徐瀟，石繼春，王春娥，李康，黃洋，李江姣，梁麗，陳馳，葉強(qiáng)

中國(guó)食品藥品檢定研究院 中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心，北京102629

鮑氏不動(dòng)桿菌（Acinetobacter baumannii）是革蘭陰性非發(fā)酵菌，在自然界和醫(yī)院環(huán)境中廣泛存在，為條件致病菌，主要感染抵抗力較低的個(gè)體，易在住院患者皮膚、口腔、呼吸道及泌尿生殖道等部位定植，是院內(nèi)感染的重要病原菌之一［1］，可引起醫(yī)院獲得性肺炎、燒傷感染、傷口感染等疾病，特別是呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎、腦膜炎、菌血癥等。鮑氏不動(dòng)桿菌在醫(yī)院環(huán)境中可長(zhǎng)期存活，對(duì)危重患者和ICU 中的患者威脅較大。據(jù)報(bào)道，ICU 患者的鮑氏不動(dòng)桿菌感染率明顯高于其他科室，尤其是下呼吸道感染［2］。同時(shí)，鮑氏不動(dòng)桿菌還具有快速建立耐藥的能力，其耐藥性日益提高，特別是多重耐藥菌的增多，甚至出現(xiàn)了對(duì)目前抗菌藥物均耐藥的全耐藥鮑氏不動(dòng)桿菌［3-6］。根據(jù)2018 年中國(guó)細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)網(wǎng)數(shù)據(jù)顯示，鮑氏不動(dòng)桿菌占臨床分離革蘭陰性菌的13.41%，僅次于大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌，且對(duì)亞胺培南和美羅培南的耐藥率從2005 — 2018 年呈快速上升趨勢(shì)，達(dá)73.2%和73.9%，嚴(yán)重影響患者的預(yù)后，已成為最難以治療和控制的院內(nèi)獲得性感染病原菌［7-8］。

臨床采用細(xì)菌培養(yǎng)和基于生化反應(yīng)來(lái)鑒定細(xì)菌的傳統(tǒng)方法是診斷細(xì)菌感染的公認(rèn)方法［3］，但其培養(yǎng)細(xì)菌時(shí)間較長(zhǎng)，且易受接種時(shí)間和方法等因素影響，較難達(dá)到對(duì)感染早期診斷的目的，不能滿足臨床診斷需求［9-10］。鮑氏不動(dòng)桿菌易于感染，尤其對(duì)ICU患者的危害較大，因此，快速、準(zhǔn)確的診斷將有助于重癥患者的及時(shí)治療。核酸診斷技術(shù)速度快、靈敏性和特異性好，能夠更早期地發(fā)現(xiàn)突發(fā)感染。目前，基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR 的核酸檢測(cè)法可用于鮑氏不動(dòng)桿菌檢測(cè)，但尚無(wú)相關(guān)國(guó)家參考品供企業(yè)對(duì)其研發(fā)的試劑盒進(jìn)行質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)。參考品是診斷試劑審評(píng)審批的重要依據(jù)，不同企業(yè)的產(chǎn)品采用同一標(biāo)準(zhǔn)衡量，將有利于行業(yè)水平的整體提升［11-13］。因此，本研究研制了鮑氏不動(dòng)桿菌核酸檢測(cè)試劑盒國(guó)家參考品，以期為相關(guān)企業(yè)提供試劑盒質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)參考品，提升診斷試劑的質(zhì)量。

1 材料與方法

1.1 菌株 從中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心（National Center for Medical Culture Collections，CMCC）標(biāo)準(zhǔn)菌株庫(kù)中選擇10 株鮑氏不動(dòng)桿菌（Acinetobacterbaumannii）作為陽(yáng)性參考菌株，菌種編號(hào)分別為CMCC（B）25012、CMCC（B）25014、CMCC（B）25006、CMCC（B）25019、CMCC（B）25020、CMCC（B）25022、CMCC（B）25047、CMCC（B）25105、CMCC（B）25141 及CMCC（B）25154；從CMCC 標(biāo)準(zhǔn)菌株庫(kù)中選擇同屬不同種的不動(dòng)桿菌及與鮑氏不動(dòng)桿菌感染部位相同或感染癥狀相似且常見(jiàn)的其他病原菌（共10 株）作為陰性參考菌株，包括魯氏不動(dòng)桿菌（Acinetobacter lwoffii）、瓊式不動(dòng)桿菌（Acinetobacter junii）、溶血不動(dòng)桿菌（Acinetobacter haemolyticus）、嗜肺軍團(tuán)菌（Legionella pneumophila）、肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae）、腦膜炎奈瑟菌（Neisseria meningitidis）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）、大腸埃希菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa），菌種編號(hào)分別為CMCC（B）25202、CMCC（B）25150、CMCC（B）25046、CMCC（B）60001、CMCC（B）31001、CMCC（B）29052、CMCC（B）46117、CMCC（B）44113、CMCC（B）26001、CMCC（B）10104。

