韋 偉 軒 妍 許文婷 曹 祥

新生兒缺氧缺血性腦病(hypoxic ischemic encephalopathy,HIE)臨床常表現(xiàn)為意識障礙、昏迷等，甚至可發(fā)生中樞性呼吸衰竭、腦癱，是導(dǎo)致新生兒死亡的重要疾病之一。目前臨床上僅根據(jù)患兒神經(jīng)功能及腦電圖很難評估病情發(fā)展及預(yù)后情況，影響治療方案的制定。因此仍需繼續(xù)探索診療HIE的新靶點(diǎn)，提高其治療與預(yù)后水平。趨化因子可介導(dǎo)免疫細(xì)胞發(fā)生定向趨化，趨化因子5(chemokine 5,CCL5)屬于趨化因子家族，受體存在于大腦中，其表達(dá)直接參與機(jī)體多種疾病的發(fā)展，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、分化的功能，并可參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理、生理過程。粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)是一種具有刺激骨髓干細(xì)胞增殖和抑制粒細(xì)胞凋亡作用的造血細(xì)胞因子，其可抑制粒細(xì)胞凋亡、增殖和分化。神經(jīng)細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是缺血缺氧性腦損傷的重要病理環(huán)節(jié)之一，GM-CSF在神經(jīng)系統(tǒng)中的作用有待深入研究。關(guān)于CCL5、GM-CSF在HIE患兒血清中的表達(dá)及與預(yù)后的相關(guān)性鮮有報(bào)道，因此本研究致力于闡述CCL5、GM-CSF在HIE患兒機(jī)體內(nèi)的表達(dá)及其預(yù)后相關(guān)性，以探討其在HIE中的臨床意義。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選擇2015年1月至2019年5月在海南省婦女兒童醫(yī)學(xué)中心出生的82例HIE患兒作為患病組，根據(jù)患兒病情嚴(yán)重程度分為輕度組(31例)、中度組(26例)與重度組(25例)，另取同期60例健康新生兒作為健康組。所有接受本次研究的受試者及其家屬均知情同意，并全部簽署知情同意書，本研究符合《赫爾辛基宣言》，獲得本院倫理委員會審核、批準(zhǔn)后實(shí)施。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 患病組納入標(biāo)準(zhǔn)：①HIE患兒父母自愿同意參加本次研究且同意預(yù)后隨訪；②新生兒均符合HIE診斷標(biāo)準(zhǔn)；③母親孕期在我院的檔案健全，無其他醫(yī)院治療史；④均為足月生產(chǎn)；⑤新生兒未輸過血或其他輸注血液制品。排除標(biāo)準(zhǔn)：①新生兒體質(zhì)量<2.5 kg；②新生兒有先天性心、肝、腎等重要臟器功能性障礙；③新生兒患有其他慢性神經(jīng)系統(tǒng)感染或畸形發(fā)育等其他疾病；④母親孕期資料不全，有嚴(yán)重不良嗜好等其他情況。

1.3 試劑與儀器 酶標(biāo)儀(型號：UV-0442，北京奧芬蘭生物科技有限公司)，人趨化因子(CCL5/RANTES)酶聯(lián)免疫吸附劑測定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(貨號：HGTM-1002A，上海江萊生物科技有限公司)，人GM-CSF ELISA試劑盒(貨號：69-98253，武漢默沙克生物科技有限公司)，離心機(jī)(型號：DFB-1800，德國Eppendorf公司)。

1.4 研究方法

1.4.1 樣品采集 所有新生兒均在出生后72 h內(nèi)空腹常規(guī)采取肘部靜脈血5 mL，靜置20～30 min，5 000 g/min，4℃離心20 min，取上層血清，分裝到于無菌Eppendof管中，-20℃保存，待檢。

1.4.2 酶聯(lián)免疫吸附法檢測CCL5、GM-CSF的表達(dá) 將凍存的血清取出靜置30 min左右，采用CCL5/RANTES試劑盒檢測患病組與健康組血清中CCL5的含量，檢測限為6.799～600 ng/L。采用人GM-CSF試劑盒檢測GM-CSF的含量，檢測限為32～500 pg/mL。嚴(yán)格按照試劑盒說明書配制相關(guān)濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品、樣品稀釋液、底物A、反應(yīng)液、顯色液以及終止液，并在規(guī)定時(shí)間內(nèi)依次按順序添加，用酶標(biāo)儀在波長450 nm處測定血清樣本的吸光度值，根據(jù)標(biāo)曲計(jì)算血清CCL5與GM-CSF的濃度。

