王美皓，劉文凱 綜述，喬自林，王家敏 審校

1.西北民族大學生物醫(yī)學研究中心甘肅省動物細胞技術創(chuàng)新中心，甘肅蘭州730030；2.西北民族大學生命科學與工程學院，甘肅蘭州730030

從詹納在擠奶女工手上接種牛痘患者的膿液開始，直至20 世紀初，疫苗的來源主要為受感染的人或動物的組織，以及被感染的血清等，如從兔子、綿羊或山羊中提取的神經(jīng)組織，哺乳動物的腦等（小鼠、大鼠或兔子）。20 世紀30 年代以后，生產和制造人用、獸用疫苗主要使用雞胚培育病毒的方法，這種工藝存在許多限制，如生產周期長、操作繁瑣、工作量大、易污染等。隨著病毒對雞胚的逐漸適應，病毒抗原性發(fā)生了改變，一些疫苗種子無法在雞胚上增殖，因此，從安全性菌株的選擇到疫苗產品供應之間需要較長的時間。事實上，在大流行暴發(fā)的情況下，更具體地說，在禽流感暴發(fā)時，雞胚供應量會嚴重不足。據(jù)中國動物疫病預防控制中心報告，2020 年初，湖南省發(fā)生一起家禽H5N1 亞型高致病性禽流感疫情，養(yǎng)殖戶存欄肉雞7 850 只，發(fā)病死亡就已達到4 500 只?？梢?，傳統(tǒng)疫苗工藝不能快速響應疫情并及時有效地提供大量的疫苗劑量。

隨著時間的推移，疫苗生產工藝已經(jīng)取得了重大進展，更安全和更具免疫原性的新型疫苗生產工藝的開發(fā)，使疫苗生產商獲得了更高的產率。以細胞基質生產病毒性疫苗，對提高產品安全性以及應對日益增長的疫苗需求量和降低相關生產成本具有重要意義。

本文將重點介紹用于生產人用病毒性疫苗的細胞基質的安全性評估，為新型病毒性疫苗的上市提供細胞基質安全性評估的相關參考。

1 細胞基質在疫苗開發(fā)中的應用

為克服雞胚的限制，在疫苗生產的上游工藝中引入了細胞培養(yǎng)技術，比起傳統(tǒng)生產工藝，細胞基質的疫苗生產工藝具有更高的靈活性。細胞基質疫苗生產工藝的首次嘗試是在1954 年，SALK 等［1-2］使用原代猴腎細胞生產出脊髓灰質炎疫苗，此后一直將原代細胞作為疫苗生產的細胞基質。原代細胞直接來源于動物組織，屬于正常細胞，沒有DNA 突變及致瘤性，具有廣泛的病毒敏感性，但來源不同的原代細胞的質量及敏感性存在差異，且自我增殖能力有限，細胞培養(yǎng)條件嚴苛，獲得的疫苗可能存在潛在的病毒等外源因子的污染問題。因此，基于疫苗安全性的考慮，原代細胞并不作為細胞庫存儲或者僅在一定程度上有限存儲，這都促使生產商積極開發(fā)出更適用于疫苗生產的細胞基質。

細胞基質疫苗生產工藝的第二次變革是從原代細胞中獲得連續(xù)細胞系，即二倍體細胞系和傳代細胞系。如人肺來源的MRC-5 和WI-38 細胞［3-4］，是從原代細胞中獲得的二倍體細胞系，具有正常或接近正常的核型，與原代細胞相比，可通過鑒定建立細胞種子庫進行系統(tǒng)化生產，以保證疫苗生產過程的可控性以及疫苗產品的穩(wěn)定性。但生產過程難以規(guī)模化，對培養(yǎng)液以及血清營養(yǎng)成分的高要求，增加了外源物污染的風險，給疫苗的安全性帶來了挑戰(zhàn)，且這類細胞增殖能力有限，最終會出現(xiàn)衰老和凋亡。不同于二倍體細胞系，傳代細胞系具有無限的自我增殖能力，可以適應現(xiàn)代培養(yǎng)技術，能夠通過生物反應器進行高密度大規(guī)模生產，如MDCK 細胞和Vero 細胞等［5-6］，但隨著細胞的多次傳代，遺傳修飾可能發(fā)生改變，導致細胞出現(xiàn)致瘤性的表型。如在代次高的Vero 細胞系（P162）顯示出遺傳的不穩(wěn)定性，并表現(xiàn)出發(fā)展成為腫瘤的可能性。因此，僅有低傳代的非致瘤性細胞才可以用于疫苗生產，但由于這類細胞的廣泛使用，種子庫存正在減少。