1.2 主要試劑及儀器 胰蛋白胨大豆培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基及哥倫比亞血瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)BD公司；BCYE 瓊脂基礎(chǔ)及配套添加劑購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司；無(wú)菌脫纖維羊血購(gòu)自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；中國(guó)細(xì)菌濁度標(biāo)準(zhǔn)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；API 20NE 及配套試劑、VITEK GN 和GP 鑒定卡購(gòu)自梅里埃診斷產(chǎn)品（上海）有限公司；DNeasy Blood & Tissue Kit 及蛋白酶K購(gòu)自德國(guó)QIAGEN 公司；溶菌酶購(gòu)自美國(guó)AMRESCO公司；Taq 酶及DNA marker DL2000 購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；GelRed 染色液購(gòu)自北京科奧明生物技術(shù)有限公司；鮑曼不動(dòng)桿菌核酸測(cè)定試劑盒（熒光PCR 法）購(gòu)自上海之江生物科技股份有限公司（廠家1）及江蘇碩世生物科技股份有限公司（廠家2）；VITEK 全自動(dòng)生化鑒定儀購(gòu)自梅里埃診斷產(chǎn)品（上海）有限公司。

1.3 參考菌株的復(fù)蘇及鑒定

1.3.1 參考菌株的復(fù)蘇 不動(dòng)桿菌、肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌采用胰蛋白胨大豆培養(yǎng)基，于（37±1）℃培養(yǎng)18～24 h；嗜肺軍團(tuán)菌采用BCYE 培養(yǎng)基，于（37 ± 1）℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h；肺炎鏈球菌采用哥倫比亞血平板，于（37±1）℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24 h；腦膜炎奈瑟菌采用GC 培養(yǎng)基，于（37±1）℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 ～ 24 h。各菌株按上述條件進(jìn)行復(fù)蘇、傳代。

1.3.2 參考菌株的鑒定 對(duì)第2 代培養(yǎng)物進(jìn)行生化鑒定和16S rRNA 基因序列分析。不動(dòng)桿菌采用API 20NE 進(jìn)行生化鑒定，其他菌株采用VITEK 全自動(dòng)生化鑒定儀鑒定。16S rRNA 基因序列分析采用DNeasy Blood&Tissue Kit 提取第2 代培養(yǎng)物DNA，采用通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGYTACCTTGTTACGACTT-3′）進(jìn)行PCR擴(kuò)增［14-16］，引物由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。PCR 產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行Sanger 雙向測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果導(dǎo)入BioNumerics軟件（7.6 版）進(jìn)行拼接處理，并于NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST 序列比對(duì)。

1.4 參考品的制備 取第2 代過(guò)夜培養(yǎng)物，液體培養(yǎng)物經(jīng)7 656 ×g離心10 min，棄上清，滅菌生理鹽水洗滌3 次，用滅菌生理鹽水重懸；固體培養(yǎng)物刮至生理鹽水中，制成菌懸液。采用中國(guó)細(xì)菌濁度標(biāo)準(zhǔn)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行定量，無(wú)中國(guó)細(xì)菌濁度標(biāo)準(zhǔn)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品的細(xì)菌采用平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行計(jì)數(shù)，將腦膜炎奈瑟菌CMCC（B）29052 及銅綠假單胞菌CMCC（B）10104 菌液濃度分別調(diào)至1.0 × 106和5.0 × 106個(gè)／ mL，其他18 株參考品菌液濃度均調(diào)至1.0 × 107個(gè)／ mL。將參考品菌液置60 ℃滅活60 min，不同菌株使用其適宜的培養(yǎng)基進(jìn)行接種培養(yǎng)，驗(yàn)證滅活效果。

