梁輝

【摘要】 目的：探究巨噬細胞移動抑制因子（MIF）、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）標記蛋白鈣黏附蛋白E（E-cadherin）和波形纖維蛋白（Vimentin）在肝癌組織中的表達及與臨床病理特征和預后的相關性。方法：選取2016年1月-2018年1月于本院就診的45例肝癌患者，收集患者肝癌組織和癌旁組織，采用免疫組織化學法檢測組織標本中MIF、E-cadherin和Vimentin的表達，對比腫瘤組織和癌旁組織中各分子表達差異，并分析其與臨床病理特征和預后的關系。結(jié)果：肝癌組織中MIF的陽性率為71.11%高于癌旁正常組織的33.33%，E-cadherin陽性率為24.44%低于癌旁正常組織的62.22%，Vimentin陽性率為64.44%高于癌旁正常組織的31.11%，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。腫瘤分期Ⅲ～Ⅳ期、腫瘤直徑≥5 cm、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移的肝癌組織中MIF和Vimentin陽性率均較高，E-cadherin陽性率均較低，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。不同性別、年齡、AFP水平和Edmondson分級肝癌患者的MIF、E-cadherin和Vimentin蛋白水平比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。MIF陽性患者中位生存期為20.01個月，95%CI為（17.11，23.82）個月，MIF陰性患者中位生存期為25.50個月，95%CI為（17.87，25.50）個月，MIF表達為陰性的肝癌患者預后更好（P=0.028）。E-cadherin陽性患者中位生存期為22.73個月，95%CI為（19.62，22.73）個月，E-cadherin陰性患者中位生存期為16.66個月，95%CI為（13.89，25.50）個月，E-cadherin表達為陽性的肝癌患者預后更好（P=0.040）。Vimentin陽性患者中位生存期為17.11個月，95%CI為（15.55，17.87）個月，Vimentin陰性患者中位生存期為23.88個月，95%CI為（19.62，23.88）個月，Vimentin表達為陰性的肝癌患者預后更好（P=0.032）。結(jié)論：MIF蛋白、EMT標記蛋白與肝癌的病情進展有關，可作為預測肝癌預后的重要生物標志物。

【關鍵詞】 巨噬細胞移動抑制因子 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化 鈣黏附蛋白E 波形纖維蛋白 肝癌

Expressions of MIF Protein and EMT Marker Proteins in Liver Cancer Tissues and Their Correlation with Clinicopathological Characteristics and Prognosis/LIANG Hui. //Medical Innovation of China， 2021， 18（29）： 00-006

[Abstract] Objective： To explore the expressions of macrophage migration inhibitory factor （MIF） and epithelial-mesenchymal transition （EMT） marker proteins E-cadherin and Vimentin in liver cancer tissues and their correlation with clinicopathological characteristics and prognosis. Method： A total of 45 patients with liver cancer admitted to our hospital from January 2016 to January 2018 were selected， and the liver cancer tissues and paracancer tissues of the patients were collected. Immunohistochemistry was used to detect the expressions of MIF， E-cadherin and Vimentin in tissue specimens， and the differences of molecular expressions in tumor tissues and paracancer tissues were compared， and their relationship with clinicopathological features and prognosis were analyzed. Result： The positive rate of MIF in liver cancer tissues was 71.11%， which was higher than 33.33% in adjacent normal tissues， the positive rate of E-cadherin in liver cancer tissues was 24.44%， which was lower than 62.22% in normal adjacent tissues， the positive rate of Vimentin in liver cancer tissues was 64.44%， which was higher than 31.11% in normal adjacent tissues （P<0.05）. The positive rates of MIF and Vimentin were higher and the positive rate of E-cadherin were lower in liver cancer tissues with stage Ⅲ-Ⅳ， tumor diameter ≥5 cm， lymph node metastasis and distant metastasis， the differences were statistically significant （P<0.05）. There were no significant differences in MIF， E-cadherin and Vimentin protein levels in patients with liver cancer with different genders， ages， AFP levels and Edmondson grade （P>0.05）. The median survival time of MIF positive patients was 20.01 months， 95%CI （17.11， 23.82） months， while MIF negative patients had a median survival of 25.50 months， 95%CI （17.87， 25.50） months. Patients with negative MIF expression had better prognosis （P=0.028）. The median survival time of E-cadherin positive patients was 22.73 months， 95%CI （19.62， 22.73） months， while E-Cadherin negative patients was 16.66 months， 95%CI （13.89， 25.50） months. Patients with positive E-cadherin expression had better prognosis （P=0.040）. The median survival time of Vimentin positive patients was 17.11 months， 95%CI （15.55， 17.87） months， while Vimentin negative patients was 23.88 months 95%CI （19.62， 23.88） months. Patients with negative Vimentin expression had better prognosis （P=0.032）. Conclusion： MIF protein and EMT marker proteins are related to the progression of liver cancer and can be used as important biomarkers to predict the prognosis of liver cancer.

