許飛，高正軍

克羅恩病是一種腸道炎癥疾病，克羅恩病的發(fā)病誘因尚未完全掌握，近年來有關(guān)學者認為，其發(fā)病可能是由于多種因素相互作用所致：環(huán)境因素作用于遺傳易感者，在腸道菌群參與下啟動腸道異常免疫應(yīng)答，最終引起免疫損傷和炎癥過程；或者因為患者免疫調(diào)節(jié)紊亂和特異抗原的持續(xù)刺激，免疫炎癥反應(yīng)表現(xiàn)過度且難以自限[1-3]?？肆_恩病變主要發(fā)生在小腸與結(jié)腸，呈節(jié)段分布，界限清晰，可呈現(xiàn)4種主要病理形式，即急性炎癥、潰瘍、狹窄、瘺管形成。誘發(fā)克羅恩病變產(chǎn)生的主要因素有環(huán)境、遺傳、免疫等[4-5]。該病發(fā)病主要表現(xiàn)為腹痛、腸梗阻等，且病變位置隨著病情的嚴重程度有所轉(zhuǎn)移，反復(fù)發(fā)作[6]。近年來，國內(nèi)報道克羅恩病患者不斷增多，癥狀多樣化，使得診斷較為困難，誤診率高，迄今尚無徹底治愈方法。有研究表明，去泛素特異性蛋白酶14(ubiquitin-specific protease 14，USP14)在多種炎癥性及癌癥疾病的預(yù)后效果較好[7]。泛素化是真核細胞重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式，最早是伴隨著泛素-蛋白酶體途徑被發(fā)現(xiàn)的。對維持細胞蛋白質(zhì)穩(wěn)定發(fā)揮至關(guān)重要的作用。USP14定位于細胞質(zhì)/膜中，由近500個氨基酸構(gòu)成，USP14含有一個N端UBL結(jié)構(gòu)域，與USP14和蛋白酶體之間的結(jié)合有關(guān)[8]。目前關(guān)于USP14與克羅恩病關(guān)系的研究較少，本文旨在探討克羅恩病組織中USP14的表達水平及意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性選擇2015年1月至2018年1月空軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科就診的克羅恩病患者106例，其中，男性62例，女性44例；年齡20～60歲，平均年齡(40.23±6.13)歲；內(nèi)鏡下疾病活動度輕度 27 例，中度 44 例，重度 35 例，克羅恩病的診斷符合《中國炎癥性腸病組織病理診斷共識意見》；本次研究得到空軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 納入標準和排除標準

納入標準：①患者年齡在18歲以上；②接受結(jié)直腸鏡檢查；③首次就診并接受治療；④患者知情并簽署同意書。⑤符合臨床上關(guān)于克羅恩疾病(局限性回腸炎、局限性腸炎、節(jié)段性腸炎和肉芽腫性腸炎等)診斷標準者。

排除標準：①治療前曾服用抗生素；②合并急性感染性疾??；③合并嚴重的心、腎功能疾病等；④合并其他免疫性疾病；⑤患有其他惡性腫瘤；⑥不配合檢查及隨訪者。

1.3 蛋白免疫印記檢測克羅恩病組織中USP14表達

取克羅恩病活動度輕度、中度、重度組織，滴加RIPA裂解液，提取總蛋白；用 BCA 蛋白定量試劑盒進行蛋白定量；電泳120 V 100 min，轉(zhuǎn)膜200，mA 90 min；PBS洗膜，脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗，4 ℃孵育過夜；PBST 漂洗，加入二抗，室溫孵育1 h；曝光顯影，用 ImageJ 軟件分析結(jié)果。

1.4 克羅恩病內(nèi)鏡下疾病活動度判定

克羅恩病簡化內(nèi)鏡評分(SES-CD)評價疾病活動度[9]。SES-CD 將腸道分為末端回腸、右半結(jié)腸、橫結(jié)腸、左半結(jié)腸和直腸 5 部分，每個部分從 4 個維度進行評價，即潰瘍大小、潰瘍面積、受累腸道面積及腸腔狹窄情況，任一維度的評分均為 0～3分，總分越高表示 CD 病情越嚴重。緩解：0～3 分、輕度：4～10 分、中度：11～19 分、重度：≥20 分。