1.4.1 陽(yáng)性參考品 用滅菌生理鹽水稀釋10 株陽(yáng)性參考品菌液，按0.5 mL／支分裝，標(biāo)記為P1 ～P10。

1.4.2 陰性參考品 用滅菌生理鹽水稀釋10 株陰性參考品菌液，按0.5 mL／支分裝，標(biāo)記為N1 ～N10。

1.4.3 最低檢出限參考品及重復(fù)性參考品 選擇CMCC（B）25012 鮑氏不動(dòng)桿菌作為最低檢出限參考品和重復(fù)性參考品，用滅菌生理鹽水將菌液稀釋，按0.8 mL／支分裝，分別標(biāo)記為最低檢出限參考品和重復(fù)性參考品。

1.5 參考品的均勻性評(píng)估 分別隨機(jī)抽取P1 ～P10陽(yáng)性參考品、最低檢出限參考品各10 支，重復(fù)性參考品15 支，用滅菌生理鹽水分別進(jìn)行10 倍稀釋，采用廠家1 生產(chǎn)的鮑曼不動(dòng)桿菌核酸測(cè)定試劑盒（熒光PCR 法）進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果應(yīng)均為陽(yáng)性，且每株參考品均勻性的變異系數(shù)（CV）應(yīng)≤5.0%。

1.6 參考品的穩(wěn)定性評(píng)估 將P1 ～P10 陽(yáng)性參考品、最低檢出限參考品分別于2 ～8、25、37 ℃放置3、7、14 d，同時(shí)，分別反復(fù)凍融3 和5 次，均以-20 ℃保存的參考品作為對(duì)照。陽(yáng)性參考品（P1 ～P10）用滅菌生理鹽水進(jìn)行10 倍稀釋；最低檢出限參考品用滅菌生理鹽水進(jìn)行10 倍系列稀釋，取1.0 × 106、1.0 × 105、1.0 × 104、1.0 × 103個(gè)／ mL 菌液，采用廠家1 生產(chǎn)的鮑曼不動(dòng)桿菌核酸測(cè)定試劑盒（熒光PCR 法）進(jìn)行檢測(cè)，考察參考品于不同溫度下放置不同時(shí)間及反復(fù)凍融的穩(wěn)定性。

1.7 參考品的驗(yàn)證

1.7.1 準(zhǔn)確性 將陽(yáng)性參考品（P1 ～P10）分用滅菌生理鹽水進(jìn)行10 倍稀釋，分別采用廠家1 和廠家2 生產(chǎn)的鮑曼不動(dòng)桿菌核酸檢測(cè)試劑盒（熒光PCR 法）進(jìn)行檢測(cè)，每份樣本平行檢測(cè)2 次。每個(gè)試劑盒進(jìn)行2 次獨(dú)立試驗(yàn)，驗(yàn)證參考品的準(zhǔn)確性。

1.7.2 特異性 將陰性參考品（N1 ～N10）用滅菌生理鹽水進(jìn)行10 倍稀釋，分別采用廠家1 和廠家2生產(chǎn)的鮑曼不動(dòng)桿菌核酸檢測(cè)試劑盒（熒光PCR 法）進(jìn)行檢測(cè)，每份樣本平行檢測(cè)2 次。每個(gè)試劑盒進(jìn)行2 次獨(dú)立試驗(yàn)。

1.7.3 重復(fù)性 將重復(fù)性參考品（10 支）用滅菌生理鹽水進(jìn)行10 倍稀釋，分別用廠家1 和廠家2 生產(chǎn)的鮑曼不動(dòng)桿菌核酸檢測(cè)試劑盒（熒光PCR 法）進(jìn)行檢測(cè)，每份樣本平行檢測(cè)2 次，重復(fù)檢測(cè)10 次。每個(gè)試劑盒進(jìn)行2 次獨(dú)立試驗(yàn)，計(jì)算CV。

1.7.4 最低檢出限 取最低檢出限參考品（1.0 ×107個(gè)／ mL），用滅菌生理鹽水進(jìn)行10 倍系列稀釋，取1.0×105、1.0×104、1.0×103、1.0 × 102個(gè)／ mL 菌液，分別采用廠家1 和廠家2 生產(chǎn)的鮑曼不動(dòng)桿菌核酸檢測(cè)試劑盒（熒光PCR 法）進(jìn)行檢測(cè)，每份樣本平行檢測(cè)2 次。每個(gè)試劑盒進(jìn)行2 次獨(dú)立試驗(yàn)。

