李勇慧，于相麗，周曉君

（洛陽師范學院 生命科學學院，河南 洛陽 471934）

鐵線蓮屬（CLematis L.） 是毛茛科（Ranuncu－Laceae）植物，大約有300多種，河南省的北部、南部和西部山區(qū)是大多數(shù)鐵線蓮分布的地區(qū)[1]。鐵線蓮有較高的藥用價值，如治療風濕、腫瘤，也有利于利尿等，這就使它的經(jīng)濟價值也非常高[2]。另外，鐵線蓮屬植物有許多品種，花型多種多樣，顏色艷麗，再加上葉片的修飾，使鐵線蓮具有較高的觀賞價值，在城市綠化方面被廣泛使用[3-4]。簡單重復序列（simple sequence repeat，SSR）亦可稱為微衛(wèi)星（microsatellite），是目前最常用的微衛(wèi)星標記之一，在真核生物的基因組編碼區(qū)以及非編碼區(qū)廣泛地分布[5]?？梢愿鶕?jù)已知的側(cè)翼序列設計出引物用于PCR擴增，將所需的衛(wèi)星位點擴增出來，最后使用聚丙烯凝膠電泳進行跑膠，使實驗結(jié)果更加直觀[6]。SSR分子標記技術(shù)相比于其他技術(shù)有許多優(yōu)點，如良好的多態(tài)性，穩(wěn)定性好，操作時難度不大，有較強的重復性，成本低等[7-8]。同時它的應用前景非常廣泛，近幾年在引物篩選、植物種質(zhì)資源分析等多個方面都有它的身影。

目前對鐵線蓮遺傳多樣性的研究大多圍繞著細胞學和形態(tài)學這幾個方面[9]，少數(shù)的有關(guān)于分子方面的研究多集中在ISSR分子標記技術(shù)方面，如任夏萌等[10]利用ISSR分子標記技術(shù)對大葉鐵線蓮的種質(zhì)遺傳多樣性進行了分析。但近年來SSR技術(shù)廣泛應用于各種植物的遺傳多樣性分析中，如吳文強等人[11]用SSR技術(shù)標記藜麥基因組相對位點并進行擴增，然后用PAGE進行檢測，對其遺傳多樣性進行分析，用同樣方法的還有張佳欣等人[12]。鐵線蓮屬植物SSR-PCR反應體系的優(yōu)化及引物篩選方面尚未有人進行研究。因此，本實驗對鐵線蓮屬植物SSR-PCR反應體系進行優(yōu)化研究。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗從洛陽市周邊不同區(qū)域的鐵線蓮屬植物中選取粗齒、陜西、太行、大葉和鈍萼五種鐵線蓮，并將其分別用 Tc、Ts、Tt、Td 和Te編號，然后進行實驗（見表1）。

1.2 實驗方法

1.2.1 DNA提取

采用改良的CTAB法對這五種鐵線蓮進行DNA提取。

1.2.2 檢測葉片DNA的提取結(jié)果

為了確定DNA是否被提取出來，本實驗將采用瓊脂糖凝膠電泳法對DNA進行檢驗，通過跑出來的條帶的亮度和清晰度來確定DNA是否被提取出來以及濃度高低。為了使實驗結(jié)果更加準確，用分光光度計對DNA的密度和其A260∶A280的比值來判斷DNA純度。

1.2.3 SSR-PCR反應體系的建立與優(yōu)化

從剛提取的DNA中挑選出條帶明顯、亮度高的Ts1、Tc42、Tt51和Te8等4個DNA作為模板，用編號為30的引物對PCR反應體系進行優(yōu)化。首先優(yōu)化PCR的擴增體系，詳情如下：2×pcr mixture 5 μL，DNA 模板0.3 μL/0.5 μL/0.7 μL；正向和反向引物各 0.5 μL。

其次優(yōu)化退火溫度，基于已經(jīng)優(yōu)化好的PCR的擴增體系，選擇條帶明顯、亮度高的Ts1、Tc42、Tt51和Te8 4個DNA作為模板，然后將退火的溫度設置成51℃、53℃和55℃，篩選出最佳退火溫度。