[Key words] Macrophage migration inhibitory factor Epithelial-mesenchymal transition E-cadherin Vimentin Liver cancer

First-authors address： The Second Affiliated Hospital of Nanchang University， Nanchang 330006， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.29.001

肝癌是我國常見的消化道惡性腫瘤疾病之一，屬于全球第六大惡性腫瘤[1]。依據(jù)起源方式的不同，可將肝癌分為原發(fā)性和繼發(fā)性兩大類，原發(fā)性肝癌起源于肝臟上皮細胞或間葉組織，而繼發(fā)性肝癌則是由胃癌、結(jié)直腸癌等惡性腫瘤肝轉(zhuǎn)移引起的[2]。肝癌的腫瘤細胞生長發(fā)育極為迅速，具有較高的侵襲性和轉(zhuǎn)移能力，惡性程度高，發(fā)病率和死亡率逐年上升[3]。早期肝癌無特異性臨床癥狀，60%～80%的患者確診時處于晚期，錯過了最佳手術治療時間[4]。因此，尋找診斷肝癌的生物標志物以制定新的治療策略對肝癌患者而言意義重大。有研究發(fā)現(xiàn)，多種分子參與了肝癌的發(fā)生發(fā)展過程，其中上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）在肝癌細胞表型轉(zhuǎn)化中發(fā)揮重要作用，調(diào)控肝癌細胞的轉(zhuǎn)移[5]。巨噬細胞移動抑制因子（macrophage migration inhibitory factor，MIF）是調(diào)控機體內(nèi)巨噬細胞活動的細胞因子，被先前的研究證實在多種慢性炎癥性疾病、自身免疫性疾病和惡性腫瘤疾病中異常表達，影響疾病進展[6-7]。然而，MIF蛋白和EMT標記基因鈣黏附蛋白E（E-cadherin）、波形纖維蛋白（Vimentin）在肝癌中的相關研究較少，目前尚不清楚其與臨床病理特征和預后的關系?；诖?，本次實驗探究MIF、E-cadherin和Vimentin在肝癌組織中的表達水平，分析其與臨床病理特征及預后的相關性，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年1月-2018年1月來本院就診的45例肝癌患者。納入標準：（1）均為肝膽外科收治的需進行手術切除患者，且術后經(jīng)病理學檢測確診為肝細胞癌;（2）年齡≥18歲;（3）預期生存期≥3個月;（4）依從性較好，能夠配合完成術后隨訪。排除標準：（1）合并其他惡性腫瘤疾病;（2）術前1個月內(nèi)接受過放化療或抗腫瘤免疫治療;（3）哺乳期或妊娠期婦女;（4）臨床資料不全。男32例，女13例，年齡18～69歲，平均（46.38±11.37）歲;Edmondson分級：Ⅰ、Ⅱ級16例，Ⅲ、Ⅳ級29例;TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期18例，Ⅲ～Ⅳ期27例。收集所有患者腫瘤組織和癌旁約3 cm處的正常組織，脫水后制成石蠟標本待用。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準且所有入組患者均對本次實驗知情，同意參與本次研究并簽署同意書。