1.5 隨訪及預(yù)后評價

通過復(fù)診及電話隨訪等方式了解克羅恩病患者治療后2年的預(yù)后情況。于克羅恩病患者出院后1個月開始隨訪，每月隨訪1次，了解克羅恩病相關(guān)并發(fā)癥發(fā)生情況、是否接受手術(shù)治療及克羅恩病相關(guān)死亡等。

1.6 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 USP14在克羅恩病不同疾病活動度中的表達

USP14在克羅恩病活動度輕度中的表達(0.87±0.15)低于其在中度(1.82±0.27)、重度(2.40±0.35)中的表達，組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；中度患者USP14水平較重度患者明顯降低，組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖1。

圖1 USP14在克羅恩病活動度中的表達

2.2 克羅恩病患者SEC-CD的評分及與USP14相關(guān)性分析

克羅恩病患者的SEC-CD評分為(23.22±4.31)分，克羅恩病患者USP14的表達水平與SEC-CD評分呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.835，P<0.001)，見圖2。

圖2 USP14水平與SEC-CD相關(guān)性分析

2.3 USP14表達與克羅恩病患者預(yù)后的關(guān)系

106例患者中有42例(39.62%)預(yù)后不良，其中4例(9.52%)并發(fā)腸瘺、3例(7.14%)并發(fā)復(fù)雜肛瘺、4例(9.52%)并發(fā)腸梗阻、3例(7.14%)并發(fā)腹腔膿腫、2例(4.76%)并發(fā)消化道大出血、25例(59.52%)行腸切除術(shù)、1例(2.38%)死亡。預(yù)后不良患者USP14水平(2.13±0.35)高于預(yù)后良好患者USP14水平(1.68±0.25)，組間比較差異有統(tǒng)計學意義(t=7.638，P<0.001)。

2.4 影響克羅恩病患者預(yù)后的相關(guān)因素

兩組性別、年齡、病變部位、有無上消化道受累比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；兩組疾病行為、肛周病變、USP14表達水平的相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 影響該病患者預(yù)后的相關(guān)因素分析 [n(%)]

2.5 克羅恩病患者預(yù)后的多因素 Logistic 回歸分析

將上述單因素中有統(tǒng)計學意義的納入多因素Logistic回歸分析中，其中疾病行為賦值(0=非狹窄非穿透型，1=狹窄型或穿透型)，肛周病變賦值(1=有，2=無)，USP14賦值(1=≤1.82，2=>1.82)，結(jié)果顯示，非狹窄非穿透型與無肛周病變是影響克羅恩病患者預(yù)后的獨立危險因素(P<0.05)，USP14≤1.82是獨立保護因素(P<0.05)，見表2。

表2 該病患者預(yù)后的多因素分析

2.6 USP14對克羅恩病患者預(yù)后的價值

USP14判斷克羅恩病患者預(yù)后的靈敏度為59.38%、特異度為90.47%，AUC面積為0.785，說明USP14對克羅恩病患者預(yù)后具有一定的預(yù)測價值，見圖3。

圖3 USP14對克羅恩病患者預(yù)后的價值

3 討論

克羅恩病的發(fā)病率具有較高的地域差異性，該病在歐美國家的白種人中發(fā)病較多。但近年來，該病發(fā)病率在我國也呈逐漸增長趨勢，且無年齡限制，男女發(fā)病率亦無明顯差異。目前對于該病無法完全治愈且誤診率較高，因此對于克羅恩病的早期診斷至關(guān)重要[10-12]。本文研究克羅恩病組織中USP14的表達水平及意義以及對患者預(yù)后的影響，具體分析如下。