1.2.4 PCR擴增、電泳

用優(yōu)化好的PCR的最佳反應體系和反應程序，從已經(jīng)提取出來的DNA中選出最好的4個DNA，Ts1、Tc42、Tt51和Te8作為樣品，再挑選引物進行擴增。PCR擴增體系為：正反引物各 0.5 μL，ddH2O 3.5 μL，2×pcr mixture 5 μL，DNA 模板 0.5 μL，總體系共計 10.0 μL。PCR的擴增程序見表2，低溫保存產(chǎn)物。

表2 PCR擴增程序

將電壓設置成300 V，電流為150 mA，聚丙烯酰胺凝膠電泳3 h，然后進行銀染檢測。

2 實驗結(jié)果

2.1 模板濃度與最佳退火溫度篩選結(jié)果

以Ts1、Tc42、Tt51和Te8作為模板，用編號為30的引物對DNA模板的濃度梯度進行篩選。篩選結(jié)果如圖1所示，表明當體系中加入0.3 μL的DNA時，膠片上的條帶不太清晰，當體系中加入0.5 μL或者0.7 μL DNA時，膠片上的條帶清晰。

圖1 DNA濃度梯度篩選

以Ts1、Tc42、Tt51和Te8作為模板，將30號引物的退火的溫度設置成51℃、53℃和55℃進行溫度梯度篩選。篩選結(jié)果如圖2所示，在退火溫度為51℃和55℃時，擴增出來條帶不清晰，有拖尾現(xiàn)象，僅當53℃時，跑出來的條帶才清晰，即為30號引物的最佳退火溫度。

圖2 退火溫度梯度篩選

2.2 SSR引物篩選及擴增結(jié)果

用已經(jīng)篩選出來的PCR最佳反應體系和純合程度高的Ts1、Tc42、Tt51和Te8這4個DNA，對已有的100條引物進行多態(tài)性篩選，從其中選擇出目標區(qū)段間有清晰條帶的、多態(tài)性豐富的、穩(wěn)定性好的6條引物，以便用于后期的鐵線蓮種質(zhì)遺傳多樣性分析。篩選出的最佳引物為分別為 CH-10、CH-15、CH-28、CH-30、CH-96、CH-100，最佳退火溫度分別為 53、52、51、53、52、51℃，引物篩選結(jié)果如圖3-圖5所示。

圖3 15、30、67、96、63、56、41 號引物篩選圖

圖4 42、28、89、80、13、32、10、7、37 號引物篩選圖

圖5 46號擴增結(jié)果

3 討論

朱芹等人[13]在優(yōu)化刨花潤楠的SSR-PCR體系時發(fā)現(xiàn)Taq酶的濃度對實驗結(jié)果有很大的影響，并著重對其進行優(yōu)化。本實驗則從DNA濃度方面優(yōu)化體系。何仁鋒等[14]人在對菊花進行SSR-PCR體系優(yōu)化時也曾對DNA濃度進行優(yōu)化，并得出以下結(jié)論：一般而言，PCR擴增過程中模板DNA不會對PCR的結(jié)果產(chǎn)生多大影響，對結(jié)果有較大影響的是DNA的濃度，當實驗用到DNA濃度較高時，對實驗的結(jié)果也不會有很大影響。而本實驗所提取出來的DNA濃度較高，所以篩選最佳濃度時實驗結(jié)果不太明顯，但由于CTAB法提取的DNA相較于試劑盒法容易降解，再加上實驗做的時間較長，反復解凍DNA，使得DNA降解，造成跑膠時會出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象。

同時退火溫度也影響實驗結(jié)果，本實驗參照周利宏[15]在研究百合遺傳多樣性時的方法，并以30號引物為例，同樣設置3個溫度梯度以確定引物的最佳退火溫度，實驗結(jié)果顯示當退火溫度過低即為51℃時，膠片上就會顯示出多條非特異性條帶，從而使實驗的效果不佳；若退火時溫度太高即為55℃時，則引物和DNA不能夠特異性地結(jié)合在一起，擴增效果也不好，在53℃也就是30號引物的最佳退火溫度時才能得到清晰的條帶。最后用篩選出的最佳體系和最佳反應程序篩選已有的100條引物，最終篩選出多態(tài)性較好的10號、15號、30號、46號、96號和100號引物，為日后進行鐵線蓮種質(zhì)資源分析奠定基礎。