卞論，趙卉，賈慶釗，方浩霖，何春輝，葉珂，林冠峰，吳英松

1.南方醫(yī)科大學(xué)，廣東 廣州510515；2.中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院，廣東 廣州510000；3.廣州諾誠(chéng)生物制品有限公司，廣東廣州511495

狂犬病是病死率極高的急性傳染病，目前尚無有效的治療手段，疫苗免疫是預(yù)防該病發(fā)生的唯一途徑［1-2］?？袢⊙鍖W(xué)檢測(cè)用于常規(guī)狂犬病疫苗免疫后的效果評(píng)價(jià)。檢測(cè)狂犬病病毒中和抗體可評(píng)價(jià)人用狂犬病疫苗的免疫學(xué)效果、狂犬病免疫球蛋白的中和活性、進(jìn)行狂犬病病例實(shí)驗(yàn)室診斷等［3］。世界衛(wèi)生組織推薦的狂犬病病毒中和抗體檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)方法為小鼠腦內(nèi)中和法（mice neutralization test，MNT）和快速熒光灶抑制試驗(yàn)（rapid fluorescent focus inhibition test，RFFIT）［4］。兩者均存在耗時(shí)長(zhǎng)、設(shè)備成本高等缺點(diǎn)，不方便大規(guī)模普及［5］。ELISA 法可作為MNT、RFFIT 的潛在替代性檢測(cè)方法，因其敏感、簡(jiǎn)單、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)［6］，可使人體抗狂犬病病毒抗體水平的檢測(cè)更方便和快捷［7］。

本研究建立了檢測(cè)狂犬病病毒抗體的ELISA定量檢測(cè)方法，并驗(yàn)證了其臨床應(yīng)用的性能及可行性。

1 材料與方法

1.1 病毒及血清 PM 株狂犬病病毒滅活全病毒及血清樣本由廣州諾誠(chéng)生物制品有限公司提供；人抗狂犬病病毒血清國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。

1.2 主要試劑及儀器 抗狂犬病病毒單克隆抗體（S010，線性表位）由南方醫(yī)科大學(xué)抗體工程研究所保存；抗人IgG 二抗（抗人IgG-6#）購(gòu)自深圳菲鵬生物股份有限公司；鹽酸阿霉素、BSA、EDC、NHS、丙烯酰胺、SDS、TMB 為美國(guó)Sigma 公司產(chǎn)品，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；HRP 快速標(biāo)記試劑盒購(gòu)自北京博奧龍免疫技術(shù)有限公司；96 孔微孔板（規(guī)格：96 孔12 × 8）購(gòu)自廈門市云鵬科技發(fā)展有限公司；層析柱填料SephadexTMG-50 購(gòu)自美國(guó)Amersham Pharmacia公司；超濾離心管為美國(guó)Millipore 公司產(chǎn)品。

1.3 溶液配制 包被液：50 mmol ／ L Tris-HCl 緩沖液，pH 7.2；封閉液：50 mmol ／ L Tris-HCl 緩沖體系中加入0.1%BSA、4%海藻糖、0.05% NaN3，0.22 μm過濾后調(diào)pH 至7.2，4 ℃保存；洗滌液：50 mmol ／ L Tris-HCl 緩沖液，pH 7.8，0.84% NaCl，0.01% NaN3，0.06% Tween 20；分析緩沖液：PBS 緩沖液，pH 7.8，0.22 μm 過濾，4 ℃保存；標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液：50 mmol ／ L Tris-HCl 緩沖液pH 7.8，含0.9% NaCl、0.1% NaN3、0.01% Tween-20、1.5% BSA，0.22 μm 過濾；顯色液A 液：TMB（四甲基聯(lián)苯胺）200 mg，無水乙醇（或DMSO）100 mL，加超純水至1 000 mL，0.45 μm 濾膜過濾；顯色液B 液：Na2HPO4·12H2O 36.8 g，C6H8O7·H2O 9.33 g，H2O20.5 mL 加超純水至1 000 mL，0.45 μm濾膜過濾；終止液：2 mol ／ L H2SO4。