腸道黏膜屏障包括物理、生物等屏障，當機體的任一屏障損傷后，腸道穩(wěn)態(tài)失衡，進而引發(fā)腸道疾病，腸道細胞的生長、死亡、繁殖三者間的平衡對于腸道穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要[13]。有研究提出USP14可能是通過調(diào)節(jié)炎性因子進而調(diào)控多種癌細胞的生物學行為[14]。USP14位于18號染色體，是靠近端粒處的功能基因，對機體生命過程具有重要作用。在真核細胞中，26S蛋白酶體是蛋白質(zhì)降解的主要位點，哺乳動物細胞26S蛋白酶體中，USP14約占10%～ 20%。雖然只有一小部分的19S顆粒含有USP14，但細胞中絕大多數(shù)USP14都與蛋白酶體結(jié)合。USP14參與體內(nèi)蛋白質(zhì)降解的調(diào)控，參與惡性腫瘤進展；USP14是哺乳動物中高度保守的去泛素化酶，因其在多種疾病中的高表達和重要作用而受到越來越多的關(guān)注[15-18]。本研究采用蛋白印跡方法檢測USP14在克羅恩病中的表達，發(fā)現(xiàn)其在輕度的克羅恩病中的表達低于中、高度，在中度克羅恩病中表達低于高度中表達。邢智遠等[19]對結(jié)腸癌細胞進行研究發(fā)現(xiàn)，USP14在結(jié)腸細胞中為高表達，抑制其水平后，可促進結(jié)腸癌細胞的凋亡。劉蓉蓓[20]運用大鼠建立腸道炎癥的模型進行實驗，結(jié)果顯示USP14表達增加后，小鼠的腸道炎癥有所增加。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果相似，由此可看出，USP14水平與克羅恩病病情嚴重程度有關(guān)，進而推測USP14可能是通過調(diào)節(jié)腸黏膜等炎癥反應(yīng)來調(diào)控細胞的活性，從而參與克羅恩病的產(chǎn)生與發(fā)展。SES-CD量表是評價克羅恩病患者病情的權(quán)威指標，能夠準確反映克羅恩病病情的嚴重程度[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，USP14在克羅恩病中的水平與SES-CD評分呈正相關(guān)關(guān)系，這一結(jié)果也進一步證實了USP14參與克羅恩病的產(chǎn)生與發(fā)展。

近年來，有關(guān)國內(nèi)外的報道均顯示克羅恩病的發(fā)病率在逐年增加，該病可侵犯消化道的任何位置，癥狀多樣化，診斷較為困難且其誤診率超高，接近80%[22-24]。因此，發(fā)現(xiàn)能早期判斷克羅恩病的發(fā)生及預(yù)后的分子標記物一直是臨床上亟待解決的難題。目前有關(guān)USP14與克羅恩病關(guān)系的文獻較少，但多位學者經(jīng)過研究已證實其參與多種腫瘤疾病的產(chǎn)生及發(fā)展[25]。本研究發(fā)現(xiàn)， 106例隨訪患者中有42例(39.62%)預(yù)后不良，且預(yù)后不良組患者USP14的水平高于預(yù)后良好組，并發(fā)現(xiàn)其疾病行為、有無肛周病變是影響其預(yù)后的關(guān)鍵因素，USP14在非狹窄非穿透型的表達高于狹窄型及穿透型，在有肛周病變中的表達高于無肛周病變，這與易禮智等[26]研究結(jié)果相似，該結(jié)果表明USP水平與克羅恩病預(yù)后密切相關(guān)，有助于克羅恩病患者預(yù)后的評估。本研究進一步構(gòu)建了USP14評價克羅恩病患者預(yù)后的 ROC 曲線，結(jié)果顯示AUC為0.785、靈敏度為59.38%、特異度為90.47%，表明USP14對克羅恩病患者的預(yù)后價值較高，但其特異度偏低。為進一步證實USP14的表達與克羅恩病患者預(yù)后的關(guān)系，本研究進行了單/多因素Logistic 回歸分析，結(jié)果表明非狹窄非穿透型與無肛周病變是影響克羅恩病患者預(yù)后的獨立危險因素(P<0.05)，USP14≤1.82是獨立保護因素，這與張連花[27]的研究結(jié)果相似。USP14對于臨床評估克羅恩病具有較好的診斷價值，可有效判斷克羅恩病患者的預(yù)后情況及病情嚴重程度，為臨床治療提供有利依據(jù)。

綜上所述，USP14在克羅恩病中為高表達，其水平增加提示克羅恩病患者的病情加重、預(yù)后風險增加，是克羅恩病臨床診斷的重要指標。