 合成

采集發(fā)病死亡的羅非魚肝臟、腎臟和大腦等組織，采用TRIzol試劑進(jìn)行固定保存，帶回實驗室后采用RNA 提取試劑盒提取樣本中的病毒總RNA，溶解于100 μL 無RNase A 的水中，于-80℃保存。

根據(jù)從Takara 公司購買的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，按照如下步驟進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄得到總的cDNA。提取的RNA 5 μL，oligo dT（50 μmol·L-1）1 μL，dNTP（10 mmol·L-1）1 μL，加入DEPC 水補(bǔ)充到10 μL。充分混勻后于63℃反應(yīng)5 min，然后冰浴2 min，簡單離心后加入5×buffer 4 μL，RNase inhibitor（40 U·μL-1）0.5 μL，1 μL PrimeScript RTase（200 U·μL-1），混勻離心后于45℃保溫60 min，最后于95℃放置10 min 終止反應(yīng)。

表1 實時熒光RT-LAMP 引物Tab.1 Real-time RT-LAMP primers

1.2.3 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建

以1.2.2 中合成的cDNA 為核酸模板，采用TiLV 的外引物TiLVOF/TiLVOB 配制PCR 反應(yīng)體系：2×Premix TaqTM12.5 μL，TiLVOF（10 μmol·L-1）1.0 μL,TiLVOB（10 μmol·L-1）1.0 μL，cDNA 2.0 μL，補(bǔ)水至體系總體積為25 μL。根據(jù)如下反應(yīng)程序進(jìn)行擴(kuò)增：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，循環(huán)32 次；72℃延伸10 min。反應(yīng)完后，電泳切膠回收擴(kuò)增的目標(biāo)條帶，純化后連接到T-Vector pMDTM20 載體中，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α 后涂布平板，挑取克隆進(jìn)行陽性鑒定、保存。對陽性克隆接種放大培養(yǎng)后采用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒作為陽性對照，用于后續(xù)分析。

1.2.4 實時熒光LAMP 反應(yīng)體系的建立

1.2.5 靈敏度檢測

將1.2.3 中提取的質(zhì)粒測得濃度后稀釋定量為1 ng·μL-1，然后用去離子水以10 倍的比例進(jìn)行梯度稀釋，分別獲得濃度為100 pg·μL-1、10 pg·μL-1、1 pg·μL-1、100 fg·μL-1、10 fg·μL-1、1 fg·μL-1、0.1 fg·μL-1和0.01 fg·μL-1的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒濃度，按照上述建立的實時熒光LAMP 反應(yīng)體系進(jìn)行檢測，得到該方法對質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的檢測靈敏度。

1.2.6 實時熒光RT-LAMP 反應(yīng)體系的建立

為了實現(xiàn)對樣本進(jìn)行一步法檢測，建立如下實時熒光RT-LAMP 反應(yīng)體系：按照1.2.4 中建立的實時熒光LAMP 反應(yīng)體系，加入0.5 μL 逆轉(zhuǎn)錄酶，以1.2.2 中提取的總RNA 為模板，補(bǔ)充水至25 μL，置于恒溫?zé)晒鈾z測儀上，設(shè)置反應(yīng)溫度63℃，反應(yīng)時間45 min，按照1.2.4 中的方法觀察反應(yīng)結(jié)果，同時，與1.2.4 中建立的實時熒光LAMP 法的檢測結(jié)果進(jìn)行比較。

1.2.7 特異性檢測

分別以草魚呼腸孤病毒、鯉春病毒血癥病毒、病毒性出血性敗血癥病毒、傳染性造血組織壞死病毒等核酸為模板，按照上述建立的實時熒光RT-LAMP反應(yīng)體系進(jìn)行檢測，驗證該檢測方法的特異性。

1.2.8 組織樣本的實時熒光RT-LAMP 檢測和RT-PCR 檢測

從廣東、海南地區(qū)的羅非魚養(yǎng)殖場收集相關(guān)組織樣本31 份，通過病毒RNA 提取試劑盒提取組織樣本的核酸，運用本文建立的實時熒光RT-LAMP方法進(jìn)行檢測。同時，采用文獻(xiàn)報道的RT-PCR 方法進(jìn)行平行驗證，統(tǒng)計兩種不同檢測方法的符合率。

表2 RT-PCR 引物[6]Tab.2 RT-PCR primers[6]

2 結(jié)果和分析

2.1 目標(biāo)片段的擴(kuò)增與質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建

實時熒光RT-LAMP 外引物TiLVOF/TiLVOB對目標(biāo)片段的擴(kuò)增結(jié)果如圖1。由圖1 可知，片段大小約為233 bp，測序表明為目標(biāo)片段。通過轉(zhuǎn)化克隆至DH5α 中，放大培養(yǎng)后提取的質(zhì)粒濃度為64ng·μL-1，按如下公式：拷貝數(shù)（copies·μL-1）=6×1023（copies·mol-1）×DNA 濃度（g·μL-1）/質(zhì)量MW（g·mol-1）換算成拷貝數(shù)，提取的質(zhì)粒相當(dāng)于1.9×1010copies·μL-1。