1.4 抗體包被 將S010 以一定濃度溶于包被液中，反應(yīng)孔中加入100 μL，37 ℃振蕩包被2 h；棄孔內(nèi)包被液，加入0.1% BSA 封閉液，150 μL ／ 孔，4 ℃封閉過夜；棄孔內(nèi)溶液，拍干，抽真空，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 抗人IgG 抗體的H R P 標(biāo)記 按HRP 快速標(biāo)記試劑盒說明書將抗人IgG 二抗與HRP 酶進(jìn)行偶聯(lián)標(biāo)記，產(chǎn)物經(jīng)SephadexTMG-50 純化后收集，HRP 活性測(cè)定符合要求后置4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.6 標(biāo)準(zhǔn)品配制 采用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液將國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品配制成濃度為0、0.05、0.1、0.2、0.4 及1 IU ／ mL，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 檢測(cè)方法 于包被有S010 抗體的反應(yīng)孔中加入1 ∶100 稀釋的狂犬病病毒滅活全病毒100 μL，37 ℃振蕩孵育1 h；棄溶液，洗滌液洗滌4 次，將標(biāo)準(zhǔn)品或待檢測(cè)樣品按1 ∶10 稀釋后，加入25 μL 至微孔板中，并加入用分析緩沖液按一定比例稀釋的HRP標(biāo)記的二抗75 μL，37 ℃孵育1.5 h；棄孔內(nèi)溶液，洗滌液洗滌6 次，每孔加入A 液、B 液各50 μL，37 ℃孵育15 min；每孔加入終止液50 μL，用Biotech 酶標(biāo)儀于450 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)A值。

1.8 試劑使用量的優(yōu)化 將S010 分別以2、3.5、5 μg ／ mL 濃度進(jìn)行包被，按1.7 項(xiàng)方法進(jìn)行檢測(cè)；將HRP 標(biāo)記的二抗分別按1 ∶1 000，1 ∶2 000，1 ∶40 000 稀釋，按1.7 項(xiàng)方法進(jìn)行檢測(cè)。

1.9 反應(yīng)曲線繪制 用建立的ELISA 方法檢測(cè)不同濃度（0、0.05、0.1、0.2、0.4、1.0 IU ／ mL）標(biāo)準(zhǔn)品，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，扣除0 IU ／ mL 本底的信號(hào)值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)品濃度-信號(hào)值擬合曲線，確定擬合方程及相關(guān)系數(shù)。

1.10 方法的驗(yàn)證

1.10.1 空白限確定 使用建立的ELISA 方法對(duì)空白樣本重復(fù)檢測(cè)20 次后獲得樣本信號(hào)值，計(jì)算mean +2 SD值后，通過代入擬合方程得出空白限。

1.10.2 準(zhǔn)確度 向2 個(gè)已知濃度血清樣本（A：1.23 IU ／ mL；B：3.12 IU ／ mL）中加入一定量國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品，分別計(jì)算獲得樣品的理論濃度，使用建立的ELISA 方法進(jìn)行檢測(cè)，重復(fù)3 次并計(jì)算均值，通過理論濃度與實(shí)際測(cè)定濃度均值比值計(jì)算回收率。

1.10.3 精密度 用建立的ELISA 方法對(duì)自制質(zhì)控品（QC-1：5 IU ／ mL；QC-2：2.5 IU ／ mL）進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算分析內(nèi)變異系數(shù)（n= 10）和分析間變異系數(shù)（n= 5）。

1.11 與同類試劑的比較 用建立的ELISA 方法對(duì)10 份未接種狂犬病疫苗的陰性血清樣本及62 份RFFIT 法測(cè)定值大于0.5 IU ／ mL 的陽性血清樣本進(jìn)行檢測(cè)，以0.5 IU ／ mL 為陰陽性判斷線，比較兩者結(jié)果的一致性；并同時(shí)用建立的ELISA 方法及RFFIT 法對(duì)62 份陽性血清進(jìn)行檢測(cè)，以ELISA 方法檢測(cè)值為橫坐標(biāo)，RFFIT 法檢測(cè)值為縱坐標(biāo)，繪制曲線，比較兩者檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性。

2 結(jié) 果

2.1 試劑最佳使用量 確定S010 最佳包被濃度為3.5 μg ／ mL，酶標(biāo)二抗最佳稀釋度為1 ∶10 000，見表1。

2.2 反應(yīng)曲線 采用線性擬合方式測(cè)得試劑劑量-反應(yīng)曲線線性相關(guān)系數(shù)為r2= 0.992，見圖1。

2.3 空白限 結(jié)果顯示，mean + 2 SD值代入擬合方程計(jì)算得空白限為0.03 IU ／ mL。

2.4 準(zhǔn)確度 結(jié)果顯示，A、B 血清樣本檢測(cè)回收率分別為89.6%和92.6%，符合診斷試劑檢定要求，見表2。

2.5 精密度 結(jié)果顯示，QC-1 和QC-2 兩個(gè)質(zhì)控品分析內(nèi)變異系數(shù)和分析間變異系數(shù)分別為13.9%、14.3%和11.5%、13.2%，見表3，表明精密度較好。