1.4.3 評價(jià)方法 采用新生兒神經(jīng)行為測定(neonatal behavioral neurological assessment，NBNA)評分法評估新生兒出生后的第7天神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育情況。

1.4.4 隨訪 自HIE患兒出院后第1天為隨訪起點(diǎn)，隨訪期為12個(gè)月，進(jìn)行格塞爾發(fā)育量表(Gesell developmental test scales，GDS)，GDS包括5個(gè)能區(qū)：適應(yīng)性、大運(yùn)動、精細(xì)動作、語言、社交，將HIE患兒5個(gè)能區(qū)的表現(xiàn)與健康者進(jìn)行比較，得到每個(gè)能區(qū)的發(fā)育年齡，并計(jì)算發(fā)育商，發(fā)育商=(發(fā)育年齡/實(shí)際年齡)×100，即GDS。GDS總均值≥86分正常，76～85為可疑，≤75分為異常。以期滿作為隨訪終點(diǎn)，所有患兒均得到有效隨訪。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料均呈正態(tài)分布且方差齊，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用

SNK

-

q

檢驗(yàn)，兩組間均數(shù)比較采用

t

檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)表示，組間比較采用

χ

檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Pearson法。以

P

<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組研究對象一般資料比較 兩組研究對象年齡、性別、胎齡等一般資料進(jìn)行比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

>0.05)。見表1。

表1 兩組研究對象一般資料比較

2.2 兩組研究對象血清CL5、GM-CSF的表達(dá)水平及NBNA評分比較 兩組研究對象血清CCL5、GM-CSF表達(dá)水平及NBNA評分進(jìn)行比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05)。見表2。

表2 兩組研究對象血淸CCL5、GM-CSF表達(dá)水平及NBNA評分比較

2.3 不同嚴(yán)重程度HIE患兒血清CCL5、GM-CSF的表達(dá)水平及NBNA評分比較 不同嚴(yán)重程度組HIE患兒血清CCL5、GM-CSF表達(dá)水平及NBNA評分進(jìn)行比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05)，重度組HIE患兒血清GM-CSF表達(dá)水平、NBNA評分均低于中度組與輕度組，血清CCL5表達(dá)水平高于中度組、輕度組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05)。見表3。

表3 不同嚴(yán)重程度HIE患兒血清CCL5、GM-CSF水平及NBNA評分比較

2.4 HIE患兒血清CCL5、GM-CSF表達(dá)水平與NBNA評分的相關(guān)性分析 HIE患兒血清CCL5與NBNA評分呈負(fù)相關(guān)(

r

=-0.318，

P

=0.002)，血清GM-CSF水平與NBNA評分呈正相關(guān)(

r

=0.338，

P

<0.001)；血清CCL5水平與GM-CSF水平呈負(fù)相關(guān)(

r

=-0.359，

P

<0.001)。見圖1～3。

圖1 CCL5表達(dá)水平與NBNA評分的相關(guān)性

圖2 GM-CSF表達(dá)水平與NBNA評分的相關(guān)性

圖3 CCL5表達(dá)水平與GM-CSF水平的相關(guān)性

2.5 HIE患兒預(yù)后狀況分析 根據(jù)HIE患兒CCL5、GM-CSF表達(dá)水平的平均值，將患兒分為高表達(dá)與低表達(dá)。39例CCL5高表達(dá)患兒的GDS評分為(80.67±4.28)分，43例CCL5低表達(dá)患兒的GDS評分為(86.14±3.70)分，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

t

=6.206,

P

<0.001)。42例GM-CSF高表達(dá)患兒的GDS評分為(85.84±4.56)分，40例GM-CSF低表達(dá)患兒的GDS評分為(81.02±5.33)分，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

t

=4.407,

P

<0.001)。

3 討論

HIE是常見的新生兒危重癥，一般在出生后72 h病情達(dá)到高峰，然后逐漸改善，但嚴(yán)重者病情會進(jìn)一步惡化，嚴(yán)重影響新生兒的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育，且容易引發(fā)多種神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥。Chen等研究發(fā)現(xiàn)，HIE新生兒神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中多種細(xì)胞因子、趨化因子和黏附因子發(fā)生變化，推測HIE發(fā)生發(fā)展與多種因子有關(guān)。