1.2 方法 取患者腫瘤組織和癌旁正常組織石蠟切片，采用免疫組織化學法檢測組織中MIF、E-cadherin和Vimentin的表達。首先將組織切片脫蠟至水，0.01 mmol/L枸櫞酸緩沖液微波爐加熱15 min以修復抗原，室溫下冷卻后以3%H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶，山羊血清室溫下封閉30 min后，加入MIF、E-cadherin和Vimentin一抗（均購自上海艾博抗公司），4 ℃下孵育過夜，PBS洗去浮色后與辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗室溫下再次孵育30 min，DBA染色液染色后沖洗，蘇木素復染，梯度乙醇脫水后，二甲苯透明，中性樹膠封片，生物顯微鏡（生產(chǎn)廠家：上海普赫光電科技有限公司，型號：CX43）下拍照觀察顏色情況。

1.3 觀察指標與判定標準 （1）免疫組化染色結(jié)果觀察：參考《免疫組化結(jié)果的圖像分析與人工計數(shù)方法的對比研究》對患者免疫組化陽性和陰性進行界定，具體根據(jù)免疫組化染色強度和陽性細胞占比來進行。染色結(jié)果中胞質(zhì)、胞核著色為棕黃色記3分，黃色記2分，淺黃色記1分，胞質(zhì)、胞核著色程度較差，無明顯染色記0分。染色結(jié)果中陽性細胞占比>75%記3分，≥50%但≤75%記2分，≥25%但<50%記1分，<25%記0分。總評分=染色強度得分×陽性細胞占比得分，當總評分<3分視為陰性，≥3分視為陽性[8]。（2）收集患者臨床病理信息，分析MIF、E-cadherin和Vimentin表達水平與臨床病理特征之間的關系。（3）對患者進行3年的隨訪，記錄其生存情況，并分析MIF、E-cadherin和Vimentin表達水平與患者預后之間的關系。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 22.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗;計數(shù)資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗;采用Kaplan-Meier分析患者預后情況。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 MIF和EMT標記物在肝癌組織及癌旁正常組織中的表達 肝癌組織中MIF的陽性率為71.11%高于癌旁正常組織的33.33%，E-cadherin陽性率為24.44%低于癌旁正常組織的62.22%，Vimentin陽性率為64.44%高于癌旁正常組織的31.11%，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表1。

2.2 MIF和EMT標記物與臨床病理特征的關系 腫瘤分期Ⅲ～Ⅳ期、腫瘤直徑≥5 cm、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移的肝癌組織中MIF和Vimentin陽性率均較高，E-cadherin陽性率均較低，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。不同性別、年齡、AFP水平和Edmondson分級肝癌患者的MIF、E-cadherin和Vimentin陽性率比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表2。

2.3 MIF表達與預后的關系 MIF陽性患者中位生存期為20.01個月，95%CI為（17.11，23.82）個月，MIF陰性患者中位生存期為25.50個月，95%CI為（17.87，25.50）個月，MIF表達為陰性的肝癌患者預后更好（P=0.028）。見圖1。

2.4 E-cadherin表達與預后的關系 E-cadherin陽性患者中位生存期為22.73個月，95%CI（19.62，22.73）個月，E-cadherin陰性患者中位生存期為16.66個月，95%CI（13.89，25.50）個月，E-cadherin表達為陽性的肝癌患者預后更好（P=0.040）。見圖2。

2.5 Vimentin表達與預后的關系 Vimentin陽性患者中位生存期為17.11個月，95%CI為（15.55，17.87）個月，Vimentin陰性患者中位生存期為23.88個月，95%CI為（19.62，23.88）個月，Vimentin表達為陰性的肝癌患者預后更好（P=0.032）。見圖3。