面對傳代細胞系存在的限制，生產商結合基因工程、克隆等分子技術，探索性的建立了專有細胞系，迎來了疫苗生產工藝的第三次飛躍［7］。目前這類細胞系已經(jīng)作為新型細胞基質應用于特定的生產工藝中，為滿足生物制品的監(jiān)管及安全性的要求已被廣泛表征。如基因治療中腺病毒的生產（PER.C6?細胞系）或流感疫苗的生產等［8］。見表1［9］。

2 生物制品的監(jiān)管

自第一代疫苗生產以來，監(jiān)管部門以及公共衛(wèi)生當局監(jiān)察的重點一直是細胞成分和可能存在的外源因子，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些重要的污染來源［10］。如20 世紀60 年代用于生產脊髓灰質炎疫苗的猴腎細胞中發(fā)現(xiàn)了猴病毒（SV40）；20 世紀70 年代早期輪狀病毒疫苗（Rotarix?和RotaTeq?）中檢測出豬圓環(huán)病毒序列等［11］。

表1 常見生產用疫苗的細胞基質Tab.1 Common cell substrates for vaccine production

科學技術的進步以及分析方法的完善，已經(jīng)能夠證明存在以前未知或無法檢測到的污染物，監(jiān)管部門也開始實施新的生產和控制策略，并將其指定為指導疫苗生產的藥典。藥典中詳細說明疫苗生產的原材料和起始材料的選擇及表征、中間產品和最終產品的控制以及生產過程的設計和驗證，現(xiàn)已涉及到疫苗用細胞基質的相關問題，如這類細胞基質通常表現(xiàn)出的致瘤性和成瘤性等。通過定期修訂，藥典為生產商提供了關于疫苗生產用細胞基質的選擇、表征和維護等要求［12］。

首先，生產病毒性疫苗的細胞基質必須具有良好的特征，符合預期的目的，且經(jīng)過仔細的記錄。對于所有類型的細胞，根據(jù)生產規(guī)范（GMP）和細胞培養(yǎng)規(guī)范（GCCP）［13］的一般原則，需要制備主細胞庫（MCB）和工作細胞庫（WCB），此方案可確保細胞的可靠性和一致性，以及用于生產之前的安全檢測。細胞庫適合儲存在長期穩(wěn)定的環(huán)境中，如液氮或超低溫冰箱，并需要定期進行檢測，以此保證其表型和基因型的穩(wěn)定性。

其次，為了保證疫苗制品的安全性，生產商根據(jù)國家監(jiān)管當局的規(guī)定以及細胞的特性，規(guī)定了用于疫苗生產的細胞檢測程序，包括來源、穩(wěn)定性和增殖性、無菌性以及病毒性的分析等。如核型、同工酶圖譜、DNA、生長速率、特定染色體或表面標記等；其中非病毒劑的檢測有細菌、真菌、支原體和分枝桿菌等；病毒劑的檢測有血凝試驗、在不同細胞系中觀察細胞病變、物種的體內試驗等；逆轉錄病毒檢測有透射電子顯微鏡（TEM）和生產逆轉錄病毒（PERT）試驗等［14］。此外，必須建立標準操作規(guī)程，以降低細胞基質與供體分離后，在細胞基質上進行適應、工程或克隆時外源物污染的風險。人或動物來源的原材料，必須針對潛在污染物進行徹底的記錄和分析。建議對來源物種或衍生過程中使用的原材料中的病毒進行化驗，如使用化學誘導劑方法檢測潛伏病毒（DNA 病毒和內源性逆轉錄病毒）是否存在［15］。

很多安全性疫苗是由原代細胞和二倍體細胞為基質生產的，監(jiān)管部門已認定這類細胞的殘余DNA無危險性，即使用該細胞基質生產疫苗不存在致瘤性的潛在危險，反觀傳代細胞，因為調控生長的基因失調才具備了無限增殖的能力，因此理論上認為傳代細胞系的DNA 具有使其他細胞生長失控以及產生致瘤性的潛在能力。細胞基質的致瘤性表型可在至少4 個月的觀察中通過評估在107、105、103和101cells／animal 的劑量下腫瘤形成的動力學來定義，評估的參數(shù)包括50%動物的腫瘤產生劑量（TPD50）、腫瘤發(fā)展所需的時間和形成轉移的能力等。目前的理解是，較低的TPD50（101～ 104cells ／ animal 時形成腫瘤的能力，包括HeLa 細胞）與腫瘤的誘導發(fā)生具有相關性［16］。鑒于隨著細胞代次增加，致瘤性概率的相對提高，必須對所有的二倍體細胞系（特征良好的MRC-5 和WI-38 除外）和傳代細胞系進行致瘤性評估。