2.6 陰陽符合率 結(jié)果顯示，總陰陽符合率為100%。

2.7 比對(duì)試驗(yàn) 結(jié)果顯示，自建ELISA 方法檢測(cè)值與RFFIT 法檢測(cè)值相關(guān)性較好，相關(guān)系數(shù)R2為0.712，見圖2。

表1 試劑使用量比對(duì)優(yōu)化結(jié)果（A450）Tab.1 Optimization of dosage of reagents（A450）

圖1 自制人抗狂犬病病毒抗體分析試劑反應(yīng)曲線Fig.1 Reaction curve of prepared analytical reagent for rabies virus antibody

表2 ELISA 方法回收率驗(yàn)證結(jié)果（n = 3）Tab.2 Verification for recovery rate of samples determined by developed ELISA method（n = 3）

表3 ELISA 方法精密度驗(yàn)證結(jié)果Tab.3 Verification for precision of developed ELISA method

圖2 ELISA 方法與RFFIT 法檢測(cè)值的比對(duì)試驗(yàn)（n=62）F ig.2 Comparison of determination results by developed ELISA method and RFFIT（n = 62）

3 討 論

人體接種狂犬病疫苗后，機(jī)體可產(chǎn)生狂犬病病毒中和抗體，抗體水平≥0.50 IU ／ mL 即可認(rèn)為達(dá)到保護(hù)性抗體水平［8］。檢測(cè)狂犬病病毒中和抗體水平的金標(biāo)準(zhǔn)是世界衛(wèi)生組織推薦的MNT 法和RFFIT 法［4，9］。MNT 法雖然為最早應(yīng)用的中和抗體檢測(cè)方法，但其變異系數(shù)大，檢測(cè)結(jié)果重復(fù)性差，而且出于動(dòng)物福利因素考慮，逐漸被FRFFIT 法取代。RFFIT 法是通過使用一定量的狂犬病病毒CVS 株與稀釋的滅活后血清混合溫育后加入敏感細(xì)胞懸液，再通過計(jì)算得出抗體效價(jià)，具有特異性好、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)［10］。但RFFIT 法在操作中需使用狂犬病病毒，須在2 級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室內(nèi)才能進(jìn)行操作，因此基層機(jī)構(gòu)較難開展，應(yīng)用范圍有限。

本研究使用ELISA 法進(jìn)行狂犬病疫苗免疫后的效果評(píng)價(jià)則可較好地規(guī)避MNT 法和RFFIT 法的缺點(diǎn)［11-12］。但ELISA 法由于使用的抗原的純度及組分不同，檢出抗體也不同，包含中和抗體在內(nèi)的所有抗狂犬病病毒抗體，因此檢測(cè)的特異性受到一定的限制。但檢測(cè)狂犬病疫苗接種者血清內(nèi)狂犬病病毒抗體一定程度也可反映狂犬病疫苗接種免疫的有效性，其在某些情況下具有一定的現(xiàn)實(shí)應(yīng)用價(jià)值，如大樣本疫苗免疫臨床試驗(yàn)初篩等［13］。ELISA 法定量檢測(cè)狂犬病病毒抗體，操作快速、簡(jiǎn)便，樣本質(zhì)量要求低，易于標(biāo)準(zhǔn)化，不依賴生物安全實(shí)驗(yàn)室［14］，更適合大規(guī)模樣本的抗體初步篩查評(píng)估。

本研究反應(yīng)模式為捕獲包被間接法，用抗狂犬病病毒單克隆抗體包被微孔板內(nèi)加入純化的狂犬病病毒顆粒后，形成固相復(fù)合抗原層，再進(jìn)行間接法檢測(cè)程序，可使非特異性反應(yīng)較大程度降低。自制試劑與RFFIT 法平行檢測(cè)對(duì)比時(shí)也體現(xiàn)出了較好的相關(guān)性，兩個(gè)不同濃度自制質(zhì)控品分析內(nèi)和分析間變異系數(shù)分別為13.9%、14.3%和11.5%、13.2%，基本符合使用要求。因此，本研究建立的ELISA 方法有望用于大規(guī)模狂犬病疫苗免疫效果的初步篩查評(píng)估。