CCL5作為CC亞家族趨化因子，以游離態(tài)形式存在于體內(nèi)，相對分子質(zhì)量較低，在神經(jīng)系統(tǒng)中活化的T細(xì)胞、神經(jīng)節(jié)、神經(jīng)元、脂多糖等均可以刺激細(xì)胞分泌CCL5。本研究結(jié)果顯示，HIE患兒血清CCL5表達(dá)水平高于健康新生兒，提示血清CCL5表達(dá)升高可能參與HIE發(fā)病。Barbeau等研究發(fā)現(xiàn)，HIE患兒體內(nèi)存在廣泛的炎癥反應(yīng)，其中CCL5可誘導(dǎo)嗜堿性粒細(xì)胞釋放組胺，并激活嗜酸性粒細(xì)胞，但中、重度HIE患兒CCL5表達(dá)水平較輕度HIE穩(wěn)定，提示通過檢測早期CCL5表達(dá)水平變化可更好區(qū)分HIE患兒的病情嚴(yán)重程度。本研究通過檢測不同嚴(yán)重程度HIE患兒血清CCL5發(fā)現(xiàn)，重度組患兒血清CCL5表達(dá)水平最高，其次為中度組，輕度組患兒血清CCL5表達(dá)水平最低，與Barbeau等研究類似，提示血清CCL5表達(dá)水平變化與HIE嚴(yán)重程度有一定關(guān)系。動物模型研究發(fā)現(xiàn)，小鼠腦缺氧缺血后CCL5水平顯著增加，經(jīng)治療后水平下降，表明CCL5可反映腦損傷的程度。本研究結(jié)果顯示，HIE患兒NBNA評分較健康新生兒低，且與血清CCL5表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，進(jìn)一步提示血清CCL5可能作為評估HIE患兒腦損傷的指標(biāo)之一。但對于其通過何種作用機(jī)制在疾病中發(fā)揮作用仍需后期深入分析。

GM-CSF是參與調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞譜系群體數(shù)量和功能的介質(zhì)。相關(guān)研究證明，GM-CSF通過多種信號通路對中樞神經(jīng)系統(tǒng)有著重要的保護(hù)功能，可促進(jìn)粒巨噬細(xì)胞增殖、分化及功能成熟，提高宿主的防御能力。本研究結(jié)果顯示，HIE患兒血清GM-CSF表達(dá)水平較健康新生兒低，且病情越嚴(yán)重，其表達(dá)水平越低，提示檢測血清GM-CSF，可能有利于評估HIE發(fā)病及其病情嚴(yán)重程度情況。Spath等研究了在體內(nèi)成熟的外周輔助性細(xì)胞中GM-CSF表達(dá)失調(diào)對中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓樣細(xì)胞的影響，發(fā)現(xiàn)抗原非依賴性GM-CSF的釋放可導(dǎo)致炎性髓細(xì)胞侵入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，從而引發(fā)嚴(yán)重的神經(jīng)功能缺損。本研究結(jié)果顯示，血清GM-CSF表達(dá)水平與NBNA評分呈正相關(guān)，與血清CCL5表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，提示血清GM-CSF表達(dá)水平降低及CCL5表達(dá)水平升高可能共同影響HIE患兒的神經(jīng)發(fā)育，與Barbeau等研究基本一致。此外，本研究通過分析CCL5、GM-CSF高低表達(dá)與GDS評分的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)CCL5高表達(dá)患兒GDS評分低于低表達(dá)患兒，GM-CSF高表達(dá)患兒GDS評分高于低表達(dá)患兒，提示CCL5、GM-CSF表達(dá)水平與HIE患兒預(yù)后存在一定關(guān)系，有可能成為HIE患兒預(yù)后預(yù)測的潛在指標(biāo)。

綜上所述，HIE患兒血清CCL5表達(dá)上調(diào)，GM-CSF表達(dá)下調(diào)，二者呈負(fù)相關(guān)，均影響HIE患兒的預(yù)后，臨床可監(jiān)測血清CCL5、GM-CSF表達(dá)水平，以便對患兒進(jìn)行早期干預(yù)治療或改善預(yù)后狀況。本研究樣本量較小，初步分析了HIE患兒CCL5、GM-CSF表達(dá)水平，結(jié)果可能存在一定的局限性，下一步將繼續(xù)驗(yàn)證研究CCL5、GM-CSF表達(dá)水平對HIE的具體作用機(jī)制。