致瘤性細胞是指將完整的細胞注射至遺傳免疫缺陷動物后，具有形成腫瘤能力的細胞。使用細胞基質生產疫苗需要進行細胞的致瘤性評估，即必須將細胞DNA（≥100 g）和細胞裂解物（從107個細胞中獲得）注射至新生裸鼠、新生倉鼠或新生大鼠中，在至少4 個月的時間內對動物進行檢查，尋找形成的結節(jié)。在觀察期結束時，人道處死動物并檢查注射部位結節(jié)形成情況及病灶轉移情況。

自20 世紀90 年代以來，使用永生化細胞系生產病毒性疫苗是人們一直在討論的課題［17］。與細胞基質致瘤性相關的主要為誘導同種異體腫瘤移植、轉移已知或者未知的病毒以及轉移可能引發(fā)腫瘤的致癌劑或細胞成分等。目前監(jiān)管部門認為，制造疫苗的首要安全問題是致瘤細胞系或來源于腫瘤的細胞系中的細胞DNA 和外源因子。因此，需要在生產過程中對細胞基質中的外源因子及細胞DNA進行清除。

3 生 產

生產過程中細胞基質的選擇對疫苗制品的安全性以及穩(wěn)定性均有很大的影響。由于部分細胞基質有可能本身攜帶內源性病毒或外界污染的病毒，若無法保證生產過程的絕對安全，通過細胞基質生產的疫苗也會含有污染的病毒，這直接影響疫苗制品的安全性。細胞基質的敏感性直接影響疫苗生產的產量，只有進行規(guī)模化的穩(wěn)定生產，才能保證使用該細胞基質生產的疫苗能夠真正起到預防傳染性疾病的作用。因此，細胞基質的敏感性評價不僅要監(jiān)控病毒在細胞基質上適應的全過程，更要評估疫苗制品生產的可行性。此外，在細胞培養(yǎng)的過程中，應盡可能接種少量的病毒，但盡可能多的收獲病毒液，同時為了在降低成本的前提下達到高生產性能，必須考慮以下幾個方面。

3.1 用于病毒生產的細胞基質的培養(yǎng) 許多疫苗生產工藝均是在轉瓶或者細胞工廠中培養(yǎng)貼壁細胞系進行的。由于成本、占用樓層和勞動力等限制，這些技術無法擴大培養(yǎng)［18］。雖然，固定床表面系統(tǒng)等新的替代方案有稍許改進［19-20］，但貼壁細胞大規(guī)模生產主要是依靠攪拌式生物反應器中的微載體系統(tǒng)。在這個控制良好的懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)中，隨著微載體表面積與生物反應器體積的增加，細胞得以擴大培養(yǎng)，并且操作簡單，勞動強度低。然而，微載體細胞培養(yǎng)系統(tǒng)仍然是一個具有挑戰(zhàn)性的技術，即在擴大培養(yǎng)的過程中伴隨著昂貴和繁瑣的細胞分離操作［21］。因此，隨著科技的進步，開發(fā)出MDCK、PER.C6?、EB66?或AGE1.CR?等懸浮細胞系，能夠實現(xiàn)無微載體培養(yǎng)，有效解決貼壁細胞培養(yǎng)中面臨的許多安全性問題，提高細胞培養(yǎng)過程中的成本效益、可操作性及安全性［22］。如2012 年Novartis 公司利用懸浮MDCK細胞大規(guī)模生產流感疫苗Optaflu ／Flucelvax（三價），該疫苗在歐盟及美國已獲準上市。同年，MedImmune公司以懸浮MDCK 細胞大規(guī)模生產流感疫苗Flumist（四價），已在美國獲準上市。

每種細胞基質均有其自身的自然屬性和特性，包括細胞的營養(yǎng)需求、代謝控制、剪切敏感性、需氧量、遺傳穩(wěn)定性、代謝副產物、最佳溫度、pH 值、滲透壓等。因此，培養(yǎng)基的優(yōu)化在整個工藝流程中起著至關重要的作用，其不僅可確保細胞的高密度生長，還能夠提高病毒的產毒量。疫苗生產的培養(yǎng)基中大多含有胎牛血清（FBS），F(xiàn)BS 存在批間差，經(jīng)常導致生產工藝的不穩(wěn)定［23］，并且FBS 作為外源因子，導致疫苗制品存在較大的安全性隱患，這就促使生產商將培養(yǎng)基的優(yōu)化方向轉為無動物成分的細胞培養(yǎng)基和細胞特異性培養(yǎng)基的開發(fā)及生產［24-26］。通常情況下，培養(yǎng)基的開發(fā)和生產會外包給專門的培養(yǎng)基供應商，而培養(yǎng)基供應商的目標則是選擇出達到生產力目標、符合GMP 的質量和監(jiān)管要求的最佳培養(yǎng)基配方，在保證安全性的前提下滿足疫苗生產過程中對培養(yǎng)基的需求。