1.8 參考品的協(xié)作標(biāo)定 共選擇7 家實(shí)驗(yàn)室（編號(hào)為A ～G）參加協(xié)作標(biāo)定，參照1.7 項(xiàng)方法采用各自實(shí)驗(yàn)室研發(fā)的診斷試劑對(duì)參考品進(jìn)行驗(yàn)證，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行匯總分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，穩(wěn)定性結(jié)果采用單因素方差分析，組間比較采用方差分析，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 參考菌株的鑒定

2.1.1 生化鑒定 10 株不動(dòng)桿菌及10 株其他菌株生化鑒定結(jié)果均符合相應(yīng)菌株特性。

2.1.2 16S rRNA 基因序列分析 10 株不動(dòng)桿菌及10 株其他菌株的序列分析結(jié)果符合每株參考菌株的種屬特征，見(jiàn)表1。

2.2 參考品的滅活效果 全部參考品原菌液滅活驗(yàn)證平板均無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，表明參考品原菌液已成功滅活。

2.3 參考品的均勻性 陽(yáng)性參考品、最低檢出限參考品和重復(fù)性參考品Ct值的CV均＜2.5%，見(jiàn)表2。表明參考品的分裝均勻度良好。

表1 16S rRNA 基因比對(duì)結(jié)果Tab.1 Alignment of homology of 16S rRNA gene sequence

表2 參考品分裝均勻性驗(yàn)證結(jié)果（Ct 值）Tab.2 Uniformity of reference materials（Ct value）

2.4 參考品的穩(wěn)定性

2.4.1 凍融穩(wěn)定性 與-20 ℃保存的參考品比較，制備的參考品經(jīng)反復(fù)凍融3 和5 次的Ct值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F分別為0.045 和0.011，P分別為0.833和0.918），見(jiàn)圖1。表明制備的參考品具有較好的凍融穩(wěn)定性。

圖1 反復(fù)凍融對(duì)參考品穩(wěn)定性的影響Fig.1 Stability of reference materials after repeat freezing and thawing

2.4.2 加速穩(wěn)定性 與-20 ℃保存的參考品比較，分別于2 ～8、25、37 ℃放置3、7、14 d 的參考品Ct值差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F為0.315 ～2.303，P=0.141 ～0.579），見(jiàn)圖2。表明制備的參考品具有較好的加速穩(wěn)定性，可滿足運(yùn)輸、使用等穩(wěn)定性要求。

2.5 參考品的驗(yàn)證

2.5.1 準(zhǔn)確性 兩種試劑盒檢測(cè)陽(yáng)性參考品（P1 ～P10）稀釋液的結(jié)果均為陽(yáng)性，具體檢測(cè)結(jié)果略。

2.5.2 特異性 兩種試劑盒檢測(cè)陰性參考品（N1 ～N10）稀釋液的結(jié)果均為陰性，具體檢測(cè)結(jié)果略。

2.5.3 重復(fù)性 兩種試劑盒檢測(cè)10 支重復(fù)性參考品的稀釋液，每種試劑盒2 次獨(dú)立試驗(yàn)的CV為0.87%～2.13%，均＜2.5%，見(jiàn)表3。

圖2 保存溫度及保存時(shí)間對(duì)參考品穩(wěn)定性的影響Fig.2 Stability of reference materials after storage at various temperatures for various days

2.5.4 最低檢出限 兩種試劑盒對(duì)最低檢出限參考品進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證試劑盒的最低檢出限為1.0 ×103個(gè)／ mL。

2.6 參考品的協(xié)作標(biāo)定 7 家參加協(xié)作標(biāo)定的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)陽(yáng)性參考品符合率均符合要求；除D 實(shí)驗(yàn)室將3 個(gè)陰性參考品（為鮑氏不動(dòng)桿菌同屬不同種的干擾菌株）檢測(cè)為陽(yáng)性外，其他6 家實(shí)驗(yàn)室的陰性參考品符合率均符合要求；各實(shí)驗(yàn)室重復(fù)性參考品檢測(cè)結(jié)果Ct值的CV均在5.0%以內(nèi)；A、B、C、E 實(shí)驗(yàn)室的最低檢出限結(jié)果均為1 × 103個(gè)／ mL，D 和G實(shí)驗(yàn)室的最低檢出限結(jié)果為1 × 102個(gè)／ mL，F(xiàn) 實(shí)驗(yàn)室的最低檢出限為1 × 104個(gè)／ mL。見(jiàn)表4。