3 討論

肝癌是現(xiàn)階段發(fā)病率、致死率和惡性程度極高的惡性腫瘤之一，臨床表現(xiàn)為包膜侵犯、血管浸潤和遠處器官轉(zhuǎn)移，手術切除、經(jīng)皮穿刺肝動脈栓塞化療等是治療肝癌的常用方案，但因肝癌具有高侵襲性和轉(zhuǎn)移性特點，治療效果不理想[9-11]。因此，探究肝癌轉(zhuǎn)移復發(fā)的相關機制，尋找新的分子標志物，揭示其與臨床病理特征及預后之間的關系，對于延長肝癌患者的生命周期而言意義重大。

既往研究表明，癌癥的侵襲和轉(zhuǎn)移與腫瘤細胞的EMT有關，EMT標記蛋白E-cadherin、N-cadherin和Vimentin等分子的改變，導致上皮細胞失去黏附能力，由上皮細胞轉(zhuǎn)化為間質(zhì)細胞，并獲得細胞遷移和侵襲的能力，誘導腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移[12]。T細胞分泌的多效趨化因子MIF是EMT的關鍵調(diào)控因子之一，并與膿毒癥、骨關節(jié)炎、急性胰腺炎等炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展有關[13]。Cho等[14]研究發(fā)現(xiàn)，MIF同樣可參與介導乳腺癌、肝癌等惡性腫瘤的疾病進展，影響患者預后。本次研究發(fā)現(xiàn)肝癌組織中MIF的陽性率為71.11%高于癌旁正常組織的33.33%，E-cadherin陽性率為24.44%低于癌旁正常組織的62.22%，Vimentin陽性率為64.44%高于癌旁正常組織的31.11%，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。腫瘤分期Ⅲ～Ⅳ期、腫瘤直徑≥5 cm、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移的肝癌組織中MIF和Vimentin陽性率均較高，E-cadherin陽性率均較低，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。不同性別、年齡、AFP水平和Edmondson分級肝癌患者的MIF、E-cadherin和Vimentin表達情況比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。這表明，MIF和Vimentin表達的增加和E-cadherin表達的減少與肝癌患者腫瘤血管侵襲、浸潤、新生血管生成、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠處器官轉(zhuǎn)移高度相關，推測原因，可能與MIF蛋白對EMT的調(diào)控作用有關。文獻[15-17]研究指出，MIF可通過調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長因子的表達，促進腫瘤新生血管生成，上調(diào)N-cadherin和Vimentin的表達，下調(diào)E-cadherin的表達，激活細胞內(nèi)生長因子受體信號通路的Wnt通路，影響腫瘤細胞黏附、分化、細胞骨架重塑以及外基質(zhì)降解，進而誘導細胞侵襲和轉(zhuǎn)移。因此，MIF和Vimentin陽性率越高，E-cadherin陽性率越低，肝癌惡性程度越高，遷移侵襲能力越強。

此外，本次研究結(jié)果還顯示，MIF、E-cadherin和Vimentin的表達與患者預后有關，MIF和Vimentin陽性率越高，E-cadherin陽性率越低，肝癌患者的總生存期越短，預后越差。也這與QIN等[18]研究結(jié)果相符。腫瘤惡性程度越高，侵襲性越強，出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠處器官轉(zhuǎn)移的概率越大，手術治療無法完全切除病灶，且極易復發(fā)，嚴重影響患者的生存質(zhì)量和生命周期[17，19]。MIF和Vimentin高表達和E-cadherin低表達與肝癌侵襲和轉(zhuǎn)移能力和腫瘤進展密切相關，不利于患者預后。

綜上所述，MIF蛋白、EMT標記蛋白Vimentin在肝癌組織中高表達，E-cadherin在肝癌組織中低表達，MIF、Vimentin表達上調(diào)和E-cadherin表達下調(diào)與患者腫瘤TNM分期、腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移有關，并影響患者的疾病進展，提示MIF蛋白和EMT標記蛋白可作為預測肝癌預后的重要生物標志物。

參考文獻

[1] LI L，WANG H.Heterogeneity of liver cancer and personalized therapy[J].Cancer Lett，2016，379（2）：191-197.