3.2 病毒純化 經(jīng)過生產商的不斷探索，病毒在細胞基質上的產量得到了顯著提高。相比之下，由于嚴格的監(jiān)管規(guī)則，病毒回收率通常較低，且生產過程中存在的細胞殘留蛋白屬于異源蛋白，很可能會引發(fā)機體的過敏反應，在使用傳代細胞生產疫苗時，應進行分離純化，盡可能去除異源蛋白，并進行純化工藝的驗證，以保證疫苗制品的安全性。

細胞基質用于疫苗生產，必須考慮到病毒與其他可傳播因子、細胞DNA 和促生長蛋白等對疫苗安全性帶來的影響。但目前對異源蛋白的檢測手段仍不完善，仍以疫苗的蛋白總量進行間接質控。事實上，許多純化步驟是必要的，從細胞裂解，通過宏觀和微過濾去除細胞碎片，濃縮和酶解，層析或區(qū)帶離心純化，再到使用納濾殺菌。為了符合藥典要求，對需純化的物質的分析必須包括無菌、產品特性和效力，以及生產過程殘留物的定量，如牛血清白蛋白、抗生素、苯甲酶、HCD 和蛋白質等。然而這種操作過程不僅引發(fā)病毒顆粒的重大損失，且占主要的生產成本消耗［27-28］。為了獲得更高的病毒產率，生產商不斷嘗試新的純化技術。目前，病毒產率已經(jīng)成為疫苗生產領域技術訣竅中非常重要的一部分。

4 展 望

生物制品的質量控制不僅指對最終產品的質量控制，更包括對整個生產過程的質量控制，包括原材料、中間產品、最終產品及生產過程的質量控制等。細胞基質作為疫苗生產的主要原材料，其質量的優(yōu)劣直接影響疫苗的質量和產量以及疫苗的安全性。細胞基質生產疫苗時，焦點在于可能存在的外源因子污染和某些情況下細胞本身的特性，以及細胞培養(yǎng)中各個環(huán)節(jié)的操作。這些均推動疫苗行業(yè)在保證安全性的前提下，向更高的反應性、靈活性和降低運營成本的方向發(fā)展，以確保經(jīng)濟的可持續(xù)性。怎樣以一種較智能的方式生產疫苗，同時保持對生產高質量產品的堅定承諾［29］，這是新時代疫苗生產工藝面臨的巨大挑戰(zhàn)。

目前，疫苗生產中的相關設施可以快速地建立和調試，使用模塊化設施替代運營復雜、成本高昂、產品周期長的不銹鋼設施，相對地減少資本和運營支出［30］，這些改進使得各種生物制品在給定空間內生產成為可能。整合上游和下游的全連續(xù)加工模式，預計將提供比傳統(tǒng)批量生產戰(zhàn)略更高的效益。這種能夠快速高效且以低成本運營的生產工藝，由于培養(yǎng)基營養(yǎng)始終保持恒定，有毒副產品被有效排放，工藝之間無停頓，可以提供更高的產品收獲率，并且能夠更好地解決疫苗生產過程中存在的安全性隱患。

隨著行業(yè)中疫苗生產的趨勢從以雞胚為基礎的傳統(tǒng)生產工藝轉向以細胞基質為基礎的疫苗生產工藝，但鑒于目前仍然僅有相對較少數(shù)量的細胞基質這一事實，建立和驗證新的疫苗用細胞基質引起了生產商的關注。因此，安全細胞基質的多樣性保證了現(xiàn)在和未來的高標準疫苗供應。

綜上所述，疫苗用細胞基質的理想特征是其應該對多數(shù)病毒敏感，能夠在短時間內無限增殖到高細胞密度，并易于放大，能夠達到較高的安全性評估標準。此外，由于細胞基質是疫苗制品的重要組成部分，因此必須根據(jù)許多不斷完善的安全性和法規(guī)要求對其進行廣泛表征，在選擇開發(fā)新疫苗的細胞基質前，要多方面考慮。需要強調的是，當前沒有任何細胞基質滿足所有的標準，僅能在保證疫苗安全性的前提下考慮和評價不同的細胞基質，為每個新疫苗選擇最優(yōu)的細胞基質。