表3 重復(fù)性驗(yàn)證結(jié)果（Ct 值）Tab.3 Verification for reproducibility（Ct value）

表4 協(xié)作標(biāo)定結(jié)果Tab.4 Results of collaborative calibration

3 討 論

核酸檢測(cè)試劑國(guó)家參考品對(duì)核酸快速診斷試劑盒的質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)至關(guān)重要，是相關(guān)產(chǎn)品注冊(cè)檢驗(yàn)、上市審批的重要基礎(chǔ)［17-20］。因此，本研究制備了鮑氏不動(dòng)桿菌核酸檢測(cè)試劑盒國(guó)家參考品。選擇20株經(jīng)鑒定、且具有代表性的病原菌作為參考品菌株，10 株陽(yáng)性參考品菌株均為鮑氏不動(dòng)桿菌；10 株陰性參考品菌株的選擇，充分考慮了與鮑氏不動(dòng)桿菌感染部位相同或感染癥狀相似且常見(jiàn)的其他病原體，以及同屬不同種的干擾菌株，包括魯氏不動(dòng)桿菌、瓊氏不動(dòng)桿菌、溶血不動(dòng)桿菌等。

本研究對(duì)分裝后參考品均勻性進(jìn)行評(píng)估［21-22］，結(jié)果顯示，陽(yáng)性參考品、最低檢出限參考品和重復(fù)性參考品Ct值的CV均＜2.5%，表明參考品分裝后均具有良好的均勻度?？紤]到參考品在運(yùn)輸、分發(fā)、使用過(guò)程中，存在反復(fù)凍融、保存溫度變化等風(fēng)險(xiǎn)，且參考品的穩(wěn)定性將直接影響相關(guān)試劑對(duì)結(jié)果的判斷，本研究對(duì)參考品進(jìn)行了穩(wěn)定性評(píng)估。結(jié)果表明，與-20 ℃保存的對(duì)照參考品比較，在參考品菌株于2 ～8、25、37 ℃分別放置3、7、14 d 后，以及凍融3、5次后，均具有較好的穩(wěn)定性，可滿足運(yùn)輸及正常的使用要求。最低檢出限是評(píng)價(jià)診斷試劑檢測(cè)能力的重要指標(biāo)，是評(píng)價(jià)診斷試劑檢測(cè)下限的依據(jù)［23］，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，最低檢出限為1 × 103個(gè)／ mL。重復(fù)性參考品用來(lái)評(píng)價(jià)診斷試劑重復(fù)檢測(cè)的穩(wěn)定性［23］，本研究制備的重復(fù)性參考品結(jié)果的CV均＜2.5%，顯示穩(wěn)定性良好。

本實(shí)驗(yàn)邀請(qǐng)了7 家不同實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展了協(xié)作標(biāo)定，全面評(píng)估了鮑氏不動(dòng)桿菌核酸檢測(cè)試劑盒國(guó)家參考品的質(zhì)量。其中，D 實(shí)驗(yàn)室在特異性驗(yàn)證時(shí)，未能區(qū)分鮑氏不動(dòng)桿菌同屬不同種的菌株，表明本研究選擇的陰性參考品能夠?qū)σ恍┰\斷試劑進(jìn)行有效干擾。F 實(shí)驗(yàn)室的最低檢出限結(jié)果為1 × 104個(gè)／ mL，低于其他實(shí)驗(yàn)室的最低檢出限，表明其診斷試劑盒的靈敏度相對(duì)較低，而D 和G 實(shí)驗(yàn)室的最低檢出限結(jié)果為1×102個(gè)／mL，高于其他實(shí)驗(yàn)室，D 實(shí)驗(yàn)室的診斷試劑盒出現(xiàn)假陽(yáng)性的情況，表明其特異性較差。上述結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)制備的參考品可用于鮑氏不動(dòng)桿菌核酸檢測(cè)試劑盒的質(zhì)量評(píng)價(jià)。