[2] Yamashita T，Kaneko S.Liver Cancer[J].Rinsho Byori，2016，64（7）：787-796.

[3] Kim B H，Park J W.Epidemiology of liver cancer in South Korea[J].Clin Mol Hepatol，2018，24（1）：1-9.

[4] Shiani A，Narayanan S，Pena L，et al.The Role of Diagnosis and Treatment of Underlying Liver Disease for the Prognosis of Primary Liver Cancer[J].Cancer Control，2017，24（3）：1073274817729240.

[5] YANG B，F(xiàn)ENG X，LIU H，et al.High-metastatic cancer cells derived exosomal miR92a-3p promotes epithelial-mesenchymal transition and metastasis of low-metastatic cancer cells by regulating PTEN/Akt pathway in hepatocellular carcinoma[J].Oncogene，2020，39（42）：6529-6543.

[6] WANG Q，ZHAO D，XIAN M，et al.MIF as a biomarker and therapeutic target for overcoming resistance to proteasome inhibitors in human myeloma[J].Blood，2020，136（22）：2557-2573.

[7] Krammer C，Kontos C，Dewor M，et al.A MIF-Derived Cyclopeptide that Inhibits MIF Binding and Atherogenic Signaling via the Chemokine Receptor CXCR2[J].Chembiochem，2021，22（6）：1012-1019.

[8]于萍，步宏，王華，等.免疫組化結(jié)果的圖像分析與人工計數(shù)方法的對比研究[J].生物醫(yī)學工程學雜志，2003，20（2）：288-290.

[9] Craig A J，F(xiàn)elden J V，Villanueva A.Molecular profiling of liver cancer heterogeneity[J].Discov Med，2017，24（131）：117-125.

[10] Villanueva A.Hepatocellular Carcinoma[J].N Engl J Med，2019，380（15）：1450-1462.

[11] Orcutt S，Anaya D A.Liver Resection and Surgical Strategies for Management of Primary Liver Cancer[J].Cancer Control，2018，25（1）：1073274817744621.

[12] Bakir B，Chiarella A M，Pitarresi J R，et al.EMT，MET，Plasticity，and Tumor Metastasis[J].Trends Cell Biol，2020，30（10）：764-776.

[13] Staubli S M，Oertli D，Nebiker C A.Laboratory markers predicting severity of acute pancreatitis[J].Crit Rev Clin Lab Sci，2015，52（6）：273-283.

[14] Cho E，Kim N H，Yun J S，et al.Breast Cancer Subtypes Underlying EMT-Mediated Catabolic Metabolism[J].Cells，2020，9（9）：2064.

[15] Eguchi R，Wakabayashi I.HDGF enhances VEGF-dependent angiogenesis and FGF?2 is a VEGF?independent angiogenic factor in non?small cell lung cancer[J].Oncol Rep，2020，44（1）：14-28.

[16] Parol M，Gzil A，Maciejewska J，et al.Clinicopathological significance of the EMT-related proteins and their interrelationships in prostate cancer.An immunohistochemical study[J/OL].PLoS One，2021，16（6）：e0253112.

[17] ZHAO J，LI H，ZHAO S，et al.Epigenetic silencing of miR-144/451a cluster contributes to HCC progression via paracrine HGF/MIF-mediated TAM remodeling[J].Mol Cancer，2021，20（1）：46.

[18] QIN L，QIN J，LV X，et al.MIF promoter polymorphism increases peripheral blood expression levels，contributing to increased susceptibility and poor prognosis in hepatocellular carcinoma[J].Oncol Lett，2021，22（1）：549.

[19] ZHAO Y R，WANG J L，XU C，et al.HEG1 indicates poor prognosis and promotes hepatocellular carcinoma invasion，metastasis，and EMT by activating Wnt/β-catenin signaling[J].Clin Sci （Lond），2019，133（14）：1645-1662.

（收稿日期：2021-09-03） （本文編輯：張明瀾）