圖1 TiLVOF/TiLVOB 引物的PCR 分析結(jié)果Fig.1 PCR result of TiLVOF/TiLVOB primers

2.2 引物靈敏度檢測結(jié)果

以稀釋的各個濃度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板，進(jìn)行實時熒光LAMP 檢測（圖2）。由圖2 可知，引物對質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的檢測靈敏度可達(dá)到0.1 fg·μL-1，該濃度相當(dāng)于30 copies/反應(yīng)的質(zhì)粒數(shù)量。該恒溫檢測儀可顯示陽性判定時間，濃度越高的樣本，顯示陽性的時間更早（表3）。

圖2 實時熒光LAMP 對不同濃度質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品檢測結(jié)果Fig.2 The result of Real-time LAMP for different concentration of standard plasmids

表3 核酸濃度與儀器陽性判定時間的關(guān)系Tab.3 The relationship between nucleic acid concentration and positive determination time in instrument

2.3 實時熒光RT-LAMP 與實時熒光LAMP 檢測結(jié)果的比較

通過對以提取的總RNA 為模板進(jìn)行一步法實時熒光RT-LAMP 反應(yīng)，與先進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)再進(jìn)行實時熒光LAMP 反應(yīng)的兩步法進(jìn)行比較，兩者檢測的結(jié)果完全一致，無模板對照均為陰性，陽性對照檢測結(jié)果均為陽性（圖3）。

圖3 實時熒光LAMP 與實時熒光RT-LAMP 檢測結(jié)果Fig.3 The results of Real-time LAMP method and Realtime RT-LAMP method

2.4 引物特異性檢測結(jié)果

通過特異性分析，結(jié)果除了羅湖病毒（TiLV）核酸外，其他幾種常見的魚類病毒（GCRV/SVCV/VHSV/IHNV）的核酸均未出現(xiàn)擴(kuò)增，儀器判定均為陰性（圖4）。

圖4 實時熒光RT-LAMP 檢測方法特異性驗證Fig.4 Specificity of Real-time RT-LAMP method

2.5 組織樣本實時熒光RT-LAMP 和RT-PCR檢測結(jié)果的比較

采用本研究建立的實時熒光RT-LAMP 檢測方法，針對在羅非魚養(yǎng)殖基地收集的31 份樣本進(jìn)行檢測，同時，以文獻(xiàn)中的RT-PCR 方法進(jìn)行平行檢測（表4）。31 份組織樣本中，RT-PCR 檢測出陽性樣本2 份，實時熒光RT-LAMP 檢測出陽性樣本3 份，陰性樣本28 份。與RT-PCR 方法相比較，檢測結(jié)果基本相符，兩者的符合率為97%。

表4 實時熒光RT-LAMP 和RT-PCR 檢測結(jié)果比較Tab.4 Detection comparison of Real-time RT-LAMP with RT-PCR

3 討論

羅湖病毒自從出現(xiàn)以來，給泰國乃至全球的羅非魚養(yǎng)殖業(yè)造成了重大損失[18]。Bacharach 和Tattiyapong 等[9,19]深入研究了羅湖病毒的基因組DNA及感染性、致病性等。Fathi 等建立了PCR 的檢測方法，但傳統(tǒng)的PCR 方法檢測靈敏度不夠，檢測的靈敏度大概在70,000 copies，而本方法檢測的靈敏度可以達(dá)到30 copies[8]。在臨床樣本的檢測中，本方法比RT-PCR 方法多檢測出陽性樣本1 份，通過熒光定量PCR 分析后該樣本確為陽性，這也間接證明了該方法的靈敏度比RT-PCR 方法高，避免了大量的漏檢情況，更好地起到了預(yù)警作用[20]。后來，泰國Kembou 和Tattiyapong 等[21，22]用巢式PCR、熒光定量PCR 等方法檢測羅湖病毒，檢測靈敏度分別為7 copies 和2 copies，雖然靈敏度比本文建立的方法高，但巢式PCR 方法仍需要通過變溫設(shè)備進(jìn)行反應(yīng)，檢測結(jié)果需要通過電泳等方法進(jìn)行判定，無法滿足養(yǎng)殖現(xiàn)場檢測，而熒光定量PCR 需要昂貴的設(shè)備和專業(yè)的技術(shù)人員來輔助檢測，也無法滿足水產(chǎn)行業(yè)的要求。本文建立的實時熒光RT-LAMP 檢測方法克服了上述缺點，在保證較高靈敏度的情況下，擺脫了復(fù)雜的操作步驟或昂貴儀器的限制。同時，檢測樣本的病毒核酸濃度與儀器陽性判定時間呈現(xiàn)良好遞增關(guān)系，可進(jìn)行半定量檢測，這對于病毒的定量檢測具有實際意義。本文建立的方法特異性好，對魚類常見的其他病毒均無檢出，保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，檢測時間短，可在1 h 內(nèi)完成，實現(xiàn)樣本的高效檢測。

綜上所述，本文建立的方法非常適合在硬件條件比較薄弱、地理位置相對偏遠(yuǎn)的水產(chǎn)養(yǎng)殖現(xiàn)場進(jìn)行檢測，推廣該檢測技術(shù)對羅非魚養(yǎng)殖中羅湖病毒的早期預(yù)警和病毒的動態(tài)監(jiān)測具有非常好的效果。